王志新，劉丹丹，賈紫偉，黃玉清，寧亞維，賈英民*

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

蘋果、梨、桃等日常食用的水果營養(yǎng)豐富，但是水果在采收、包裝、運輸和貯藏過程中容易出現(xiàn)機械損傷[1]，加速病原真菌侵染果實[2]，導(dǎo)致水果腐爛變質(zhì)，采后階段新鮮水果腐爛造成的巨大經(jīng)濟損失已成為全球性問題[3-5]。其中，由擴展青霉引發(fā)的青霉病不但能導(dǎo)致果實腐爛，還會產(chǎn)生展青霉素、棒曲霉素、桔青霉素等致病毒素從而危害人類健康[6-8]。因此，防止水果被青霉菌侵染已成為果蔬貯藏中亟需解決的問題。

目前，對水果采后青霉菌侵染的防治方法主要包括化學(xué)防治（噻菌靈、嘧霉胺和咯菌腈等）、物理防治（低溫貯藏、熱處理、微波處理和臭氧法等）和生物防治（拮抗微生物）?；瘜W(xué)防治和物理防治會影響水果風(fēng)味，并會使病原菌產(chǎn)生耐藥性，同時還存在費用高、耗能大、不環(huán)保、不安全等問題。因此，亟需尋找安全、有效的防治措施來控制水果采后青霉菌的侵染。生物防治作為一種現(xiàn)代新興技術(shù)，受到社會各界的廣泛歡迎。

抗菌肽是廣泛存在于自然界中具有抗菌活性的小分子生物活性肽，一般由10～60 個氨基酸殘基組成，對細菌、真菌、癌細胞等具有較好的殺傷作用，其廣譜性、無耐藥性、高效性等優(yōu)勢使其成為炙手可熱的潛在替代抗生素的抑菌物質(zhì)[9-11]?；诖?，許多學(xué)者開展了對抗菌肽抑菌機理的深入研究，這些研究推動了抗菌肽在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域的發(fā)展[12]。

類芽孢桿菌是一種能產(chǎn)生抗性芽孢的好氧或兼性厭氧的桿狀細菌，可以用于植物和動物疾病的生物防治[13]。類芽孢桿菌廣泛分布于自然環(huán)境中，可以產(chǎn)生如多肽、環(huán)狀脂肽、細菌素和揮發(fā)物等多種抑菌化合物以及細胞壁降解酶[14-15]?，F(xiàn)已報道了多種具有抗性的類芽孢桿菌，如多粘類芽孢桿菌、愛媛類芽孢桿菌等，其中以多粘類芽孢桿菌居多。研究發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽對原生動物、酵母、真菌、病毒、癌細胞等具有殺傷作用[16]，且天然抗菌肽具有穩(wěn)定、無毒、耐藥、高效等優(yōu)點，已成為具有研究潛力的抑菌劑[17]。

愛媛類芽孢桿菌（Paenibacillus ehimensis）是一種具有拮抗作用的抗性菌株，其具有廣譜抑菌性，對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和病原真菌具有較好的抑制作用。Hong等[18]研究發(fā)現(xiàn)P.ehimensisRS820對引起番茄根部病害的植物病原線蟲具有顯著的生長抑制作用。Naing等[19]從土壤中分離得到一株P(guān).ehimensisKWN38，其產(chǎn)生的揮發(fā)性抑菌物質(zhì)以及幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、葡聚糖酶、蛋白酶能夠較好地抑制立枯絲核菌AG-1、尖孢鐮刀菌等植物病原真菌。Seo等[20]研究發(fā)現(xiàn)P.ehimensisMA2012分泌的幾丁質(zhì)酶對赤霉病菌孢子萌發(fā)具有較好的抑制作用。相比研究較多的粘類芽孢桿菌抗菌肽，對愛媛類芽孢桿菌抗菌肽的研究較少。Huang Zhaohui等[21]從P.ehimensisB7中分離出兩種陽離子脂肽抗菌肽PE1和PE2，其分子質(zhì)量分別為1 114 Da和1 100 Da，對病原細菌具有較好的抑制作用，如對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等致病菌均具有抑菌活性。Aktuganov等[22]從P.ehimensisIB-X-b代謝產(chǎn)物中分離純化出具有抗真菌活性的桿菌霉素L和fengycin、plipastatin、agrastatin家族的環(huán)狀脂肽。但目前鮮有關(guān)于愛媛類芽孢桿菌抗菌肽對擴展青霉抑制的研究報道。

