宓 偉，于 敏，李 寧，石塔拉，陳彩云,*

（1.濱州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003）

血脂異常俗稱高脂血癥，是一種以血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平升高，或伴有高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平降低的代謝性疾病，是誘發(fā)心腦血管疾病的主要因素[1]。2020年中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告指出，我國(guó)成年人血脂異常的總患病率為40.40%，其中低密度脂蛋白血癥患病率最高，為33.90%，這將導(dǎo)致2010—2030年間我國(guó)心血管疾病患者增加約920萬(wàn) 人[2]。他汀類、貝特類、煙酸類藥物等是治療高脂血癥療效確切的西藥，但肝功能異常、橫紋肌溶解癥等副作用較多[3-5]。山楂原花青素（hawthorn procyanidins，HPC）是由表兒茶素和兒茶素縮合而成的一種來(lái)源于山楂的低聚體多酚化合物，山楂鮮果中原花青素的含量高達(dá)4 mg/g，其抗氧化活性遠(yuǎn)高于來(lái)源于葡萄籽、松樹皮等的高聚體原花青素，HPC可用乙醇溶劑萃取法、大孔吸附樹脂層析法等提取和純化，已被充分開發(fā)應(yīng)用于食品、藥品和化妝品工業(yè)[6]。本課題組前期研究表明，HPC具有良好的抗腫瘤[7]、抗氧化[8]等生物活性，經(jīng)體內(nèi)外質(zhì)量評(píng)價(jià)已明確其有效的藥效濃度范圍。

作為脂質(zhì)代謝的調(diào)控中樞，經(jīng)活化的AMP激活蛋白激酶（AMP-activiated protein kinase，AMPK）直接磷酸化固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c），促使甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）磷酸化失活，使其下游的乙酰輔酶羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthese，F(xiàn)AS）表達(dá)量降低，肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶（carnitine palmitoyltransterase-1，CPT-1）和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）活性增強(qiáng)，從而加速脂肪酸氧化分解，抑制脂質(zhì)合成[9-13]。本研究采用高脂膳食誘導(dǎo)動(dòng)物模型，以非諾貝特為陽(yáng)性對(duì)照，探討HPC靶向作用于AMPK/SREBP-1c分子信號(hào)通路調(diào)控脂質(zhì)代謝的機(jī)制，為高脂血癥防治、尋找靶向天然植物藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

S P F 級(jí)S D 雄性大鼠6 0 只，8 周齡，體質(zhì)量240～290 g，購(gòu)自山東弘立醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCKX（魯）2021-0005。在無(wú)特定病原的條件下基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)。本研究得到濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)（202108-005）。

基礎(chǔ)飼料、高脂飼料（MCD002）均由江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司提供，總熱量比為23.0 kJ/g，脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)供能比分別為45.7%、35.8%、18.5%。

HPC（聚合度≥99%，批號(hào)：20200420） 杭州綠盛生物技術(shù)有限公司；非諾貝特膠囊（規(guī)格100 mg/粒，批號(hào)H44021454） 廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司；TG、TC、LDL-C和HDL-C試劑盒（貨號(hào)分別為20200201、20200104、20200308、20200509） 南京建成生物工程研究所；高效化學(xué)發(fā)光（efficient chemiluminescence，ECL）顯色試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RNA提取試劑盒（貨號(hào)分別為36208ES60、20201ES76、19221ES08）翌圣生物科技（上海）股份有限公司；高效RIPA裂解液、蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（貨號(hào)分別為R0010、G1120） 北京索萊寶科技有限公司；AMPK抗體、SREBP-1c抗體、GPAT1抗體、ACC抗體、FAS抗體、CPT1抗體和PGC-1α抗體（貨號(hào)分別為ab32047、ab133125、ab0059、ab185901、ab133619、ab189181、ab145641） 英國(guó)Abcam公司；phospho-AMPK（Thr172）抗體、GAPDH抗體、二抗羊抗兔IgG（貨號(hào)分別為AA393、AF006、AS118） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RG2000熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 澳大利亞Corbett公司；電泳轉(zhuǎn)膜儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Alphalmager HP凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Alpha Innotech公司；BX-26熒光顯微鏡日本Olympus公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)、DYY-12型凝膠電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組和給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白對(duì)照組（blank control group，BCG），高脂血癥模型組（hyperlipidemia m o d e l g r o u p，H M G），H P C 低、中、高劑量組（HPC-low-, medium- and high-dose groups，HPCLDG、HPC-MDG、HPC-HDG）、非諾貝特陽(yáng)性對(duì)照組（fenofibrate positive group，F(xiàn)PG），每組10 只。非諾貝特膠囊臨用前配制成4 mg/mL藥液。根據(jù)本課題組前期研究，稱取適量HPC以無(wú)水乙醇溶解，加入0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）生理鹽水（normal saline，NS）分別配制成質(zhì)量濃度為14、28、56 μg/mL的低、中、高劑量HPC溶液[14]。

