徐文雅，馬倩云*，王佳榮，孫劍鋒，湯軼偉，王 頡，王文秀*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）是當(dāng)今世界上養(yǎng) 殖最多的三大優(yōu) 良蝦類之一，目前已成為我國(guó) 重要的養(yǎng)殖蝦種。根據(jù)《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》，2020年中國(guó)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)119.77萬 t[1]。對(duì)蝦水分含量高、組織柔嫩、結(jié)締組織少，體內(nèi)酶類在常溫下活性強(qiáng)，因而極易發(fā)生腐敗變質(zhì)，故貯藏期較短。干制后的蝦干因味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富 而深受廣大消費(fèi) 者喜愛，并且具有易貯存、方便 攜帶等優(yōu)點(diǎn)。因此，干制已成為延長(zhǎng)對(duì)蝦貯藏期的重要加工方式之一。

熱風(fēng)干制是一種常見的海鮮干制方法，具有生產(chǎn)量大、操作簡(jiǎn)便、流程簡(jiǎn)化且易自動(dòng)控制等特點(diǎn)[2]，因此在工業(yè)干制生產(chǎn)中常采用此方法。在干制過程中，受干制溫度和時(shí)間的影響，水產(chǎn)品中水分不斷蒸發(fā)、細(xì)胞液濃縮、化學(xué)鍵發(fā)生新生和斷裂，氨基酸多肽鏈展開，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性并逐漸喪失生物活性[3]。作為重要的肌肉成分，蛋白質(zhì)變化可以實(shí)質(zhì)性地影響蝦的色澤和質(zhì)構(gòu)特性，因此，深入研究干制過程中對(duì)蝦蛋白質(zhì)變化規(guī)律及其與品質(zhì)變化的內(nèi)在聯(lián)系，可為提高南美白對(duì)蝦干制品質(zhì)量提供理論依據(jù)。而現(xiàn)階段對(duì)于對(duì)蝦干制的研究主要集中在不同加工方式和加工工藝優(yōu)化對(duì)干制品理化特性、營(yíng)養(yǎng)成分等指標(biāo)的影響方面[4-5]，對(duì)引起理化品質(zhì)變化的深層原因缺乏系統(tǒng)的研究，對(duì)干制過程中蛋白質(zhì)變化規(guī)律及其與品質(zhì)變化的相關(guān)關(guān)系尚不明確。

基于上述問題，本研究以南美白對(duì)蝦為原料，對(duì)其進(jìn)行熱風(fēng)干制加工處理，分析干制過程中色澤、質(zhì)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)等品質(zhì)特性變化規(guī)律，并深入探討干制過程中蛋白質(zhì)氧化降解程度、分子內(nèi)價(jià)鍵、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，從分子層面揭示干制誘導(dǎo)的對(duì)蝦蛋白變化規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，通過相關(guān)性分析解析蛋白質(zhì)變化與品質(zhì)的內(nèi)在聯(lián)系，以期明確蛋白質(zhì)變化對(duì)蝦干品質(zhì)的影響，為進(jìn)一步提升水產(chǎn)品干制品品質(zhì)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活對(duì)蝦購(gòu)買于河北省保定 市南市區(qū)農(nóng)大科技市場(chǎng)。

無水乙醇、乙酸乙酯、氯化鈉溶液等化學(xué)試劑（均為分析純） 西安三浦化學(xué)試劑 有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-914385-111電熱鼓風(fēng)干燥箱 吳江德順電熱設(shè)備廠；CR-400色彩色差計(jì) 美國(guó)HunterLab公司；TMS-Pro食品物性分析儀 美國(guó)FTC公司；TGL21M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南易達(dá)京華儀器有限公司；F97熒光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；165-8001電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Tiss-24高通量組織研磨儀寧波新智生物科技有限公司；AccuRam拉曼光譜儀美國(guó)Ocean Optics公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦樣品的制備

購(gòu)買單只質(zhì)量約為（15±3）g的活蝦，低溫運(yùn)到河北農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬加工與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，將其放入0 ℃冰水中直至死亡。將適量的蝦在質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的鹽水中煮沸2 min，然后取出去除表面水分，將蝦樣品置于55 ℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行干制。根據(jù)前期研究結(jié)果，干制12 h時(shí)，蝦干的口感最佳[6]，因此設(shè)定總干制處理時(shí)間為12 h，每2 h取樣一次，測(cè)定品質(zhì)和蛋白質(zhì)變化指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 色澤測(cè)定

