李明哲 羅國廠 張仲博 岳宗進

1南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,河南 南陽 473000

2河南省中醫(yī)院,河南 鄭州 450000

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨骼疾病,其特點是骨量低、骨強度受損、骨折風險增加[1]。隨著人口老齡化程度的不斷加劇,骨質(zhì)疏松癥引發(fā)的骨折發(fā)生率日益升高[2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)/叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(FoxO1)信號通路是與自噬密切相關(guān)的通路,也是機體調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的信號通路之一[3]。據(jù)報道,SIRT1/FoxO1信號通路可調(diào)控炎癥小體發(fā)揮對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的神經(jīng)保護作用[4]。同時,手法治療能夠通過SIRT1/FoxO1信號通路抑制氧化應(yīng)激和炎癥,延緩大鼠椎間盤衰老[5]。有研究表明,大蒜素能夠通過預(yù)防破骨細胞形成、提高抗氧化活性以及激活SIRT1/FoxO1信號通路對鉛誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)流失發(fā)揮保護作用[6]。虎杖苷是植物虎杖的提取物,具有平喘、抗菌、調(diào)節(jié)激素、抗炎和抗腫瘤的功效[7]。Zhan等[8]研究報道,虎杖苷可促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化,從而治療脊髓損傷。研究發(fā)現(xiàn),虎杖苷對骨質(zhì)疏松癥有較好的治療效果,可促進成骨細胞生成來改善骨質(zhì)疏松[9]。目前關(guān)于虎杖苷對骨質(zhì)疏松性骨折后愈合情況的效果還未見報道,因此本研究基于SIRT1/FoxO1信號通路,探究虎杖苷對骨質(zhì)疏松性大鼠骨折愈合的療效及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物:SPF級別雌性SD大鼠,8～10周齡,體重245～272 g,購自南京偉沃生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2022-0005,所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度為(22±2)℃、相對濕度為(60±5)%、自動光/暗交替(12 h/12 h)的飼養(yǎng)房中,自由飲食進水,本研究經(jīng)南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校倫理委員會批準(LZS2022-03-04)。

1.1.2藥物與試劑:虎杖苷(批號RKL1093,原料藥,純度≥98.5%)購自江蘇齊氏生物科技有限公司;阿侖膦酸鈉片(批號20220225)購自成都天臺山制藥有限公司;I型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX-Ⅰ)、骨鈣素(OC)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白裂解液(批號分別為MY-59849、MY-42628、MY-63114、MY-70257、MY-17584、MY-51584、MY-21449)均購自寧波邁躍生物科技有限公司;HE染色試劑盒、PCR試劑盒、BCA試劑盒、ECL發(fā)光液(批號分別為BH-10409、BH-12594、BH-15986、BH-24585)均購自濟南博航生物技術(shù)有限公司;兔源SIRT1、FoxO1、β-肌動蛋白(β-actin)一抗、羊抗兔二抗(批號分別為BF-11482、BF-20700、BF-10652、BF-24729)均購自杭州比格飛序生物科技有限公司。

1.1.3儀器:雙能X線骨密度儀(型號XYH-1000B)、酶標儀(型號M200Pro)、顯微鏡(型號LW200ET-A)均購自鄭州邦泰生物科技有限公司;小動物X線片機(型號Posvet-100HF)、熒光定量PCR儀(型號ForeQuant F6)、凝膠成像系統(tǒng)(型號BOT-870)均購自山東綠都生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1模型的建立及分組給藥:參照文獻[10]構(gòu)建骨質(zhì)疏松性大鼠骨折模型:大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,經(jīng)腹腔注射2 %戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉,在無菌條件下切開大鼠背部雙側(cè),摘除雙側(cè)卵巢后縫合創(chuàng)口并消毒;另取12只大鼠作為對照組,僅暴露卵巢,不切除。3個月后通過雙能X線骨密度儀檢測大鼠股骨骨密度(bone mineral density, BMD),以去卵巢大鼠股骨BMD與對照組大鼠股骨BMD相比顯著降低且有統(tǒng)計學(xué)意義視為骨質(zhì)疏松模型大鼠構(gòu)建成功,成功造模48只骨質(zhì)疏松模型大鼠。用2 %戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉所有大鼠,將其右側(cè)股骨皮膚切開,暴露關(guān)節(jié)面,鋸斷股骨干中段,克氏針固定斷肢,閉合傷口并消毒。將建模成功的48只骨質(zhì)疏松性骨折大鼠隨機分為模型組、虎杖苷低劑量組、虎杖苷高劑量組、阿侖膦酸鈉組,每組12只。建模結(jié)束后,虎杖苷低、高劑量組大鼠分別給予30 mg/kg、60 mg/kg虎杖苷灌胃給藥[11](將虎杖苷和生理鹽水混溶成濃度分別為3、6 mg/mL的混懸液,灌胃體積10 mL/kg);阿侖膦酸鈉組大鼠給予0.5 mg/kg阿侖膦酸鈉灌胃給藥[12](將阿侖膦酸鈉片和生理鹽水混溶成濃度為0.05 mg/mL的混懸液,灌胃體積10 mL/kg);對照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。各組給藥每天1次,連續(xù)8周。

