穆坎代斯·吐爾迪 夏宇（通訊作者）考吾沙爾·巴合提江 王萌萌

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 新疆烏魯木齊 830011）

從全世界范圍來看，癌癥死亡人數(shù)中占比最大的當數(shù)肺癌，根據(jù)GLOBOCAN（全球癌癥流行病學的數(shù)據(jù)庫）2020 年數(shù)據(jù)顯示，新增肺癌患者高達220萬例（占癌癥患者總數(shù)的11.4%），死于肺癌的人數(shù)高達179 萬例（占癌癥總死亡人數(shù)的18.0%）。采用低劑量計算機斷層掃描（LDCT）對肺癌患者進行初步篩查能夠提高肺癌的診斷率，從而提高肺癌患者生存率。但是LDCT 的靈敏度高而特異性低容易造成誤診，因此通過LDCT 檢測結果異常的患者需完善其他檢查以進一步確認。因此，仍需尋找簡便易行、靈敏度和特異性好的無創(chuàng)手段對肺癌進行早期診斷[1]。

由于DNA 甲基化與人類發(fā)育和腫瘤疾病密切相關，它是目前研究最透徹、最廣泛的表觀遺傳學的現(xiàn)象之一。DNA 甲基化往往在腫瘤發(fā)病的早期甚至癌前病變時就已經發(fā)生，因此DNA 甲基化的異常改變或可成為用于肺癌早期診斷的生物標記物。為此本文主要就肺組織、外周血、肺泡灌洗液等標本當中DNA 甲基化檢測與肺癌早期診斷的研究進展進行綜述。

1 DNA 甲基化的定義

DNA 甲基化是一類可穩(wěn)定遺傳的表觀修飾，其參與了個體發(fā)育及細胞分化等基本生物學過程。DNA 甲基化是指在DNA 甲基化轉移酶的作用下，把甲基從通用甲基供體S- 腺苷-L- 甲硫氨酸添加到胞嘧啶的5-碳位置的一種化學修飾現(xiàn)象。這種方式能夠通過改變DNA 的穩(wěn)定性、DNA 和蛋白質的互作方式以及染色質結構來調控靶向基因的表達。多項研究表明，DNA 的異常甲基化主要表現(xiàn)為全基因組的低甲基化狀態(tài)和啟動子CpG 島的高甲基化狀態(tài)。

2 DNA 甲基化與肺癌

肺癌的發(fā)生發(fā)展涉及一系列異常的表觀遺傳變化。DNA 甲基化作為表觀遺傳的重要修飾手段之一與癌癥的發(fā)病有密切關系，是正常細胞癌變時最早發(fā)生的事件。在癌變的早期階段，不僅腫瘤細胞，甚至在非腫瘤細胞中也發(fā)生了異常的DNA 甲基化。抑癌基因失活的原因除了認為與堿基的突變和缺失有關外，另一個重要的原因被認為是其啟動子區(qū)的高度甲基化。DNA 甲基化的異常在大部分時候早于癌性病變的發(fā)生，因此DNA 甲基化對于肺癌的早期診斷具有一定的臨床意義。而且DNA 是一種非常穩(wěn)定的分子，可以從大量體液中提取，DNA 甲基化的定量越來越準確和敏感，這是有效診斷標志物的關鍵特征，故通過測定基因DNA 甲基化水平能夠為肺癌早期診斷和預后評估提供可靠的生物靶點。

