朱 靜,張志東,唐琦勇,顧美英

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】電離輻射(ionizing radiation, IR)可作用于生物大分子,產(chǎn)生輻射化學(xué)效應(yīng),如電離、產(chǎn)生自由基、核酸損傷等,對生物體產(chǎn)生損害[1]。生物體在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了各種應(yīng)對輻射的生存策略,可最大程度地減少輻射對生物體基礎(chǔ)代謝機(jī)制的損害,并對其進(jìn)行修復(fù)。在輻射區(qū)微生物研究過程中,真菌被發(fā)現(xiàn)是富集放射性物質(zhì)的重要生物[2-4]。在放射性的脅迫下,真菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的輻射耐受性和高度差異的基因組結(jié)構(gòu)[5],以及特殊的外觀和營養(yǎng)需求[4],并產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物,如色素、酶、多糖等。分析輻射對短梗霉代謝活動的影響,對研究真菌輻射機(jī)理機(jī)制有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】短梗霉屬(Aureobasidium)是一種具有酵母型和菌絲型形態(tài)的多形真菌,其厚垣孢子積累黑色素[6],可抵抗紫外線、高滲脅迫及重金屬毒害等多種逆境[7,8],還可作為單細(xì)胞蛋白、細(xì)胞壁多糖、胞外多糖、果膠酶、色素等的生產(chǎn)菌株[9]。Biolog微生物自動分析系統(tǒng)是一套微生物碳源代謝和鑒定的分析系統(tǒng),采用不同鑒定分析板,可鑒定和分析包括細(xì)菌、酵母、絲狀真菌在內(nèi)的近2 000 種微生物以及環(huán)境微生物群落多樣性[10,11]。其中,Biolog FF MicroPlate (Biolog, Hayward, CA, USA)可用于絲狀真菌鑒定,并也被用于環(huán)境中真菌群落的碳源代謝多樣性分析。Biolog FF MicroPlate使用95個碳源來測定微生物的底物利用率和表型譜,每個孔中包含的底物隨著代謝活性而變化顏色。95種碳源可歸納為六類碳源,以分析樣品對不同類型碳源的利用情況。其中,碳水化合物類(Carbohydrates)44種、氨基酸類(Amino acids)13種、羧酸類(Acids)17種、胺類(Amines)6種、聚合物類(Polymers)5種、其他(others)10種[12]。課題組在前期研究中獲得多株短梗霉[13],該菌株不但具有高劑量輻射(60Co γ射線 15 kGy)耐受能力,還具有極強(qiáng)的耐UV輻射和耐多種重金屬的能力。菌株生長過程中還大量產(chǎn)生可溶性黑色素,可有效的提高微生物在紫外照射下的存活率,證明其具有良好的紫外輻射保護(hù)作用[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對這類菌株在輻射脅迫下生長代謝活性變化,及其蘊(yùn)含的應(yīng)激機(jī)制和耐輻射機(jī)理研究國內(nèi)外鮮見報道。需分析輻射對短梗霉代謝活性的影響,研究真菌耐輻射機(jī)理機(jī)制。【擬解決的關(guān)鍵問題】從新疆輻射污染土樣中, 分離篩選出一株黑色酵母狀真菌MF1,觀察菌落形態(tài)和菌絲特征,分析系統(tǒng)發(fā)育并進(jìn)行鑒定。設(shè)置不同的60Co γ輻射劑量輻射試驗(yàn),采用 Biolog FF技術(shù)檢測分析輻射后菌株碳源的利用程度,并根據(jù)單孔平均顏色變化率(AWCD),分析輻射對菌株代謝活性的影響,為解析耐輻射真菌的輻射適應(yīng)機(jī)理及其開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

該菌株分離自新疆某輻射污染環(huán)境地表5～20 cm土壤,取采集的土樣1.0 g分裝于15 mm×150 mm無菌試管中,置于60Co γ射線下進(jìn)行10 kGy 劑量輻照處理,向試管中加入5 mL液體查氏培養(yǎng)基,28℃振蕩富集3 d。取1 mL上述富集液移入裝有9 mL無菌生理水的試管中,依次進(jìn)行梯度稀釋后,取0.2 mL稀釋液涂布于查氏培養(yǎng)基平板上,于28℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d,觀察菌落生長情況,挑取單菌落進(jìn)行純化。