1.2.2大鼠骨折愈合程度評分及骨折處BMD的測定:末次給藥結(jié)束后次日,給大鼠拍攝X光片,進行骨折愈合程度評分[13],標準如下:骨折線清晰,無骨膜為0分;骨折處模糊,輕度骨膜反應(yīng),無骨痂為1分;骨折處邊緣模糊,骨膜反應(yīng)淺,少量骨痂生成為2分;骨折處痕跡不明顯,骨痂生成增多,密度增加,邊緣較清晰為3分;骨折處痕跡不可見,骨痂填滿缺損部位,且密度與正常骨組織基本相同為4分。由三位專業(yè)人士對X光片進行評判,取平均值為骨折愈合程度評分,評分越高代表骨折愈合程度越好。同時采用雙能X線掃描儀對大鼠骨折處BMD進行測定。

1.2.3大鼠血清中OC、CTX-1、TNF-α、IL-1β水平的測定:用2 %戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠,使用非抗凝管心臟取血3 mL,4 ℃、5 200 r/min條件下離心15 min,取上清于一支新的離心管中,根據(jù)ELISA試劑盒說明書中的方法檢測大鼠血清中OC、CTX-1、TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4大鼠骨組織病理學(xué)變化檢測:取血后處死大鼠,骨折處取大鼠骨組織,分為兩部分。一部分置于- 80 ℃冰箱中保存;另一部分用4 %多聚甲醛固定24 h,脫鈣,石蠟包埋,切片,HE染色,觀察骨組織病理學(xué)變化。

1.2.5大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1信使RNA(mRNA)水平的測定:取1.2.4中大鼠骨組織,加入液氮充分研磨,Trizol法提取骨組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,運用熒光定量PCR法檢測SIRT1、FoxO1 mRNA水平,內(nèi)參為GAPDH。引物由杭州比格飛序生物科技有限公司設(shè)計合成,引物序列見表1。反應(yīng)條件和環(huán)境參照PCR試劑盒進行配置,通過2-△△Ct法計算靶基因mRNA水平。

表1 引物序列

1.2.6大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平的測定:取1.2.4中大鼠骨組織,加入液氮充分研磨后,加入蛋白裂解液裂解,BCA試劑盒定量總蛋白,電泳分離后轉(zhuǎn)膜,脫脂牛奶(5 %)在室溫下封膜1 h,加入兔源SIRT1(1∶1 200)、FoxO1(1∶1 500)、β-actin(1∶1 600)一抗4 ℃下孵育過夜,加入羊抗兔二抗(1∶2 400),室溫孵育1 h,ECL試劑顯影,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參,計算SIRT1、FoxO1蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD的影響

與對照組相比,模型組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD顯著降低(P<0.05);與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組,阿侖膦酸鈉組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD顯著升高(P<0.05);與虎杖苷低劑量組相比,虎杖苷高劑量組、阿侖膦酸鈉組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD顯著升高(P<0.05);阿侖膦酸鈉組和虎杖苷高劑量組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD水平的比較

2.2 虎杖苷對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血清中OC、CTX-1、TNF-α、IL-1β水平的影響

與對照組相比,模型組大鼠血清中OC水平顯著降低,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組,阿侖膦酸鈉組大鼠血清中OC水平顯著升高,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.05);與虎杖苷低劑量組相比,虎杖苷高劑量組、阿侖膦酸鈉組大鼠血清中OC水平顯著升高,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.05);阿侖膦酸鈉組和虎杖苷高劑量組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中OC、CTX-1、TNF-α、IL-1β水平的比較

2.3 虎杖苷對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨組織病理學(xué)變化的影響

對照組大鼠骨組織骨小梁結(jié)構(gòu)正常;模型組大鼠骨組織的骨小梁變細、數(shù)量減少且連續(xù)性較差,同時骨小梁間距增寬;虎杖苷低、高劑量組大鼠上述病理學(xué)變化程度依次減輕,骨小梁明顯增多且有序排列,有大量成骨細胞;阿侖膦酸鈉組和虎杖苷高劑量組大鼠骨組織病理學(xué)變化無顯著差異。見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織病理學(xué)變化(HE染色,×200)