3 DNA 甲基化在肺癌診斷中的應用

3.1 組織中DNA 甲基化檢測與肺癌早期診斷

組織中抑癌基因的甲基化被證實與肺癌關系密切。Yang 等人研究了非小細胞肺癌（NSCLC）患者癌組織與癌旁組織中DAPK 基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，NSCLC 組織和癌旁組織中DAPK 甲基化頻率差異有統(tǒng)計學意義，提示NSCLC 組織中DAPK 啟動子甲基化的頻率明顯高于癌旁組織。Walter RFH 等人通過對肺癌患者的組織進行DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)，L1RE1 基因表現(xiàn)為低甲基化而RASSF1 表現(xiàn)為高甲基化，因此這兩者結合可作為鑒別肺癌的生物標記物。李靖[2]收集105 位NSCLC 患者癌組織及其配對非癌組織樣本分析，基因LDHB、PFKFB3、HK3、LDHC、PKLR 啟動子的甲基化水平在配對的癌組織、癌旁組織和遠端組織間的差異，發(fā)現(xiàn)LDHC 和HK3 啟動子的甲基化水平在各組織樣品中存在差異，有可能成為NSCLC 診斷的生物標志物。Feng X 等探討了NID2 甲基化在NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的意義，NSCLC 組織中NID2 甲基化率高于NCLL 組織，提示腫瘤組織中NID2 甲基化狀態(tài)可能具有鑒定NSCLC 的潛力。

上述研究表明，組織中的甲基化檢測可以區(qū)分腫瘤組織和正常肺組織，這為甲基化檢測在肺癌早期診斷中的應用提供了理論基礎。

3.2 外周血中DNA 甲基化檢測與肺癌早期診斷

在腫瘤發(fā)生的整個病程中，位于癌細胞內的DNA 片段能夠釋放入外周循環(huán)，因此我們可以通過外周血測定DNA 甲基化的變化。Wenhai Huang 等對肺癌組的104 名患者和良性肺部疾病組的36 名患者的血漿進行了研究，發(fā)現(xiàn)SHOX2 和PTGER4都是檢測惡性結節(jié)的高度特異性標記物，但敏感性較差，并推測可能的原因是血液樣本中DNA 含量相對較少，腫瘤負荷較小。王攀等人[3]通過對肺癌患者血漿中DNA 甲基化的檢測發(fā)現(xiàn)，與健康人群和良性肺部結節(jié)患者的甲基化結果相比，肺癌患者CDO1 基因甲基化的水平顯著升高，且具有良好的診斷效能。Fujiwara K 等采用甲基化特異性PCR 方法檢測了200 例患者的血清RAR-β、p16、DAPK、RASSFlA 和MGMT 基因甲基化狀態(tài)，至少一個基因甲基化被評估為陽性時，診斷肺癌的敏感性和特異性分別為49.5%和85.0%，提示鑒定血清DNA 中抑癌基因的啟動子甲基化可能有助于肺癌的早期檢測。

抑癌基因的表觀遺傳失活對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關重要，包括RASSF1A 在內的基因在許多腫瘤中均被證實發(fā)生了甲基化改變。因此，分析血液的生物標記物要求更高，標記物需要對肺癌DNA 具有真正的特異性，以確保進行高度特異性的肺癌檢測。

3.3 支氣管肺泡灌洗液中DNA 甲基化檢測與肺癌早期診斷

支氣管肺泡灌洗液（BALF）是通過支氣管鏡對肺段或亞段水平以下支氣管及肺泡反復以無菌生理鹽水灌洗、回收所得的混合液。目前支氣管鏡檢查廣泛應用于臨床，獲取BALF 比較簡便，并且允許局部采樣，相對靠近腫瘤細胞，定位相對準確，幾乎沒有來自身體其他部位的污染，特異性較強，是肺癌生物標志物比較理想的樣本替代來源。Zeng D 等的一項研究發(fā)現(xiàn)，BALF 游離DNA（cfDNA）可以作為突變和甲基化分析的液體活檢介質，與傳統(tǒng)方法相比，在區(qū)分微小惡性腫瘤和良性結節(jié)方面具有更好的敏感性。崔超等人通過對BALF 樣本中P16 基因的DNA甲基化檢測發(fā)現(xiàn)，其對NSCLC 的診斷具有較好的敏感度和特異度，或可成為NSCLC 的診斷靶點之一。Hojoong Kim 等的研究表明，p16、RASSF1A、H-鈣黏蛋白和RARB 基因的腫瘤特異性甲基化可能是BALF 中早期發(fā)現(xiàn)NSCLC 的一個有價值的生物標記物。Schmidt B 等在總共523 例患者支氣管吸出物樣本中，用實時定量PCR 的檢測方法得出結論：SHOX2 基因甲基化能夠以高度特異性區(qū)分惡性和良性肺部疾病。