1.1.2 培養(yǎng)基

MEA培養(yǎng)基:麥芽浸粉 30 g,大豆蛋白胨 3 g,純凈水1 000 mL。

查氏培養(yǎng)基:NaNO32 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO40.5 g,FeSO40.01 g,蔗糖 30 g,瓊脂糖 16 g,純凈水1 000 mL。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F超凈工作臺,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;HHW.21.600電熱恒溫水浴箱,北京永光明醫(yī)療儀器廠;fcycler 96孔PCR反應(yīng)儀,Bio-Rad公司;DYY-6C型電泳儀,北京六一儀器廠;GEL Doc2000凝膠成像分析儀,Bio-Rad公司;Biolog FF接種培養(yǎng)板、FF-IF接種液、Biolog Microsoft 全自動微生物鑒定分析系統(tǒng)(型號 MICROSTATION),美國Biolog公司;PL203電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SPX-150B生化培養(yǎng)箱,寧波東南儀器有限公司;HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱,哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;Eppendorf 5424離心機(jī),德國 Eppendorf股份公司;UV-2550 紫外分光光度計(jì),日本島津儀器(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 LSU rDNA D1/D2 區(qū)的 PCR 擴(kuò)增

將新鮮菌株接種于液體 MEA 培養(yǎng)基,于28℃恒溫條件下培養(yǎng)4 d,離心收集菌體,使用TE洗滌3遍。菌體經(jīng)液氮研磨后,DNA 提取參照Gerrits等[15]方法,DNA經(jīng)70%乙醇洗滌后自然干燥,加入50 μL無菌的雙蒸水,4℃下溶解2 h,-20℃保存?zhèn)溆?。LSU rDNA D1/D2區(qū)的PCR擴(kuò)增采用真菌通用引物NL1:5’-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3’,NL4:5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。擴(kuò)增條件為:95℃ 5 min;94℃ 1 min,52℃ 1 min,72℃ 2 min,共35個循環(huán);72℃10 min[16]。PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠純化(上海華舜生物技術(shù)公司膠回收試劑盒)回收,加去離子水溶解,送北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將實(shí)驗(yàn)菌株所得的LSU rDNA D1/D2區(qū)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行 BLAST 比較,確定與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近的種屬。從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬的序列,并結(jié)合真菌生物多樣性研究中心數(shù)據(jù)庫(http://www.cbs.knaw.nl/databases/)的標(biāo)準(zhǔn)模式菌序列, 利用MEGA 7.0軟件包[17,18]采用鄰接法(Neighbor-Joining method)進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,確定菌種生物學(xué)分類地位。

1.2.3 菌株生長及輻射試驗(yàn)

將新鮮培養(yǎng)的試驗(yàn)菌株接種到MEA 液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)3 d后,5 000 r/min 離心收集菌體,用0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)洗滌菌體3次,并調(diào)整至濃度OD600為 1.0左右。取上述菌懸液5 mL裝至15 mm×150 mm無菌試管中,送至中國科學(xué)院新疆地理生態(tài)研究所輻射中心,置于60Co γ射線(劑量率100 Gy/min)進(jìn)行不同劑量照射。取輻照處理后的菌液1mL進(jìn)行梯度稀釋后,取0.2 mL稀釋液涂布于MEA瓊脂培養(yǎng)基平板上,置28℃恒溫培養(yǎng),觀察記錄菌落數(shù),并計(jì)算存活率。以D.radioduransR1(DR)和E.coli作為對照菌株,繪制耐輻射曲線。根據(jù)耐輻射曲線結(jié)果,用上述方法制備菌懸液5 mL,分別在60Co γ射線輻射0 Gy(作為空白對照),2 500 Gy,5 000 Gy,10 000 Gy劑量下進(jìn)行輻射。輻射完成后,立即用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2.4 菌懸液制備及Biolog FF培養(yǎng)

使用移液槍,將輻照后的樣品原液逐滴加入到FF-IF接種液中,充分混勻,并將濃度控制在75%±2%。將接種液倒入無菌平皿或V型槽,用移液器在Biolog FF板每個孔中加入100 μL菌懸液,蓋上蓋子,控制濕度,30℃ 恒溫靜置培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Biolog FF板30℃恒溫靜置培養(yǎng),每隔24 h放置到Biolog菌種鑒定儀上,讀取不同孔的OD590值。其中,Biolog FF板孔中平均吸光值(Average well color development,AWCD) 用于描述菌株利用碳源的平均活性,計(jì)算公式如下:

AWCD= (Ci-R)/n.