BCG大鼠用基礎(chǔ)飼料（玉米73.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、麥麩20%、魚粉5%、谷粉1%、食鹽0.5%）喂養(yǎng)，其余各組用高脂飼料（普通飼料78.8%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、蛋黃粉10%、豬油10%）喂養(yǎng)。BCG和HMG大鼠以0.5% NS 0.02 g/（kgmb·d）灌胃。根據(jù)人體和大鼠體表面積換算，HPC低、中、高劑量組大鼠分別以HPC溶液0.14、0.28、0.56 g/（kgmb·d）灌胃。FPG大鼠以非諾貝特藥液0.04 g/（kgmb·d）灌胃。各給藥組高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)每天上午9∶00—9∶30灌胃給藥1 次，BCG和HMG同時(shí)間以0.5% NS灌胃1 次，連續(xù)給藥7 周。實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠的一般情況、飲食情況和精神狀態(tài)，每周稱量大鼠體質(zhì)量并記錄。給藥結(jié)束后大鼠眼眶取靜脈血分離血清，通過(guò)TG、TC、LDL-C和HDL-C水平判斷高脂血癥模型是否制備成功。

1.3.2 肝臟指數(shù)、血清及肝臟脂質(zhì)濃度檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，肌肉注射3 mL/kgmb20%氨基甲酸乙酯麻醉大鼠，用分析天平秤量大鼠體質(zhì)量，分離肝臟并稱量肝質(zhì)量，取大鼠部分肝臟，稱質(zhì)量后按下式計(jì)算肝臟指數(shù)。然后于大鼠腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min，離心機(jī)4 000 r/min離心10 min取上層血清；摘取大鼠肝臟，選擇距肝邊緣0.5 cm處相同部位的肝右葉組織，4 ℃下加入0.5% NS制成肝勻漿，按照試劑盒方法檢測(cè)大鼠血清和肝勻漿中TG、TC、LDL-C和HDL-C的濃度。

1.3.3 肝臟組織病理觀察

取部分肝組織，采用體積分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛溶液固定標(biāo)本，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切3 μm切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。大鼠肝臟組織病理變化由脂肪細(xì)胞空泡所占面積與總細(xì)胞所占面積之比計(jì)算。

1.3.4 大鼠肝臟組織相關(guān)指標(biāo)mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

取部分肝臟組織，分別裝于不同冷凍管，置于液氮中速凍后于超低溫冰箱冷凍備用。按試劑盒說(shuō)明書提取肝臟組織總RNA并合成cDNA，并選擇GAPDH作為內(nèi)參，通過(guò)熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性。本研究自行設(shè)計(jì)的AMPK、SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS、CPT-1和PGC-1α引物序列見表1。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.5 大鼠肝臟相關(guān)指標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)（Western blot法）

取各組大鼠肝組織，用BCA法檢測(cè)RIPA裂解液提取的蛋白濃度。在提取蛋白液中加入6%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）緩沖液，沸水變性5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）后濕移至聚偏二氟乙烯膜上，37 ℃封閉2 h，依次加入AMPK、p-AMPK、SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS、CPT1和PGC-1α 4 ℃過(guò)夜，漂洗后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫反應(yīng)2 h，滴加ECL試劑進(jìn)行檢測(cè)，并選擇GAPDH作為內(nèi)參，采用Quantity One軟件掃描各條帶，獲取目的蛋白灰度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，用±s表示；攝食量的變化采用重復(fù)測(cè)量方差分析；兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的再采用兩兩比較的q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPC對(duì)高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝的影響

2.1.1 各組大鼠的一般情況

實(shí)驗(yàn)中大鼠無(wú)死亡，BCG大鼠皮膚光潔，一般狀況和精神狀態(tài)良好。HMG大鼠毛色暗淡，不愛動(dòng)，飲食飲水量增加，大便小便增多，體質(zhì)量明顯增加。HPCMDG、HPC-HDG和FPG大鼠一般情況和精神狀態(tài)均有所改善，HPC-HDG的效果接近FPG。

如圖1所示，BCG大鼠攝食量總體趨于平穩(wěn)，與BCG比較，HMG大鼠攝食量極顯著增高（P＜0.01）；與HMG比較，HPC各劑量組和FPG大鼠攝食量有所下降，且HPC-HDG和FPG大鼠攝食量極顯著下降（P＜0.01），表明高劑量HPC能有效改善高脂血癥大鼠的攝食量。