對于外周性病變，氣管鏡無法直視下取活檢的患者，采取BALF 甲基化檢查加病理學檢查有比較好的診斷準確率。

3.4 痰液中DNA 甲基化檢測與肺癌早期診斷

痰液是BALF 的優(yōu)選替代樣本，其容易通過非侵入性方法獲取，簡單方便，易被患者接受。Hubers 等研究RASSF1A、3OST2 和PRDM14 聯(lián)合檢測肺癌，結果提示痰液DNA 甲基化檢測具有早期診斷肺癌的能力，但需要補充診斷標志物來提高敏感性。彭再梅等人用甲基化特異性PCR(MSP)技術分別檢測肺癌患者和良性肺結節(jié)患者組織中甲基化的異常，結果顯示RASSFIA、p16 和DAPK 這3 個基因的啟動子區(qū)域發(fā)生了甲基化改變，或可作為肺癌診斷的有效靶標。一項薈萃分析結果顯示，p16、CDO1、ZFP42、RASSF1A、FAM19A4、TAC1、MGMT、FHI 和SOX17 的異常甲基化可作為早期肺癌篩查和診斷的生物靶標。

痰液樣本的主要缺點是肺泡細胞含量的可變性，除非患者接受過如何制備痰標本的適當培訓，否則大部分樣本可能是不充分的。有研究表明，延長痰液收集的時間可以明顯提高痰液中甲基化聯(lián)合檢測的靈敏度。

3.5 其他樣本中DNA 甲基化檢測與肺癌早期診斷

尿液已被證明是檢測不同類型癌癥（包括尿路上皮癌、結腸癌和肺癌）循環(huán)腫瘤DNA 中特定腫瘤基因突變的來源。與其他體液來源相比，尿液樣本具有自己的優(yōu)勢，它們是非侵入性、易于獲取、體積更大、易于收集的，與其他樣本相比，它們的處理限制更小，可以在室溫下儲存，DNA 含量可以比其他體液穩(wěn)定更長時間。正因為如此，尿液樣本有可能在初級醫(yī)療保健實踐中易于實施。但是尿液作為DNA 檢測樣本有其相應的限制性，尿液是血漿超濾液，只有一小部分的血漿DNA 可以被過濾到尿液中，一些甲基化的cfDNA 分子可能太小而無法檢測。盡管存在這些差異，但尿液在癌癥檢測中的效用仍有待進一步探索。

呼出氣體冷凝液（EBC）也可作為DNA 甲基化檢測的樣本，且它具有無創(chuàng)且樣本收集簡便的特點。EBC 中鑒定的化合物包括腺苷、氨、過氧化氫、異前列腺素、白三烯、氮氧化物（NOx）、肽、細胞因子、質子和各種離子。隨著微陣列技術、測序技術以及生物信息分析技術的廣泛應用，現(xiàn)如今對基因改變的識別已能夠在微小樣本（如EBC）中進行。收集EBC進行DNA 甲基化檢測更適用于無法通過有創(chuàng)或微創(chuàng)手段獲得樣本進行診斷的肺癌患者。

4 展望

雖然DNA 甲基化測序技術不斷改進，DNA 甲基化的檢測樣本來源從組織細胞、肺泡灌洗液、痰液、血液發(fā)展到呼出氣冷凝液等，但各種檢測樣本和檢測技術均有各自的優(yōu)劣，暫無系統(tǒng)的標準化檢測方案，仍然需要檢測技術的不斷進步予以彌補，使其更好地應用于臨床。開發(fā)高靈敏度的表觀遺傳學生物標記物，用于有限數(shù)量的組織，并以非侵入性方式獲得標本將是未來工作的重點。