式中,Ci為每個有培養(yǎng)基孔的吸光值,R為對照孔的吸光值,n為培養(yǎng)基孔數(shù),Biolog FF板n值為95[19]。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析采用Biolog自動分析系統(tǒng)、Excel及Graph Prism7.0軟件[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)特征

研究表明,菌株MF1可在4～30℃正常生長,最佳培養(yǎng)溫度28℃,可耐受15% NaCl。在查氏培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)條件下,菌落初期均為酵母樣,灰白色,菌落后期真菌菌絲體嵌入培養(yǎng)基,培養(yǎng)2 d后菌落轉(zhuǎn)暗為黑色或棕黑色,凸起,菌落邊緣有或無菌絲體嵌入培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d后,菌落大小為0.2～1.0 cm;其最適生長溫度為28℃,最適初始生長pH為6.0。顯微觀察,營養(yǎng)菌絲透明,光滑,薄壁,有橫隔,培養(yǎng)中后期轉(zhuǎn)換為黑色菌絲。分生孢子透明至黑褐色。透明分生孢子單細(xì)胞,光滑,橢圓形,(4.5～10) μm×(3.0～10) μm。 圖1,圖2

圖1 菌株MF1菌落形態(tài)

注:查氏培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7 d,Olympus BX43 顯微鏡40倍觀測

2.1.2 菌株的分子鑒定

研究表明,實(shí)驗(yàn)菌株為Aureobasidium屬,MF1(557 bp, 基因序列號OK083625)與A.melanogenumCBS 105.22T和 CBS 621.80T聚在一個分支中,支持率為70%,最大同源性99.5%。圖3

圖3 菌株MF1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.1.3 菌株的耐輻射特性

研究表明,在輻射劑量為5 000 Gy時,MF1和D.radioduransR1的存活率幾乎為100%。當(dāng)輻射劑量達(dá)到10 000 Gy時,2株菌的存活率依然有20%。然而,大腸桿菌細(xì)胞在接近5 000的輻射劑量時已基本死亡。輻射劑量達(dá)到15 kGy時,菌株MF1依然有細(xì)胞存活,表現(xiàn)出與D.radioduransR1相似的抗輻射能力。菌株MF1對60Co γ輻射同樣具有較強(qiáng)的抗性。圖4

圖4 菌株MF1的輻射存活曲線

2.1.4 菌株的碳源利用

研究表明,得到菌株在培養(yǎng)0～144 h代謝95種碳源的豐度指數(shù)。菌株在72 h時利用碳源種類最多,共46種,從而確定其可利用D-阿拉伯醇、熊果苷、D-纖維二糖、吐溫80、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、糊精、赤藻糖醇、D-果糖、D-半乳糖醛酸、龍膽二糖、a-D-葡萄糖、D-葡萄醛酸、丙三醇、肝糖、麥芽糖、麥芽三糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-松三糖、?-甲基-D-葡萄糖苷、6-O-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-阿洛酮糖、D-蜜三糖、L-鼠李糖、D-核糖、水楊苷、水蘇糖、蔗糖、D-海藻糖、D-木糖、溴代琥珀酸、反丁烯二酸、y-羥基丁酸、a-酮戊二酸、蘋果酸、奎尼酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、琥珀酸甲基酯、L-丙胺酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸作為唯一碳源。圖5

圖5 菌株碳源利用豐度指數(shù)變化

將菌株利用的碳源按Biolog FF板碳源的歸類,又可將其利用的碳源分為碳水化合物類24種、氨基酸類6種、羧酸類8種、胺類1種、聚合物類3種、其他4種。圖6

圖6 菌株利用的碳源類型

2.2 不同輻射劑量下菌株代謝活性

研究表明,在對照菌株中,隨培養(yǎng)時間增加,AWCD值增高,96～168 h趨于平穩(wěn),144 h基本達(dá)到最大。不同輻射劑量下菌株AWCD值也呈現(xiàn)相同趨勢。其中,在2 500 Gy輻照下,細(xì)胞代謝活性與對照組比較接近,分別為0.235 7和0.162 8;當(dāng)輻射大于5 000 Gy時,細(xì)胞代謝活性急速下降為0.078 2,低于對照組的50%;當(dāng)輻射達(dá)到10 000 Gy時,細(xì)胞代謝活性只有0.016 2,僅為對照組的6%左右。在低劑量輻射作用下,菌株的生長和代謝受到的影響較小,但當(dāng)輻射劑量大于5 000 Gy,細(xì)胞生長速率及代謝活性開始大幅下降,而當(dāng)輻射劑量達(dá)到10 000 Gy時,細(xì)胞生長近乎停滯狀態(tài),代謝活性極低。圖7