本課題組前期從愛媛類芽孢桿菌HD中分離純化出具有廣譜抑菌性的抗菌肽，其對真菌抑制效果較好，且抑制作用高效、穩(wěn)定[23]。愛媛類芽孢桿菌經(jīng)過發(fā)酵后收集其發(fā)酵上清液，采用大孔樹脂吸附-解吸附法獲得抗菌肽的粗提液，進一步利用半制備高效液相色譜法進行抗菌肽的純化，獲得純度不低于98%的抗菌肽，命名為愛媛類芽孢桿菌抗菌肽ehimensin。本研究以采后水果常見的腐敗菌——擴展青霉作為指示菌，考察愛媛類芽孢桿菌抗菌肽對其抑菌活性，之后分別從孢子萌發(fā)、形態(tài)結(jié)構(gòu)、細胞壁、細胞膜、活性氧累積等方面探討抗菌肽對擴展青霉孢子的抑制機理，以期為水果采后防腐提供理論依據(jù)，并為新型天然果蔬保鮮劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擴展青霉（Penicillium expansum）CICC 40658由河北科技大學(xué)酶工程實驗室保存。

愛媛類芽孢桿菌抗菌肽ehimensin由本課題組制備，抗菌肽呈粉末狀，1 mg/mL抗菌肽溶液效價為22.5 AU/mL。

PDA、PDB培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；鉀結(jié)合性苯并呋喃間苯二甲酸（potassium-binding benzofuran isophthalate，PBFI）、3,3’-二丙基硫雜羰花青碘化物（3,3’-dipropylthiadicarbocyanine iodide，DiSC3(5)）、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH） 美國Sigma公司；SYTOX-Green、碘化丙啶（propidium iodide，PI）美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造公司；CX31顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；S-4800-I掃描電子顯微鏡、H-7650透射電子顯微鏡、F-7000熒光分光光度計 日本日立公司；Accuri C6 Plus流式細胞儀美國Becton Dickinson公司；Spectramax Plus 384酶標儀美谷分子儀器有限公司；3-18K高速冷凍離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 擴展青霉孢子懸液的制備

挑取1～2 環(huán)保藏的擴展青霉孢子，接種至PDA平板上，（25±1）℃培養(yǎng)7 d左右，輕輕刮取孢子，生理鹽水洗脫，無菌脫脂棉過濾，血球計數(shù)板計數(shù)，生理鹽水稀釋備用。

1.3.2 抗菌肽對擴展青霉最小抑菌濃度的測定

參照Park等[24]的方法，采用微量二倍稀釋法測定抗菌肽的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。使用PDB培養(yǎng)基在96 孔板中對抗菌肽進行二倍梯度稀釋，使其形成不同質(zhì)量濃度的抗菌肽，再加入等體積擴展青霉孢子懸液（終濃度1×104CFU/mL），并設(shè)置真菌生長孔和空白對照孔。置于25 ℃下培養(yǎng)24～48 h，以孔底無可見孢子生長的最低抗菌肽活力為MIC。實驗重復(fù)3 次。

1.3.3 抗菌肽對擴展青霉孢子的時間-殺菌曲線測定

分別向PDB培養(yǎng)基中添加抗菌肽，使其終質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2 MIC，以不加抗菌肽的培養(yǎng)基作為空白對照，標記為0 MIC，接種擴展青霉孢子懸液使其終濃度為1×104CFU/mL。25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4、6、8、10、12 h取樣，稀釋涂布，計算活菌數(shù)。以時間為橫坐標、菌落總數(shù)（lg（CFU/mL））為縱坐標繪制時間-殺菌曲線。