2.4 虎杖苷對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平的影響

與對照組相比,模型組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組,阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平顯著升高(P<0.05);與虎杖苷低劑量組相比,虎杖苷高劑量組、阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平顯著升高(P<0.05);阿侖膦酸鈉組和虎杖苷高劑量組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA水平的比較

2.5 虎杖苷對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平的影響

與對照組相比,模型組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,虎杖苷低、高劑量組,阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平顯著升高(P<0.05);與虎杖苷低劑量組相比,虎杖苷高劑量組、阿侖膦酸鈉組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平顯著升高(P<0.05);阿侖膦酸鈉組和虎杖苷高劑量組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白印跡圖

圖3 各組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1蛋白水平的比較

3 討論

引起機體骨質(zhì)疏松的因素較復(fù)雜,且目前研究認為機體雌激素水平的失調(diào)是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的重要因素之一,當大鼠去掉卵巢后,常常伴隨出現(xiàn)機體激素代謝紊亂、雌激素水平降低,增加骨質(zhì)疏松的發(fā)生率[14]。骨質(zhì)疏松癥可誘發(fā)骨折,當機體成骨細胞功能正常時,骨細胞結(jié)構(gòu)正常,并且排列整齊,由于各種因素引起機體產(chǎn)生骨質(zhì)疏松時,機體成骨細胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生病理性變化,進而導(dǎo)致BMD的降低,增加骨折的風險[15]。CTX-Ⅰ是破骨細胞活性的標志物,OC是成骨細胞分泌的特異性蛋白,是成骨細胞功能敏感標志,OC和CTX-1水平可有效反應(yīng)機體的成骨細胞和破骨細胞的活性[16]。TNF-α、IL-1β是反映機體炎癥的常見指標,其水平越高代表炎癥反應(yīng)越劇烈[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠骨折愈合程度評分、骨折處BMD、血清中OC水平較對照組顯著降低,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平較對照組顯著升高。病理學(xué)結(jié)果顯示,對照組大鼠骨組織骨小梁結(jié)構(gòu)正常,模型組大鼠骨組織的骨小梁變細、數(shù)量減少且連續(xù)性較差,同時骨小梁間距增寬,表明骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨折愈合較差,BMD和成骨細胞活性降低,破骨細胞活性和炎癥反應(yīng)升高。

虎杖苷具有抗休克、保護神經(jīng)、保護肝臟、免疫調(diào)節(jié)等方面的作用[18]。Zhan等[19]研究表明,虎杖苷能夠調(diào)節(jié)涉及破骨細胞和成骨細胞分化和活性的基因,減輕氧化應(yīng)激和基質(zhì)金屬蛋白酶活性,以及恢復(fù)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路,保護患有慢性脊髓損傷小鼠的骨量流失。Yuan等[20]研究表明,虎杖苷通過促進成骨細胞分化對切除卵巢的小鼠表現(xiàn)出顯著的抗骨質(zhì)疏松作用。本研究發(fā)現(xiàn)使用虎杖苷處理的骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨組織病理學(xué)變化程度減輕,骨小梁明顯增多且有序排列,有大量成骨細胞,同時骨折愈合程度評分、骨折處BMD、血清中OC水平升高,CTX-Ⅰ、TNF-α、IL-1β水平降低,且呈現(xiàn)劑量依賴性,表明虎杖苷具有減輕骨質(zhì)疏松性骨折大鼠炎癥反應(yīng)和促進骨折愈合的效果。

SIRT1/FoxO1信號通路是和細胞凋亡、炎癥反應(yīng)都相關(guān)的通路。Chen等[21]研究表明,積雪草酸可能通過激活SIRT1/FoxO1信號通路來減輕高脂肪飲食誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松癥,從而抑制氧化應(yīng)激并促進成骨分化。Jiang等[22]研究表明,白藜蘆醇能通過激活SIRT1/FoxO1信號通路,增強對氧化損傷的抵抗力,從而促進成骨細胞活性。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白水平顯著降低,虎杖苷處理的骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨組織中SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白水平顯著升高,結(jié)合Chen和Jiang等[21-22]的研究,本研究猜測虎杖苷可能通過激活SIRT1/FoxO1信號通路來促進骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的骨折愈合。

綜上所述,虎杖苷可減輕骨質(zhì)疏松性骨折大鼠炎癥反應(yīng),具有促進骨折愈合的效果,其機制可能與激活SIRT1/FoxO1信號通路有關(guān)。但是,本研究僅從SIRT1/FoxO1信號通路的角度探究了虎杖苷對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨折愈合的效果,其能否通過其他信號通路對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的骨折愈合產(chǎn)生影響,有待后續(xù)研究。