圖7 不同輻射劑量下菌株AWCD值變化

2.3 不同輻射劑量下菌株對碳源種類利用

研究表明,菌株對于6大碳源種類的利用存在明顯差異。隨著輻射劑量的上升,碳水化合物利用率呈上升趨勢,而羧酸類和氨基酸的利用呈下降趨勢。其他幾類碳源的利用率基本持平,但在10 000 Gy的輻射下,除了碳水化合物,其他碳源的利用率均為0。圖8

圖8 不同輻射劑量下菌株對不同類型碳源利用

4個輻射劑量下利用率最高的10種碳源共涉及22種。其中,對碳水化合物的利用種類最多,共11種,占總數(shù)的50%;氨基酸2種,占9%;羧酸類4種,占18%,聚合物只有1種,占5%,以及其他碳源4種,占18% 。表1

表1 不同輻射劑量下菌株利用最多的10種碳源

2.4 不同輻射劑量下菌株對碳源利用的變化

研究表明,一些碳源在不同輻射強(qiáng)度下均被利用,如熊果苷、D-木糖、D-海藻糖。而一些碳源隨著輻射強(qiáng)度的增大,就不再被細(xì)胞大量利用,如反丁烯二酸、 L-脯氨酸、水楊苷、L-蘋果酸、琥珀酸、L-谷氨酸。該部分碳源在輻射劑量達(dá)到5 000 Gy及以上時,利用率顯著下降。D-核糖、蔗糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖在低輻射劑量時并未被大量利用,而在10 000 Gy照射下利用率顯著提高,這提示在高輻射條件下細(xì)胞為適應(yīng)極端條件,開始大量利用這部分碳源以維持存活。

共有7種碳源隨輻射強(qiáng)度升高,利用率顯著增加,全部為碳水化合物:D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、蔗糖、D-海藻糖、D-木糖、熊果苷。

3 討 論

楊永華等[21]發(fā)現(xiàn)10～50 Gy低劑量的X-射線和γ射線有促進(jìn)真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長的作用,Tuga等[22]指出真菌在放射性環(huán)境下出現(xiàn)了趨放射性(radiotropism)和放射刺激作用(radiostimulation)。項(xiàng)目組先后從新疆輻射污染土樣中獲得耐輻射菌1000多株,包括細(xì)菌、放線菌、真菌等。其中,酵母、絲狀真菌100余株,分類鑒定歸屬于15個屬[23,24],其中多個屬此前無相關(guān)耐輻射特性報道。

在白堊紀(jì)早期的沉積層中出現(xiàn)了許多真菌化石黑化現(xiàn)象,而同一時期許多動植物的滅絕也基本歸因于遭受宇宙輻射[25,26]。黑色素可增強(qiáng)微生物在各類極端環(huán)境中生存,包括高海拔地區(qū),北極和南極地區(qū)[27]。在美國內(nèi)華達(dá)試驗(yàn)場、布魯克海文國家慢性輻射實(shí)驗(yàn)室都分離到產(chǎn)黑色素真菌。一些產(chǎn)黑色素真菌物種定殖在切爾諾貝利反應(yīng)堆損壞的墻壁上,核反應(yīng)堆冷卻池也被產(chǎn)黑色素微生物污染[28,29]。在以色列螺旋谷,紫外輻射強(qiáng)烈的南坡黑曲霉孢子中黑色素含量是陰涼北坡的3倍 (南坡日照是北坡的2～8倍)[30]。一些產(chǎn)黑色素真菌不僅是抗輻射的,慢性亞致死輻射條件還能刺激它的增殖[31]。黑色素具有保護(hù)真菌免受輻射損傷的功能,使其能在放射環(huán)境中成為優(yōu)勢種群。

短梗霉(Aureobasidium)是一種具有酵母型和菌絲型形態(tài)的多形真菌,其厚垣孢子積累黑色素,可抵抗紫外線、高滲脅迫及重金屬毒害等多種逆境[8,9,13]。項(xiàng)目組通過對該屬菌株的研究發(fā)現(xiàn),該菌可大量產(chǎn)生可溶性黑色素,最高發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)1.0 g/L以上[14]。黑色素可有效的提高菌株在紫外照射下的存活率,證明其具有良好的紫外輻射保護(hù)作用[8]。目前,國內(nèi)外對短梗霉的研究主要集中在與生產(chǎn)普魯蘭多糖相關(guān)的內(nèi)容[32-34],以及單細(xì)胞蛋白、細(xì)胞壁多糖、胞外多糖、果膠酶、色素等的生產(chǎn)相關(guān)研究[35]。而該菌株較強(qiáng)的耐輻射能力是否與其代謝過程及代謝產(chǎn)物相關(guān),以及其耐輻射機(jī)理尚未有研究報道。