1.3.4 擴展青霉孢子萌發(fā)率的測定

參照韓玉竹等[25]的方法，取擴展青霉孢子懸液，離心、收集菌體，并用PDB培養(yǎng)基重懸至1×107CFU/mL，等體積添加至用PDB培養(yǎng)基稀釋的抗菌肽溶液中，使抗菌肽終質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1、2 MIC，混勻，將每個實驗組添加至單個凹形滑槽中，置于有濕棉絨的培養(yǎng)皿中，25 ℃下培養(yǎng)。10 h后用光學(xué)顯微鏡觀察，對不少于3 個視野和不少于200 個萌發(fā)和未萌發(fā)孢子進行計數(shù)，按照下式計算孢子萌發(fā)率。

1.3.5 擴展青霉孢子超微結(jié)構(gòu)觀察

取擴展青霉孢子懸液，收集菌體，用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，重懸至孢子濃度為1×107CFU/mL，等體積加入PBS稀釋的抗菌肽使其終質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1、2 MIC，作用12 h后用PBS洗滌3 次，制備掃描電子顯微鏡（5.0 kV、1 000×）和透射電子顯微鏡（80 kV、4 000×）樣品，進行超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.6 擴展青霉孢子細胞壁完整性的測定

參照王輝等[26]的方法，取擴展青霉孢子懸液離心收集菌體，并用PDB培養(yǎng)基重懸至1×107CFU/mL，添加抗菌肽使其終質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1、2 MIC，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，于0、2、4、8、10、24、36、48 h取樣，1 500 r/min離心10 min，取上清液，按照堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒測其AKP活力。

1.3.7 擴展青霉孢子細胞膜跨膜電勢的測定

參照Wang Zichao等[27]的方法，取孢子懸液，離心棄上清液，用含有10 mmol/L葡萄糖的Hepes緩沖液（5 mmol/L、pH 7.2）清洗并重懸。加入熒光探針DiSC3(5)（終濃度為2 μmol/L），30 ℃避光孵育15 min，離心棄上清液，用Hepes緩沖液清洗并重懸，加入KCl溶液（終濃度100 mmol/L）。1×107CFU/mL孢子懸液與等體積抗菌肽溶液混勻使其質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1、2 MIC，使用熒光分光光度計進行時間掃描（λex＝650 nm、λem＝672 nm），掃描時間為180 s。

1.3.8 擴展青霉孢子細胞膜滲透性的測定

取擴展青霉孢子懸液收集菌體，用Hepes緩沖液（5 mmol/L、pH 7.2）清洗并重懸，調(diào)整孢子懸液濃度為1×107CFU/mL，加入PBFI探針。孢子懸液與不同終質(zhì)量濃度（0、0.5、1、2 MIC）的抗菌肽溶液等體積混合作用30 min。在λex＝346 nm和λem＝505 nm條件下，使用熒光分光光度計測定熒光強度。

1.3.9 擴展青霉孢子細胞膜流動性的測定

取擴展青霉孢子懸液收集菌體，用生理鹽水清洗并重懸，制備濃度為1×107CFU/mL的擴展青霉孢子懸液，分別等體積加入含有不同質(zhì)量濃度抗菌肽的0.5%葡萄糖溶液，使抗菌肽的終質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1、2 MIC，25 ℃、150 r/min作用12 h。作用完成后4 ℃條件下離心并收集菌體，體積分數(shù)0.37%的甲醛溶液固定30 min后用50 mmol/L PBS（pH 7.0）洗滌兩次。菌體在－40 ℃冰箱中冷凍5 min，加入0.6 mmol/L DPH溶液解凍并重懸，28 ℃孵育45 min，用PBS（50 mmol/L、pH 7.0）洗滌重懸，使用熒光分光光度計測定熒光強度（λex＝350 nm、λem＝425 nm）。