利用CR-400色彩色差計(jì)對(duì)蝦肉的L*、a*、b*值進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算色差?E。其中L*值表示亮度，a*值表示紅綠度，b*值表示黃藍(lán)度。測(cè)試時(shí)需進(jìn)行白 板校正。

1.3.2.2 質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

將對(duì)蝦去殼進(jìn)行質(zhì)構(gòu)特性分析（texture profile analysis，TPA），測(cè)定樣品的硬度、黏附性、彈性、膠黏性和咀嚼性。測(cè)量模式為TPA測(cè)定程序，探頭型號(hào)P/5，感應(yīng)力量程為200 N，檢測(cè)速率為30 mm/min，形變量為60%，起始力為0.5 N。

1.3.2.3 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考王穩(wěn)航等[7]的方法，采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察蝦肌肉組織的微觀結(jié)構(gòu)。將樣品切成3 mm×3 mm×3 mm的正方體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液在4 ℃中浸泡樣品24 h，然后分別用體積分?jǐn)?shù)10%、20%、40%、60%、80%的乙醇溶液和無水乙醇進(jìn)行梯度洗脫20 min，隨后真空冷凍干燥得到樣品。將試樣進(jìn)行噴金操作，抽真空后進(jìn)行觀察，放大倍數(shù)為1 000。

1.3.3 蛋白質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 總巰基含量測(cè)定

總巰基含量測(cè)定參照 魯耀彬等[8]方法，稱取2.0 g蝦肉樣品放入50 mL離心管，加入10 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 8.0），8 500×g下勻漿2 min，再1 500×g離心10 min，取上清液1 mL并用蒸餾水制成10 倍稀釋液，再加入20 μL 2 mmol/L的5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）試劑進(jìn)行渦旋混勻，25 ℃遮光處理1 h后在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，總巰基含量按公式（1）計(jì)算。

式中：A為吸光度；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ε為摩爾消光系數(shù)（13 600 L/（mol·cm））；D為稀釋倍數(shù)（10）。

1.3.3.2 蛋白羰基含量測(cè)定

蛋白羰基含量測(cè)定參考石徑[9]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱取2.0 g肉樣于10 mL含0.6 mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）中進(jìn)行勻漿，1 500×g離心10 min，取400 μL上清液于2 mL EP管中，加入含10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）的200 μL 2 mol/L HCl，30 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)1 h。每EP管中加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）沉淀蛋白，靜置20 min后10 000×g離心15 min，棄去上清液，用1 mL乙酸乙酯-乙醇溶液（1∶1，V/V）洗滌沉淀以除去未反應(yīng)的DNPH，重復(fù)上述步驟至上清液無色，用3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液溶解蛋白，沉淀完全溶解后在317 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白羰基含量按公式（2）計(jì)算。

式中：A為吸光度；a為羰基分子吸光系數(shù)（22 000 L/（g·cm）；b為光程（1 cm）；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.3.3 三氯乙酸-可溶性肽含量的測(cè)定

TCA-可溶性肽含量的測(cè)定參考徐永霞等[10]的方法并作適當(dāng)修改。稱取2.0 g樣品，加入18 mL預(yù)冷的5 g/100 mL TCA溶液，勻漿1 min后于4 ℃冰箱靜置1 h，4 ℃條件下10 000×g離心15 min，取上清液備用，采用雙縮脲法測(cè)定蛋白（可溶性肽）質(zhì)量濃度。