圖1 各組大鼠攝食量的變化（n＝10）Fig.1 Changes in food intake of rats from all groups (n = 10)

2.1.2 各組大鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)變化

如表2所示，造模7 周后，與BCG比較，HMG大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。與HMG比較，HPC-MDG、HPC-HDG和FPG大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)均有不同程度降低（P＜0.05）。說(shuō)明HPC能夠降低高脂血癥大鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)，高劑量HPC效果更明顯。

表2 各組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)的比較（n＝10）Table 2 Comparison of body mass, liver mass and liver index of rats from all groups (n = 10)

2.1.3 各組大鼠血清脂質(zhì)濃度的變化

如表3所示，與BCG比較，HMG大鼠血清TG、TC和LDL-C濃度均極顯著升高，HDL-C濃度極顯著下降（P＜0.01）。與HMG比較，HPC-HDG和FPG大鼠血清TG、TC和LDL-C濃度極顯著下降，HDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01），且HPC對(duì)大鼠血清中脂質(zhì)濃度的影響有一定的劑量依賴性，說(shuō)明HPC能降低高脂血癥大鼠血清中的TG、TC、和LDL-C濃度，提高HDL-C濃度，使其各項(xiàng)異常指標(biāo)恢復(fù)正常，改善大鼠血脂紊亂。

表3 各組大鼠血清脂質(zhì)濃度的比較Table 3 Comparison of serum lipid contents of rats from all groups

2.1.4 各組大鼠肝臟勻漿脂質(zhì)濃度的變化

如表4所示，與BCG比較，HMG大鼠肝臟TG、TC和LDL-C濃度均極顯著升高，HDL-C濃度極顯著下降（P＜0.01）。與HMG比較，HPC-HDG和FPG大鼠肝臟TG、TC和LDL-C濃度極顯著下降，HDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01），且HPC對(duì)大鼠肝臟中脂質(zhì)濃度的影響有一定的劑量依賴性，表明HPC能改善大鼠肝勻漿中異常的脂質(zhì)水平，且高劑量HPC效果更明顯。

表4 各組大鼠肝臟脂質(zhì)濃度的比較Table 4 Comparison of liver lipid contents of rats from all groups

2.2 各組大鼠肝臟病理學(xué)組織變化觀察

如圖2所示，BCG大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)無(wú)異常。HMG大鼠肝臟出現(xiàn)重度彌漫性肝組織變性，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞體積增大，胞漿疏松，出現(xiàn)數(shù)量、大小不一的脂肪空泡，有一定的脂肪堆積。與HMG大鼠相比，HPC各劑量組預(yù)防性干預(yù)后，隨HPC劑量增加大鼠肝細(xì)胞脂肪變性逐漸改善。FPG大鼠肝細(xì)胞脂肪變性基本恢復(fù)正常，高劑量HPC與非諾貝特干預(yù)效果接近。

圖2 各組大鼠肝臟病理組織變化Fig.2 Histopathological examination of liver tissues of rats from all groups

2.3 各組大鼠肝臟AMPK mRNA和p-AMPK蛋白的相對(duì)表達(dá)量

如圖3所示，與BCG相比，HMG大鼠肝臟AMPKm R N A 和p-A M P K 蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著下降（P＜0.01）。與HMG比較，HPC-MDG、HPC-HDG和FPG大鼠肝臟AMPKmRNA和p-AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著上升（P＜0.01），高劑量HPC與非諾貝特效果相當(dāng)，表明HPC能使AMPK轉(zhuǎn)錄增加，并使AMPK發(fā)生磷酸化。

圖3 各組大鼠肝臟AMPK mRNA和p-AMPK蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of AMPK mRNA and relative expression of p-AMPK protein in liver tissues of rats from all groups

2.4 各組大鼠肝臟SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量

如圖4所示，與BCG相比，HMG大鼠肝臟SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高（P＜0.01）。與HMG比較，HPC-HDG和FPG大鼠肝臟SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著下降（P＜0.01），HPC-HDG效果與FPG相當(dāng)。結(jié)果表明經(jīng)HPC作用活化的AMPK進(jìn)一步通過(guò)分子通路使參與脂肪分解代謝的負(fù)調(diào)控因子SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平降低，促進(jìn)脂肪氧化分解代謝，抑制脂質(zhì)合成。

圖4 各組大鼠肝臟SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of SREBP-1c, GPAT1, ACC and FAS mRNA and protein in liver tissues of rats from all groups