1.3.10 擴展青霉孢子細胞膜完整性的測定

擴展青霉孢子懸液與抗菌肽作用處理同1.3.9節(jié)，之后6 000 r/min離心10 min，用生理鹽水洗滌，重懸。分別加入SYTOX-Green熒光染液和PI熒光染液，避光孵育30 min，再用生理鹽水洗滌重懸。前者使用熒光分光光度計測定熒光強度并用熒光顯微鏡觀察，后者使用流式細胞儀進行定量分析。

1.3.11 擴展青霉孢子活性氧的測定

擴展青霉孢子懸液與抗菌肽作用處理同1.3.9節(jié)，之后加入熒光染料DCFH-DA，30 ℃黑暗孵育20 min，PBS 洗滌重懸，在λex＝485 nm、λem＝530 nm條件下用熒光分光光度計測定熒光強度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均進行3 次平行，結(jié)果以平均值±標準差表示。數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件通過單因素方差分析法進行統(tǒng)計分析，利用Origin 8.0、Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽對擴展青霉孢子的抑菌活性

采用微量二倍稀釋法測定抗菌肽對擴展青霉孢子的抑制作用。其MIC為3.5 AU/mL。

通過時間-殺菌曲線進一步探究抗菌肽對擴展青霉的抑菌活性。由圖1可知，空白對照組（0 MIC）的孢子生長正常，菌體量穩(wěn)定在初始濃度；處理組隨著抗菌肽質(zhì)量濃度的增加，擴展青霉孢子數(shù)量減少。2 MIC處理組在作用1 h后對孢子開始表現(xiàn)出抑制作用，作用12 h后可以完全抑制孢子的生長，將孢子全部殺滅。

圖1 抗菌肽對擴展青霉孢子的時間-殺菌曲線Fig.1 Time-killing curves of the antimicrobial peptide on P.expansum spores

2.2 抗菌肽對擴展青霉孢子萌發(fā)的影響

如圖2、3所示，空白對照組（0 MIC）孢子的萌發(fā)率為100%，孢子全部萌發(fā)，且長出了較長的芽管。0.5 MIC抗菌肽對孢子產(chǎn)生了一定程度的抑制，萌發(fā)率為71.7%，與空白對照組相比降低28.3%（P＜0.05），且芽管長度變短。當(dāng)抗菌肽質(zhì)量濃度為1 MIC時，孢子萌發(fā)率發(fā)生了較大的變化，下降到15.43%，與空白對照組相比降低84.57%，且芽管生長長度較短；2 MIC處理組孢子萌發(fā)率為0%。

圖2 抗菌肽處理后擴展青霉的孢子萌發(fā)率Fig.2 Spore germination rate of P.expansum treated with the antimicrobial peptide

圖3 抗菌肽處理后擴展青霉孢子的生長狀態(tài)Fig.3 Growth state of P.expansum spores treated with the antimicrobial peptide

Zhu Congyi等[28]的研究表明，質(zhì)量濃度為0、400 μg/mL和600 μg/mL的單寧酸對指狀青霉孢子作用12 h后孢子萌發(fā)率分別為90%、61.4%、12.4%。單從孢子萌發(fā)率看，本研究中抗菌肽對擴展青霉孢子萌發(fā)率的影響趨勢與Zhu Congyi等[28]的研究結(jié)果一致，但Zhu Congyi等[28]發(fā)現(xiàn)被抑制萌發(fā)的指狀青霉孢子會出現(xiàn)腫脹，而本研究發(fā)現(xiàn)被抑制萌發(fā)的擴展青霉孢子會發(fā)生皺縮。孢子萌發(fā)過程中會先吸水膨脹然后長出芽管，本研究中抗菌肽對孢子萌發(fā)的抑制效果較強，2 MIC處理組能夠完全抑制孢子萌發(fā)，因此孢子未出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象；同時結(jié)合后續(xù)掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察結(jié)果可知，抗菌肽會使孢子出現(xiàn)凹陷、內(nèi)容物泄漏等現(xiàn)象。這些原因均導(dǎo)致本研究的結(jié)果不同于Zhu Congyi等[28]的研究。