1.3.3.4 化學(xué)作用力的測(cè)定

化學(xué)作用力的測(cè)定參照鄧麗[11]的方法并略加改進(jìn)。取2.0 g蝦肉樣品于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的NaCl中均質(zhì)45 s。將處理后的樣品加10 mL 0.6 mol/L NaCl（試劑S1），4 500×g下勻漿2 min，4 ℃冷藏1 h。然后4 ℃、18 600×g離心25 min，上清液于4 ℃保存。將上述離心的沉淀加10 mL 1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液（試劑S2），后續(xù)處理相同。再將上述離心的沉淀加10 mL 8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液（試劑S3），后續(xù)處理相同。將上述沉淀加10 mL pH 7的0.5 mol/L 2-巰基乙醇、0.6 mol/L NaCl和8 mol/L尿素的混合液（試劑S4），后續(xù)處理相同。將每步離心后上清液分別加等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% TCA溶液，使之充分沉淀。然后經(jīng)4 000×g離心15 min，棄上清液。向沉淀中加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液溶解沉淀并置于4 ℃層析柜保存，每步沉淀需對(duì)應(yīng)標(biāo)記清楚。實(shí)驗(yàn)過程中經(jīng)試劑S1、S2、S3及S4提取后的上清液中蛋白含量分別對(duì)應(yīng)離子鍵、氫鍵、疏水鍵和二硫鍵含量，利用福林-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.3.5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

采用拉曼光譜測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。將蝦樣品去皮平鋪于載物臺(tái)上進(jìn)行拉曼光譜掃描。激光波長(zhǎng)為785 nm，拉曼位移范圍為200～2 000 cm－1，采集時(shí)間為10 s，累計(jì)2 次。每個(gè)樣品取3 個(gè)點(diǎn)掃描，最終拉曼光譜曲線取3 次結(jié)果的平均值。采用拉曼光譜儀配套軟件AccuRam對(duì)光譜進(jìn)行基點(diǎn)校正和熒光背景扣除。

1.3.3.6 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

參考姜晴晴[12]的方法提取肌原纖維蛋白，參照Xu Yanshun等[13]的方法測(cè)定內(nèi)源熒光強(qiáng)度。用0.6 mol/L NaCl溶液將肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度稀釋至0.05 mg/mL，然后使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定內(nèi)源熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，掃描速率為1 000 nm/min，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍310～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

1.3.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考Laemmli等[14]的方法并作適當(dāng)修改。向0.1 g樣品中加入10 mL PIPA裂解液，在高通量組織研磨儀中均質(zhì)，將樣品冰孵20 min，14 000×g離心10 min后獲得的上清液為肌原纖維蛋白原液。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，并用PIPA裂解液將所有樣品蛋白原液質(zhì)量濃度稀釋至1 500 μg/mL。將獲得的肌原纖維蛋白液與上樣緩沖液按體積比4∶1混合，并在沸水中加熱5 min。將混合液加到SDS-PAGE凝膠上樣孔中，以130 V恒壓進(jìn)行電泳約100 min，然后使用SDS-PAGE染色液染色30 min后蒸餾水脫色，最后通過與蛋白質(zhì)標(biāo)記物（10～250 kDa）比較來確定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和圖形處理分別利用SPSS 22.0和Origin 2018軟件進(jìn)行，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)定量通過PeakFit V4軟件進(jìn)行，采用Duncan法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)蝦熱風(fēng)干制過程中品質(zhì)的變化

2.1.1 色差

對(duì)蝦在干制過程中色澤的變化如表1所示。L*值從新鮮時(shí)的40.71增加到煮沸后的63.85，這是因?yàn)橹蠓羞^程中熱量增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，最終影響蝦的亮度[15]。隨著干制時(shí)間的延長(zhǎng)，L*值顯著降低（P＜0.05），這是由于干制過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致干蝦變黑，亮度降低。Ling Jiangang等[16]在研究高壓輔助真空冷凍干制對(duì)蝦的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)導(dǎo)致蝦黑變的現(xiàn)象。a*和b*值在整個(gè)干制過程中具有相似的變化趨勢(shì)，與鮮蝦相比，干蝦的a*和b*值顯著增加（P＜0.05），這是由于蝦體內(nèi)胡蘿卜素在加熱過程中分解，蝦青素釋放引起的顏色變化。在干制后期，a*和b*值略有下降，這可能是由于蝦青素隨著熱風(fēng)干制時(shí)間的延長(zhǎng)而略有損失。對(duì)于ΔE，干制過程中ΔE均高于12，表明干制過程中蝦的顏色與新鮮時(shí)的顏色有明顯差異。

表1 熱風(fēng)干制過程對(duì)蝦色澤的變化Table 1 Changes in the color of shrimp during hot air drying