Biolog-FF 微孔板除了用于檢測多種絲狀真菌的碳源利用情況,并對真菌種類進(jìn)行鑒定外,該技術(shù)還可以對環(huán)境中真菌群落的特性及代謝情況進(jìn)行分析[36]。試驗(yàn)中,當(dāng)輻射劑量小于5 000 Gy時,細(xì)胞存活率以及細(xì)胞代謝活性與對照組沒有顯著差異,在該劑量的輻射作用下,菌株的生長和代謝受到的影響較小,但當(dāng)輻射劑量大于5 000 Gy,細(xì)胞生長速率及代謝活性開始大幅下降,以細(xì)胞生長的穩(wěn)定期96 h為例,輻射劑量為5 000 Gy時,AWCD值約為對照組的1/2;當(dāng)輻射劑量達(dá)到10 000 Gy時,細(xì)胞存活率約為20%,AWCD值不足對照組的1/10,代謝活性極低。使用Biolog-FF微孔板可以直觀簡易的反映出細(xì)胞對碳源利用的變化。例如,D-核糖、蔗糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖在低輻射劑量時并未被大量利用,但在高劑量照射下利用率顯著上升。在95種碳源中,共有17種碳源表現(xiàn)出類似的趨勢。在高劑量輻射下碳源利用類型會發(fā)生明顯的改變,可能是該菌輻射應(yīng)激和適應(yīng)的一種有效機(jī)制。

目前,以耐輻射奇球菌為代表對微生物抗輻射作用進(jìn)行的研究表明,在輻射的損傷作用下,細(xì)胞會啟動應(yīng)激機(jī)制并進(jìn)行自我修復(fù),包括通過抗氧化酶清除自由基,DNA和蛋白質(zhì)的修復(fù)等[37]。試驗(yàn)中,輻射導(dǎo)致碳水化合物、胺類的利用率上升。胺類存在于所有生物細(xì)胞內(nèi),并隨細(xì)胞增殖、分化而作相應(yīng)的變化,胺類可通過直接與DNA相互作用調(diào)節(jié)DNA構(gòu)象和參與RNA及蛋白質(zhì)的合成[38]。而碳水化合物是生命細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要成分及主要供能物質(zhì),有調(diào)節(jié)細(xì)胞活動的重要功能。碳源最有用的利用方式是糖,他們可能在生存中起關(guān)鍵作用。三羧酸循環(huán)(TCA)是葡萄糖,脂質(zhì)和氨基酸最終的代謝途徑。在汪漢成等[39]利用灰葡萄孢殺菌劑對煙草灰霉病菌代謝活性的研究中,當(dāng)殺菌劑啶酰菌胺的濃度升高,TCA中的新陳代謝被抑制,包括溴丁二酸、富馬酸、α-酮戊二酸、D-蘋果酸、L-蘋果酸、奎尼酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、L-丙氨酰胺、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸和腐胺。但當(dāng)TCA中這些底物的代謝受到抑制,磷酸戊糖途徑(PPP)中的某些碳源仍然可以使用,并且代謝不受抑制,包括D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖和D-木糖。研究中,D-核糖、 蔗糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖,在高劑量照射下利用率顯示出明顯優(yōu)勢,另有17種碳源表現(xiàn)出相同的趨勢,包括D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖等。TCA不是葡萄糖代謝的唯一途徑。當(dāng)TCA被抑制時,磷酸戊糖途徑(PPP)可用于代謝碳水化合物。

4 結(jié) 論

不同輻射劑量下菌株AWCD值存在顯著差異。隨著輻射劑量的升高,細(xì)胞代謝活性顯著下降。同時,隨著輻射劑量的上升,在95種碳源中碳水化合物的利用率呈上升趨勢,而羧酸類、氨基酸和其他碳源的利用呈下降趨勢。隨著輻射劑量增加,菌株對碳源的利用也發(fā)生著變化。其中,D-核糖、蔗糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖在低輻射劑量時并未被大量利用,但在高劑量照射下利用率顯著上升。在95種碳源中,共有17種碳源表現(xiàn)出類似的趨勢。