2.3 抗菌肽對擴展青霉孢子超微結(jié)構(gòu)的影響

掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖4所示?？瞻讓φ战M（0 MIC）孢子表面較為飽滿、完整，且輪廓清晰，呈橢圓形。隨著抗菌肽質(zhì)量濃度的增加，孢子凹陷程度逐漸加劇，高質(zhì)量濃度處理組甚至出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，內(nèi)容物的泄漏量也在逐漸增多。此結(jié)果與其他研究者觀察到的抑菌現(xiàn)象相似，如鞠健[29]發(fā)現(xiàn)丁香酚和檸檬醛可以使婁地青霉和黑曲霉孢子表面發(fā)生褶皺、破裂、干癟。

圖4 掃描電子顯微鏡觀察抗菌肽對擴展青霉孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of the antimicrobial peptide on the morphological structure of P.expansum spores examined by SEM

透射電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖5所示?？瞻讓φ战M（0 MIC）孢子的細胞壁和細胞膜較完整且表面輪廓清晰，細胞質(zhì)分布均勻。與空白對照組相比，1 MIC抗菌肽處理后的孢子表面形態(tài)發(fā)生了變化，細胞質(zhì)稀薄且內(nèi)容物出現(xiàn)泄漏。2 MIC抗菌肽處理的擴展青霉孢子細胞變形嚴重，質(zhì)壁分離現(xiàn)象明顯，細胞質(zhì)密度嚴重降低。da Rocha Neto等[30]研究發(fā)現(xiàn)水楊酸作用擴展青霉孢子后其質(zhì)膜產(chǎn)生內(nèi)陷，細胞質(zhì)紊亂，與本研究結(jié)果相似。綜上，對孢子超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果表明抗菌肽會使擴展青霉孢子發(fā)生形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。

圖5 透射電子顯微鏡觀察抗菌肽對擴展青霉孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of the antimicrobial peptide on the morphological structure of P.expansum spores examined by TEM

2.4 抗菌肽對擴展青霉孢子細胞壁完整性的影響

AKP位于細胞壁和細胞膜之間，當(dāng)菌體細胞壁完整性被破壞，AKP會從菌體中釋放到體外，故可通過測定AKP的活力來判斷抗菌肽對細胞壁通透性的影響。由圖6可知，與空白對照組（0 MIC）比較，處理組的AKP活力高于空白對照組，可見，抗菌肽對擴展青霉孢子細胞壁具有一定的破壞作用。王輝等[26]發(fā)現(xiàn)檸檬苦素作用黑曲霉后，處理組AKP含量高于空白對照組，表明檸檬苦素破壞了細胞壁的完整性。

圖6 抗菌肽對擴展青霉孢子AKP活力的影響Fig.6 Effect of the antimicrobial peptide on alkaline phosphatase activity of P.expansum spores

2.5 抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜跨膜電勢的影響

DiSC3(5)是一種親脂性熒光探針，進入細胞內(nèi)質(zhì)膜中會發(fā)生熒光猝滅，結(jié)構(gòu)完好的細胞中存在一定的跨膜電勢，當(dāng)細胞膜的通透性發(fā)生變化或離子通道受到影響時，膜電勢會消失，熒光染料會從細胞膜中釋放出來，導(dǎo)致熒光信號增強。如圖7所示，隨著抗菌肽質(zhì)量濃度的增加，熒光強度逐漸增加。處理180 s時，空白對照組（0 MIC）熒光強度為70.91，0.5、1、2 MIC處理組抗菌肽的熒光強度分別增加至119.4、138.2、163.3。由此說明該抗菌肽會造成擴展青霉孢子細胞膜跨膜電勢降低，引起細胞膜去極化。

圖7 抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜跨膜電勢的影響Fig.7 Effect of the antimicrobial peptide on the transmembrane potential of P.expansum spores