2.1.2 質(zhì)構(gòu)特性

質(zhì)構(gòu)特性包括硬度、黏附性、彈性、膠黏性、咀嚼性等指標(biāo)。如表2所示，硬度隨干制時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，到干制終點(diǎn)增加至344.78 N（P＜0.05），這是由于蝦肌肉纖維干制過程發(fā)生收縮，肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白被破壞，導(dǎo)致肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂[17]。彈性呈先升高后降低的趨勢(shì)，干制8 h時(shí)達(dá)到最高水平。彈性的變化與肌肉的收縮有關(guān)，干制過程肌肉組織因收縮而發(fā)生不可逆變形，導(dǎo)致彈性整體上呈降低趨勢(shì)。咀嚼性代表咀嚼固體樣品所需的能量，而膠黏性代表將食物與其接觸材料分離所需的能量，蝦樣品的膠黏性和咀嚼性隨干制時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，到干制終點(diǎn)分別增加至45.01 mJ和116.50 mJ，這是質(zhì)構(gòu)特性共同作用的結(jié)果。

表2 熱風(fēng)干制過程對(duì)蝦質(zhì)構(gòu)特性的變化Table 2 Changes in the texture of shrimp during hot air drying

2.1.3 微觀結(jié)構(gòu)

對(duì)蝦干制過程中微觀結(jié)構(gòu)變化如圖1所示。新鮮樣品切面與表面的肌肉組織光滑細(xì)膩，幾乎沒有裂痕。干制4 h時(shí)，水分損失嚴(yán)重，從樣品的切面和表面可以看出蝦肉肌纖維束發(fā)生形變，肌纖維細(xì)胞間隙出現(xiàn)裂縫，干制8 h時(shí)肌肉纖維收縮更加嚴(yán)重，直到12 h肌肉纖維發(fā)生斷裂。Chang Haijun等[18]報(bào)道稱此現(xiàn)象可能是肌原纖維蛋白脫水、熱變性和纖維收縮共同作用的結(jié)果。肌纖維結(jié)構(gòu)之所以發(fā)生變化是因?yàn)楦芍七^程中蛋白質(zhì)氧化變性，進(jìn)而發(fā)生了交聯(lián)和聚集，并且肌肉的肌節(jié)可能會(huì)發(fā)生聚合或收縮，從而使間隙增大；同時(shí)在體內(nèi)蛋白酶的作用下，結(jié)締組織不斷降解，導(dǎo)致肌纖維與肌內(nèi)膜發(fā)生了脫離，也使間隙增大[19]。另外，干制前后水分含量的降低也導(dǎo)致肌纖維裂縫的增大，并且熱處理造成了肌肉收縮，破壞了肌纖維結(jié)構(gòu)的完整性。Namsanguan等[20]的研究表明干制導(dǎo)致肌纖維細(xì)胞收縮，肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，肌纖維間隙增大的同時(shí)蝦的硬度隨之增大，可見蝦肌肉微觀結(jié)構(gòu)變化與質(zhì)構(gòu)特性存在密切聯(lián)系。

圖1 對(duì)蝦熱風(fēng)干制過程蝦肌纖維切面與表面SEM圖（×1 000）Fig.1 Cross-sectional and surface SEM images of shrimp during hot air drying (× 1 000)

2.2 對(duì)蝦熱風(fēng)干制過程中蛋白質(zhì)變化分析

2.2.1 總巰基和蛋白羰基含量

總巰基的損失量和蛋白羰基的生成量可反映蛋白的氧化程度。如圖2所示，新鮮蝦中總巰基含量為2.36 μmol/g，水煮后總巰基含量降低至0.77 μmol/g，表明存在于半胱氨酸殘基中的巰基基團(tuán)受到溫度和有氧環(huán)境的影響，發(fā)生變性和延伸，巰基基團(tuán)暴露并轉(zhuǎn)化為二硫鍵，導(dǎo)致總巰基含量顯著降低。隨干制時(shí)間的延長(zhǎng)，巰基基團(tuán)繼續(xù)被氧化，干制至終點(diǎn)時(shí)總巰基含量為0.36 μmol/g。Ko等[21]在研究羅非魚熱處理后成分變化時(shí)發(fā)現(xiàn)巰基易在分子內(nèi)被氧化，生成二硫化物，導(dǎo)致巰基含量下降。羰基是自然氧化的主要產(chǎn)物，在干制過程中蛋白羰基含量從0.84 nmol/mg（鮮樣）升高到2.03 nmol/mg，這是由于對(duì)蝦在干制過程中賴氨酸、精氨酸和脯氨酸的側(cè)鏈?zhǔn)艿竭^渡金屬和活性氧的攻擊，肽鏈發(fā)生斷裂，導(dǎo)致羰基含量升高[22]。