2.5 各組大鼠肝臟CPT1、PGC-1α mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量

如圖5所示，與BCG相比，HMG大鼠肝臟CPT1、P G C-1 α m R N A 和蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01）。與HMG比較，HPC-HDG和FPG大鼠肝臟CPT1、PGC-1α mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高（P＜0.01），高劑量HPC和非諾貝特效果相當(dāng)。結(jié)果表明經(jīng)HPC活化的AMPK能促進(jìn)脂質(zhì)分解代謝正調(diào)控因子CPT1、PGC-1α的轉(zhuǎn)錄和翻譯，加速脂肪氧化分解，且具有劑量依賴性。

3 討 論

血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病的危險(xiǎn)因素[15]。在我國(guó)血脂異常的人群中，進(jìn)行降脂治療患者的僅占14.1%，其中能達(dá)到《2021 ESC心血管疾病預(yù)防指南》要求有效控制血脂的比例為26.6%[16]。臨床實(shí)踐中，使用他汀類、貝特類等降脂藥存在不耐受情況，并會(huì)加重肝臟負(fù)擔(dān)，因此尋找并研發(fā)作用于AMPK多靶點(diǎn)的天然植物藥是目前研究的熱點(diǎn)之一。

本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠建立高脂血癥動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，HMG大鼠攝食量、體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)均顯著或極顯著高于BCG大鼠（P＜0.05、P＜0.01），HMG大鼠血脂各項(xiàng)指標(biāo)均出現(xiàn)異常，造模結(jié)果與Li Hui等[17]研究結(jié)果一致；與HMG大鼠比較，HPC-HDG大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)均有不同程度的下降（P＜0.05），大鼠血清和肝臟勻漿的TG、TC、LDL-C濃度極顯著下降，而HDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明高劑量HPC可以明顯改善高脂血癥大鼠血脂代謝紊亂。肝臟病理學(xué)組織HE染色結(jié)果顯示，與BCG大鼠比較，HMG大鼠肝臟出現(xiàn)重度彌漫性肝組織變性，與HMG大鼠相比，HPC-HDG大鼠肝細(xì)胞脂肪變性基本恢復(fù)正常。

在脂質(zhì)代謝過(guò)程中，AMPK對(duì)多種代謝酶及轉(zhuǎn)錄因子起關(guān)鍵調(diào)控作用。AMPK廣泛存在于真核細(xì)胞中，是由α-、β-和γ-亞基構(gòu)成異源三聚體的一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[18-21]。激活的AMPK轉(zhuǎn)變成p-AMPK，直接磷酸化SREBP-1c的Ser372的識(shí)別位點(diǎn)使其轉(zhuǎn)錄能力下降，抑制下游FAS和TC合成酶的表達(dá)，減少脂質(zhì)合成[22-24]。GPAT1是催化TG合成的一種關(guān)鍵限速酶，AMPK能促進(jìn)線粒體外膜上的GPAT1磷酸化，降低其生物活性，導(dǎo)致脂肪酸氧化增加，減少脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)的累積[25-27]。ACC有ACC1和ACC2兩種異構(gòu)體，由于活化的AMPK可以使其磷酸化而失活，而失活的ACC1可抑制脂肪酸的從頭合成途徑，失活的ACC2可以提高CPT1的活性而促進(jìn)線粒體中脂肪酸的β-氧化分解[28-29]。

本研究結(jié)果顯示，與HMG比較，HPC-HDG和FPG大鼠肝臟AMPKmRNA和p-AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著上升（P＜0.01），SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著下降（P＜0.01），CPT1、PGC-1α mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果表明HPC可抑制SREBP-1c基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，從而抑制下游脂肪酸和膽固醇合成酶的表達(dá)，減少脂質(zhì)合成；同時(shí)，通過(guò)下調(diào)GPAT1表達(dá)以降低GPAT1活性，減少肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累。p-AMPK磷酸化ACC和FAS使兩者失活，而失活的ACC和FAS可阻止乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）羧化成丙二酰CoA，同時(shí)活化CPT1和PGC-1α，促進(jìn)脂肪酸β-氧化，抑制脂質(zhì)合成，減少肝臟脂質(zhì)生成，從而達(dá)到改善脂質(zhì)代謝紊亂的效果，與Zhang Zhiqin等[30]研究結(jié)果相符。

綜上所述，HPC能有效干預(yù)大鼠高脂血癥，并能在一定程度上逆轉(zhuǎn)脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)展，其作用機(jī)制可能與通過(guò)AMPK/SREBP-1c信號(hào)通路調(diào)控脂質(zhì)代謝、改善線粒體功能，從而減輕肝臟損傷密切相關(guān)。