2.6 抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜滲透性的影響

K＋對于平衡質(zhì)膜上的電荷至關(guān)重要，有助于維持細胞內(nèi)pH值和膜電位。當(dāng)擴展青霉細胞發(fā)生膜去極化時，K＋的連續(xù)流失會導(dǎo)致細胞死亡[31]。通過不具備膜滲透性的PBFI探針考察不同質(zhì)量濃度抗菌肽對擴展青霉鉀離子泄漏的影響，結(jié)果如圖8所示?？咕呐c擴展青霉孢子作用30 min后，處理組熒光強度顯著增加（P＜0.05），K＋泄漏量與抗菌肽的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。由此推測，抗菌肽能夠使擴展青霉孢子細胞膜的滲透性發(fā)生改變，導(dǎo)致K＋泄漏，膜功能受到破壞，加速細胞死亡。

圖8 抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜K 泄漏的影響Fig.8 Effect of the antimicrobial peptide on K+ leakage from P.expansum spores

2.7 抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜流動性的影響

DPH是一種用于研究膜脂流動性的熒光探針，可以與擴展青霉孢子的疏水區(qū)結(jié)合，而不會干擾脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，DPH的熒光強度可以用來衡量細胞膜磷脂雙分子層損傷的程度。如圖9所示，經(jīng)過0、0.5、1、2 MIC抗菌肽處理后，DPH的熒光強度分別為1 547.67、1 110.00、612.07和388.80；隨著抗菌肽質(zhì)量濃度的增加，DPH熒光強度顯著降低（P＜0.05），說明抗菌肽破壞了擴展青霉孢子細胞膜的流動性。Lee等[32]的研究表明，合成的雜合肽作用于白色念珠菌后，DPH的熒光強度顯著降低，說明雜合肽影響了白色念珠菌細胞膜的結(jié)構(gòu)功能。

圖9 抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜流動性的影響Fig.9 Effect of the antimicrobial peptide on the cell membrane fluidity of P.expansum spores

2.8 抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜完整性的影響

SYTOX-Green熒光染料不具有膜滲透性，只有在膜完整性受損或者形成孔洞時，其可以與細胞核結(jié)合，在一定條件下發(fā)出綠色熒光。結(jié)合圖10和圖11可見，抗菌肽作用后的孢子熒光強度顯著增加，說明該抗菌肽會使擴展青霉孢子細胞膜的完整性受損?？瞻讓φ战M（0 MIC）熒光強度在130左右，在熒光顯微鏡下看不到綠色。0.5、1、2 MIC處理組孢子熒光強度分別為373、437和527。隨著抗菌肽質(zhì)量濃度的增加，呈綠色熒光的孢子比例增加，熒光強度逐漸增大，說明孢子的膜受損率增加。Han Yuzhu等[33]研究發(fā)現(xiàn)P852肽作用尖孢鐮刀菌時，隨著P852劑量增加，細胞內(nèi)SYTOX-Green的綠色熒光信號強度也相應(yīng)增加。

圖10 熒光分光光度計分析抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜完整性的影響Fig.10 Effect of the antimicrobial peptide on the integrity of spore cell membrane of P.expansum analyzed by fluorescence spectrophotometry

圖11 熒光顯微鏡觀察抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜完整性的影響Fig.11 Effect of the antimicrobial peptide on the integrity of spore cell membrane of P.expansum analyzed by fluorescence microscopy

如圖12所示，空白對照組（0 MIC）的PI沾染率為3.3%，0.5、1、2 MIC處理組PI沾染率分別為7.7%，26.7%和73.3%。隨著抗菌肽質(zhì)量濃度的增加，PI的沾染率增加，說明抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜具有破壞作用，且與抗菌肽質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性。該結(jié)果與SYTOXGreen熒光染色結(jié)果趨勢一致，進一步驗證了抗菌肽會破壞擴展青霉孢子的細胞完整性。

圖12 流式細胞術(shù)分析抗菌肽對擴展青霉孢子細胞膜的影響Fig.12 Flow cytometry analysis of the effect of the antimicrobial peptide on the cell membrane of P.expansum spores