圖2 對(duì)蝦熱風(fēng)干制過程總巰基和蛋白羰基含量的變化Fig.2 Changes in total sulfhydryl group and protein carbonyl group contents in shrimp during hot air drying

2.2.2 TCA-可溶性肽含量

TCA-可溶性肽含量作為表征蛋白質(zhì)降解的指標(biāo)之一[23]，能夠反映對(duì)蝦所含小分子肽的含量，從而反映蛋白質(zhì)的降解程度。對(duì)蝦在熱風(fēng)干制過程中TCA-可溶性肽的含量變化如圖3所示。TCA-可溶性肽含量總體呈上升趨勢(shì)。新鮮蝦中TCA-可溶性肽的含量為0.56 μmol/g，水煮后降至0.43 μmol/g，之后隨干制時(shí)間的延長(zhǎng)，又逐漸增多。Nie Xiaohua等[24]發(fā)現(xiàn)內(nèi)源酶有助于TCA-可溶性肽的釋放，可以看出水煮過程使部分內(nèi)源性蛋白酶失活，但并沒有將蝦中的內(nèi)源酶完全去除，致使TCA-可溶性肽含量在干制過程中逐漸增多。干制6 h后TCA-可溶性肽含量增加更明顯，這是因干制引起蛋白質(zhì)變性、保水力降低、水分流失加快所致。

圖3 對(duì)蝦熱風(fēng)干制過程TCA-可溶性肽含量的變化Fig.3 Changes in TCA-soluble peptide content of shrimp during hot air drying

2.2.3 化學(xué)作用力的變化

離子鍵、氫鍵、疏水鍵、二硫鍵等 維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)作用力變化可反映蛋白質(zhì)的變性程度，熱風(fēng)干制過程各化學(xué)作用力變化如圖4所示。離子鍵是較弱的鍵合力，在加熱過程中容易被破壞。隨干制時(shí)間的延長(zhǎng)離子鍵的相對(duì)含量顯著降低（P＜0.05），從21.66%（鮮樣）下降到11.62%（干制12 h），表明干制過程中蝦蛋白質(zhì)受溫度的影響，電子吸收熱能變得活躍，導(dǎo)致離子鍵不穩(wěn)定而發(fā)生斷裂，促使其相對(duì)含量降低。朱孔輝等[25]研究鳊魚凝膠蛋白特性時(shí)發(fā)現(xiàn)離子鍵含量越高蛋白品質(zhì)越好。氫鍵是指氫原子與電負(fù)性大的原子以共價(jià)鍵結(jié)合，同時(shí)與電負(fù)性大的原子Y形成X-H…Y形式的鍵，是形成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)起重要作用[26]。氫鍵相對(duì)含量的變化趨勢(shì)與離子鍵相似，從19.33%（鮮樣）下降至9.23%（干制12 h），表明干制處理破壞了蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基和?；g形成的氫鍵，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)蝦蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這與鄧麗[11]研究鮑魚蛋白質(zhì)加熱過程中的化學(xué)作用力變化趨勢(shì)一致（氫鍵相對(duì)含量顯著降低（P＜0.05））。疏水鍵在穩(wěn)定 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物膜磷 脂雙分子層結(jié)構(gòu)方面起重要作用。疏水鍵相對(duì)含量的變化趨勢(shì)與離子鍵相反，從12.35%（鮮樣）上升至18.97%（干制12 h），表明干制促使蝦蛋白的疏水性殘基暴露，增加了疏水鍵的相對(duì)含量。二硫鍵在干制過程中相對(duì)含量隨干制時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加（P＜0.05），到干制終點(diǎn)增加至28.94%，二硫鍵含量的增加與巰基（—SH）被氧化而形成—S—S—有關(guān)，這一結(jié)果與上述總巰基含量變化結(jié)果相印證。

圖4 蝦熱風(fēng)干制過程化學(xué)作用力的變化Fig.4 Changes in chemical forces in shrimp during hot air drying

2.2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)定量分析結(jié)果

拉曼光譜中酰胺I區(qū)（1 600～1 700 cm－1）峰的變化與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)。酰胺I區(qū)含有C＝O、C—N和N—H伸縮振動(dòng)的信息[27]。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包含α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，其中α-螺旋與1 651～1 660 cm－1之間的峰有關(guān)，表征蛋白質(zhì)分子的規(guī)整性；β-折疊和β-轉(zhuǎn)角分別對(duì)應(yīng)1 600～1 639 cm－1和1 661～1 700 cm－1之間的峰，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角反映蛋白質(zhì)分子的松散性；無規(guī)卷曲對(duì)應(yīng)1 640～1 650 cm－1之間的峰[28]。干制會(huì)使蝦的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此酰胺I區(qū)的峰形會(huì)隨之變化。由于表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的多個(gè)振動(dòng)吸收峰容易重疊，使拉曼圖譜中出現(xiàn)寬峰，因此常采用求二階導(dǎo)和曲線擬合的方法來得到單個(gè)譜帶的信息[29]。

通過PeakFit V4軟件對(duì)酰胺I區(qū)進(jìn)行峰分離和曲線擬合處理，得到圖5，然后根據(jù)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲對(duì)應(yīng)的峰面積，計(jì)算出各結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，如表3所示。新鮮對(duì)蝦的α-螺旋相對(duì)含量為32.31%，干制至終點(diǎn)12 h時(shí)，其相對(duì)含量為18.37%，下降了43.14%，并且可以看出從新鮮對(duì)蝦到水煮對(duì)蝦α-螺旋相對(duì)含量下降了18.97%，表明溫度的升高會(huì)顯著影響α-螺旋結(jié)構(gòu)的變化。對(duì)蝦經(jīng)過水煮后β-折疊相對(duì)含量顯著降低22.20%，而干制過程對(duì)蝦β-折疊相對(duì)含量從新鮮時(shí)的17.57%降至干制終點(diǎn)的14.67%，這是由于溫度突然升高導(dǎo)致蛋白分子間氫鍵斷裂，使其維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力降低，導(dǎo)致β-折疊相對(duì)含量顯著下降（P＜0.05）。對(duì)蝦經(jīng)過水煮后β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量顯著升高13.45%，而干制過程β-轉(zhuǎn)角含量變化不明顯。對(duì)蝦無規(guī)卷曲相對(duì)含量隨干制時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，從新鮮時(shí)的15.76%上升至干制終點(diǎn)時(shí)的28.21%，整個(gè)干制過程發(fā)生了α-螺旋向β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的轉(zhuǎn)化，意味著干制過程蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)由規(guī)整向松散轉(zhuǎn)化，并且與溫度變化密切相關(guān)。蛋白質(zhì)分子的加熱變性、巰基氧化、水分子–蛋白質(zhì)分子間氫鍵變化，造成了蛋白質(zhì)原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的破壞。

圖5 對(duì)蝦蛋白拉曼光譜酰胺I區(qū)分峰和迭代擬合曲線Fig.5 Segregated and iterative curve-fitted Raman bands in amide I region of proteins in raw, boiled and dried shrimps

表3 對(duì)蝦蛋白酰胺I區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 3 Secondary structure contents from amide I band spectra of proteins in raw, boiled and dried shrimps %