2.9 抗菌肽對擴展青霉孢子胞內(nèi)活性氧的作用

如圖13所示，隨著抗菌肽質(zhì)量濃度的升高，DCFH-DA熒光強度逐漸增大?？瞻讓φ战M（0 MIC）與0.5 MIC抗菌肽處理組DCFH-DA熒光強度差異不顯著，但與1 MIC和2 MIC處理組之間有顯著性差異（P＜0.05）。說明抗菌肽影響了擴展青霉孢子中活性氧的積累，從而抑制了擴展青霉孢子正常的生長繁殖。

圖13 抗菌肽對擴展青霉孢子胞內(nèi)活性氧的影響Fig.13 Effect of the antimicrobial peptide on intracellular ROS accumulation in P.expansum spores

3 討 論

新鮮水果在每年采后階段的腐爛是全球性的問題，真菌是導(dǎo)致水果腐爛最大的微生物群體。大量化學(xué)試劑的使用讓許多腐敗真菌產(chǎn)生了耐藥性。因此，自然界中無毒害且高效的新型生物抗真菌劑成為了熱點研究方向，其中抗菌肽在應(yīng)對真菌防治方面受到了極大關(guān)注?？咕淖鳛樾滦鸵志镔|(zhì)，其對細菌的抑菌機理報道較多，而對青霉菌的抑制機理報道較少。擴展青霉作為常見的采后水果腐敗菌，其生長會導(dǎo)致水果腐爛變質(zhì)，產(chǎn)生的展青霉素會危害人體健康，而且被展青霉素侵染的果制品難以根除其污染，因此要從根本上避免采后水果被青霉菌侵染。

本研究以新型的抑菌物質(zhì)抗菌肽作為抑菌劑，探究其對引起水果腐敗的常見病原菌——擴展青霉的抑菌作用。結(jié)果表明，經(jīng)0.5、1、2 MIC抗菌肽處理后，擴展青霉孢子的萌發(fā)率分別為71.7%、15.43%和0%。張晨等[34]發(fā)現(xiàn)當(dāng)蜜環(huán)菌發(fā)酵液濃度為MIC時，鏈格孢霉菌孢子萌發(fā)率為19.01%。Hu Fei等[35]研究發(fā)現(xiàn)丁香和肉桂精油能夠顯著抑制黑曲霉、米曲霉、赭曲霉孢子的萌發(fā)，且呈劑量依賴性；丁香精油對這3 種真菌孢子的MIC為0.25 mg/mL，其孢子萌發(fā)率在80%～90%之間。對比已有的報道，本研究中的抗菌肽對指示菌孢子萌發(fā)具有較好的抑制作用。孢子有堅實的孢子壁和皮層，孢子的破壞程度能反映抗菌肽對孢子的抑制效果。通過透射電子顯微鏡與掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著抗菌肽質(zhì)量濃度的增加，孢子破損嚴重。由此表明抗菌肽對擴展青霉具有良好的抑制效果。不同質(zhì)量濃度的抗菌肽在較長時間內(nèi)對擴展青霉孢子能持續(xù)發(fā)揮抑菌作用，且抑制效果與抗菌肽濃度呈正相關(guān)。該結(jié)果與Wang Kairong等[36]報道的抑菌肽polybia-CP的抑菌效果相似。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步開展了抗菌肽對擴展青霉孢子抑菌機理的研究。

細胞壁是維持細胞正常形態(tài)的重要組成部分，是免受外界因素干擾的第一道屏障，也是對物質(zhì)運輸起到很好傳遞作用的媒介。本研究中，抗菌肽可使擴展青霉孢子的AKP從菌體中釋放到體外，由此可知其對擴展青霉孢子細胞壁完整性有一定破壞作用。