2.2.5 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

芳香族氨基酸的暴露程度表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開程度，可表征蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[30]。相關(guān)報(bào)道顯示，肌原纖維蛋白含有色氨酸殘基，色氨酸吲哚側(cè)鏈的暴露與內(nèi)源熒光強(qiáng)度有關(guān)[31-32]，因此，色氨酸成為最常用的內(nèi)源熒光探針。對(duì)蝦在干制過程中肌原纖維蛋白的熒光光譜如圖6所示，可以看到新鮮蝦的肌原纖維蛋白在343 nm波長(zhǎng)處顯示出最高的熒光強(qiáng)度，水煮后熒光強(qiáng)度略有降低。然而當(dāng)進(jìn)行熱風(fēng)干制時(shí)，熒光強(qiáng)度大幅度降低，并且隨著干制時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，這表明干制促進(jìn)蛋白質(zhì)變性，引起疏水性殘基暴露，巰基氧化形成二硫鍵，從而使分子間作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)發(fā)生再聚集，導(dǎo)致暴露出的色氨酸殘基重新被包裹，進(jìn)而導(dǎo)致熒光猝滅。另外，疏水鍵是表征蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)作用力，其含量越高表明蛋白質(zhì)的變性程度越大。如圖4所示，疏水鍵的相對(duì)含量在干制過程中逐漸上升，肌漿蛋白的構(gòu)象向不穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變，同時(shí)證明蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖6 對(duì)蝦熱風(fēng)干制過程內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化Fig.6 Changes in endogenous fluorescence intensity of proteins in shrimp during hot air drying

2.2.6 蝦熱風(fēng)干制過程肌原纖維蛋白組成的變化

肌原纖維蛋白的特征條帶包括肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）（220 kDa）、α-肌動(dòng)蛋白（94 kDa）、肌鈣蛋白（75 kDa）、肌動(dòng)蛋白（43 kDa）、原肌球蛋白（36 kDa）和肌球蛋白輕鏈（＜20 kDa）[33-34]。對(duì)蝦肌原纖維蛋白的分子質(zhì)量在干制過程中的變化如圖7所示，鮮蝦的分子質(zhì)量條帶較多，存在聚集的現(xiàn)象，表明未經(jīng)任何處理的鮮蝦樣品中蛋白質(zhì)成分較完整。當(dāng)樣品進(jìn)行水煮處理后，MHC條帶和α-肌動(dòng)蛋白條帶消失，肌鈣蛋白和肌動(dòng)蛋白條帶明顯變淺，而原肌球蛋白條帶明顯加深，并且23 kDa處出現(xiàn)明顯條帶，表明加熱處理使MHC和α-肌動(dòng)蛋白破壞降解，肌鈣蛋白發(fā)生降解生成肌鈣蛋白I（23 kDa）。隨干制時(shí)間的延長(zhǎng)，肌鈣蛋白和肌動(dòng)蛋白條帶逐漸變淺，是因?yàn)楦芍剖乖摲肿淤|(zhì)量的蛋白片段發(fā)生降解；而原肌球蛋白、肌鈣蛋白I和肌球蛋白輕鏈條帶明顯加深，是因?yàn)榇蠓肿拥鞍装l(fā)生降解聚集，生成了一些分子質(zhì)量小的蛋白片段。隨干制時(shí)間的延長(zhǎng)，10 kDa附近處的蛋白質(zhì)條帶加深，這可能是蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的小分子肽。電泳結(jié)果結(jié)合TCA-可溶性肽含量從0.56 μmol/g（鮮樣）增加至0.91 μmol/g（干燥終點(diǎn)）的結(jié)果綜合證明了大部分蛋白質(zhì)對(duì)加熱處理都不具耐受性，熱風(fēng)干制會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦中蛋白質(zhì)降解。

圖7 蝦熱風(fēng)干制過程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.7 Changes in SDS-PAGE pattern of myofibrillar in shrimp during hot air drying

2.3 蛋白質(zhì)與品質(zhì)變化的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步確定熱風(fēng)干制過程中對(duì)蝦品質(zhì)變化與蛋白質(zhì)的相關(guān)關(guān)系，對(duì)蛋白質(zhì)變化指標(biāo)（總巰基、蛋白羰基、TCA-可溶性肽、離子鍵、氫鍵、疏水鍵、二硫鍵、α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲水平）與品質(zhì)特征（L*值、a*值、b*值、硬度、黏附性、彈性、膠黏性和咀嚼性）進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析。由圖8可知，蛋白質(zhì)變化指標(biāo)與色澤和質(zhì)構(gòu)特性存在高度相關(guān)性。其中總巰基含量與顏色（L*、a*、b*值）存在顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為－0.91、－0.81和－0.84，氫鍵相對(duì)含量與L*、a*和b*值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），二硫鍵相對(duì)含量與L*、a*和b*值存在顯著正相關(guān)（P＜0.01，P＜0.001），相關(guān)系數(shù)分別為0.94、0.85和0.88，同時(shí)，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量與L*、a*和b*值存在顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05，P＜0.01）。干制過程中蛋白巰基基團(tuán)被氧化并暴露生成二硫鍵，并且干制使肌紅蛋白發(fā)生氧化，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)品顏色發(fā)生改變。并且對(duì)蝦經(jīng)過熱處理和較長(zhǎng)時(shí)間的干制，蛋白質(zhì)穩(wěn)定的狀態(tài)被破壞，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由較為穩(wěn)定的α-螺旋向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致其理化特性和功能特性改變，造成了劇烈的體積收縮和水分流失。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)不斷降解，生成更多的多肽和氨基酸，這些降解產(chǎn)物能夠參與美拉德反應(yīng)，伴隨著蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化程度的加深，導(dǎo)致對(duì)蝦的顏色發(fā)暗、發(fā)黃。

圖8 對(duì)蝦在干制過程中蛋白質(zhì)變化與品質(zhì)變化相關(guān)性分析的熱圖Fig.8 Heatmap showing the correlation between changes in protein characteristics and quality changes of shrimp during drying

對(duì)蝦中富含豐富的蛋白質(zhì)，其質(zhì)構(gòu)特性的變化很大程度上取決于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。由圖8可知，蛋白羰基含量與硬度、膠黏性和咀嚼性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.88、0.92和0.87，TCA-可溶性肽含量與硬度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），離子鍵、疏水鍵、α-螺旋和無規(guī)卷曲相對(duì)含量與膠黏性的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到－0.85、0.88、0.85和0.84，在干制過程中蝦肌肉蛋白發(fā)生降解，蛋白質(zhì)內(nèi)部及蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)，增強(qiáng)了肌原纖維結(jié)構(gòu)，使肌肉組織硬度增加。并且干制過程導(dǎo)致疏水相互作用力和二硫鍵不斷增強(qiáng)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在一定程度上促進(jìn)了硬度、咀嚼性的增加。Rodrigues等[35]在研究巴西淡水魚的質(zhì)構(gòu)特性與TCA-可溶性肽含量的相關(guān)性時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。由此可見蝦在干制過程中蛋白質(zhì)氧化主要影響色澤變化，蝦肉的質(zhì)構(gòu)特性與蛋白質(zhì)降解和變性關(guān)系更密切。

3 結(jié) 論

本研究深入分析了南美白對(duì)蝦在熱風(fēng)干制過程中蛋白質(zhì)變化和對(duì)蝦品質(zhì)的變化規(guī)律，并分析了二者的相關(guān)關(guān)系。干制過程中，蝦的L*、a*和b*值逐漸下降，干燥終點(diǎn)時(shí)硬度、膠黏性和咀嚼性分別明顯增加至344.78 N，45.01 mJ和116.50 mJ；表征蛋白質(zhì)氧化的總巰基含量逐漸降為0.36 μmol/g，而羰基含量上升至2.03 nmol/mg，證明干制誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化變性；TCA-可溶性肽含量升至0.91 μmol/g，SDS-PAGE中MHC、α-肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白條帶消失，肌鈣蛋白條帶明顯變淺，證明干制導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解；干制過程蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生改變，肌肉蛋白的空間結(jié)構(gòu)變小，形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離子鍵和氫鍵相對(duì)含量分別顯著降低至11.62%和9.23%，疏水鍵與二硫鍵相對(duì)含量分別增加至18.97%和28.94%；同時(shí)利用拉曼光譜特征峰解析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，通過分析α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的相對(duì)含量，驗(yàn)證了α-螺旋向β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，證明了干制過程蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)由規(guī)整向松散轉(zhuǎn)化。色氨酸的熒光強(qiáng)度隨干制時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱，反映出蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果證明蛋白質(zhì)氧化與顏色變化有關(guān)，蛋白質(zhì)降解變性顯著影響蝦的質(zhì)構(gòu)特性。綜上，本研究結(jié)果可為評(píng)價(jià)干制加工對(duì)水產(chǎn)品品質(zhì)的影響提供理論依據(jù)，通過探究蛋白質(zhì)變性規(guī)律與品質(zhì)變化的關(guān)聯(lián)機(jī)制，可為提高產(chǎn)品質(zhì)量提供理論支撐。