細胞膜能夠維持病原菌細胞形態(tài)和正常生理功能，位于細胞外部環(huán)境與胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的界面位置是環(huán)境脅迫下破壞的主要目標，也是應(yīng)激條件的傳感器[18-19,37]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可影響擴展青霉孢子的細胞膜流動性，并且使其電勢消散，引起細胞膜去極化。細胞膜去極化將通過質(zhì)膜電壓門控鈣離子通道和其他未知轉(zhuǎn)運體誘導(dǎo)鈣離子攝取，從而誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞程序性死亡[38]。Choi等[31]也通過熒光分光光度計測定DiSC3(5)熒光強度的變化來評估陽離子抗菌劑聚六亞甲基胍鹽酸鹽對白色念珠菌細胞膜的損傷，結(jié)果表明聚六亞甲基胍鹽酸鹽能夠有效消散膜電位，這是因為質(zhì)膜上形成了孔洞，大量的離子發(fā)生轉(zhuǎn)移導(dǎo)致。本研究中的抗菌肽在導(dǎo)致細胞膜去極化的同時，還改變了細胞膜的滲透性，使K＋發(fā)生泄漏。K＋滲透和細胞內(nèi)的滲透壓失衡反過來會導(dǎo)致細胞內(nèi)細胞器的破壞和細胞收縮，進而導(dǎo)致細胞死亡[39]。

通過對擴展青霉孢子進行SYTOX-Green和PI染色發(fā)現(xiàn)，隨著抗菌肽質(zhì)量濃度的增加，SYTOX-Green熒光強度逐漸升高，PI沾染率也在不斷增加?？梢娍咕臅茐臄U展青霉孢子細胞膜的完整性。觀察擴展青霉孢子的超微結(jié)構(gòu)也進一步驗證了抗菌肽會破壞細胞膜的完整性，使細胞的形態(tài)發(fā)生改變、內(nèi)容物泄漏。微生物細胞膜的完整性會直接影響細胞的生長繁殖，當(dāng)細胞膜被破壞時，就會擾亂能量與信息傳遞，從而使微生物生長受到抑制甚至死亡[20]。

活性氧是真菌細胞凋亡的一個主要介導(dǎo)因素。正常情況下，細胞內(nèi)部和線粒體基質(zhì)中有完善的抗氧化防御體系，能夠保持活性氧在一個比較低的生理濃度。在病理情況下，活性氧產(chǎn)生過多，會氧化細胞內(nèi)的生物大分子，損傷細胞和線粒體，誘導(dǎo)細胞凋亡。DCFH-DA是一種可以檢測胞內(nèi)活性氧積累情況的探針，本身沒有熒光，其進入細胞后，可以被細胞膜內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不會通過細胞膜，容易聚集在細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的活性氧能夠氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，綠色熒光強度與活性氧的水平成正比。Wei Qinghui等[40]的研究表明白屈菜紅堿處理會明顯影響稻曲病菌孢子細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，并且白屈菜紅堿以劑量依賴性方式誘導(dǎo)活性氧積累。王楚[41]發(fā)現(xiàn)經(jīng)丙酮酸乙酯處理過的草酸青霉和葡萄孢屬孢子中出現(xiàn)了活性氧積累，進而誘導(dǎo)胞體氧化損傷。本研究也得到了相似的結(jié)果，經(jīng)抗菌肽處理的擴展青霉孢子中出現(xiàn)了活性氧的累積，從而抑制擴展青霉孢子正常的生長繁殖。

4 結(jié) 論

愛媛類芽孢桿菌抗菌肽對擴展青霉孢子具有良好的抑菌效果，可以抑制孢子萌發(fā)，對細胞壁完整性有一定破壞作用。愛媛類芽孢桿菌抗菌肽對擴展青霉孢子的抑制靶點主要為細胞膜?？咕钠茐牧思毎さ耐暾?，使細胞的形態(tài)發(fā)生改變、內(nèi)容物泄漏；消散了擴展青霉孢子的跨膜電勢；增加了細胞膜的滲透性，造成K＋泄漏；增加了細胞膜的流動性?？咕淖饔糜跀U展青霉孢子的另一個靶點是活性氧，抗菌肽使擴展青霉孢子中活性氧積累，影響其正常的生長代謝，從而抑制擴展青霉孢子正常的生長繁殖。本研究可為水果采后保鮮貯藏方面的應(yīng)用提供一定的參考，并為水果病害的安全、高效防治提供理論依據(jù)。