劉嘉璇，陳月星，2，黃金輝，李立丹

（1.商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000；2.陜西省秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術研究院，陜西 商洛 726000；3.商洛市煙草公司洛南分公司，陜西 商洛 726000；4.商洛市煙草公司，陜西 商洛 726000）

煙草（Nicotiana tabacumL.） 屬于茄科煙草屬，一年生或有限多年生草本植物，是我國重要的經(jīng)濟作物之一，廣泛分布于云南、湖南、陜西、河南等地[1]。每年煙草葉片被采集后，產(chǎn)生大量的秸稈未得到有效利用，一般情況下，煙草秸稈被堆棄田間或直接焚燒，不僅污染空氣，而且造成資源的嚴重浪費[2-4]。木聚糖（C5H8O4） 是一種存在于植物細胞壁中的異質(zhì)多糖，是除了纖維素以外植物體中含量最豐富的天然多糖，占植物細胞干質(zhì)量的15%～35%[5-6]。木聚糖具有增強免疫力、抗氧化等多種生理功能[7-10]，被廣泛應用于化工、保健等領域。基于此，擬以煙草秸稈為原料，采用堿法提取煙草秸稈中的木聚糖，并進一步應用響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，為煙草秸稈的再利用提供一定的研究思路和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

材料：煙草秸稈，陜西省商洛市煙草公司提供。

試劑：木聚糖標準品、鹽酸、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、濃硫酸等試劑均為分析純。

儀器：SI-234 型電子天平，北京有限公司產(chǎn)品；YB-500A 型粉碎機，永康市速鋒工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；R-501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海一科儀器有限公司產(chǎn)品；7225B 型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；DZF-6020 型真空干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

將煙草秸稈洗凈干燥（45 ℃） 后粉碎，稱取一定量干燥的煙草秸稈粉末并在65 ℃條件下進行脫脂（氯仿∶甲醇= 1∶1），過濾棄去濾液，將脫脂后的粉末在105 ℃條件下烘干備用。

1.2.2 木聚糖的提取

稱取一定量的脫脂煙草秸稈粉末，用不同濃度的氫氧化鈉溶液浸提不同時間，真空抽濾，調(diào)節(jié)濾液的pH 值至5.0 左右，真空濃縮，加入4 倍體積的95%乙醇進行醇沉（4 ℃冰箱儲存過夜），將樣液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心15 min 得到沉淀并烘干，得到粗木聚糖[7-8]。

1.2.3 木聚糖標準曲線

準確稱取10 mg 木聚糖標準品至10 mL 容量瓶中，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標準木聚糖溶液，分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 置于20 mL試管中，加入蒸餾水2 mL，然后加入3,5 - 二硝基水楊酸（DNS） 溶液3 mL，在沸水浴中顯色5 min，然后在冷水中冷卻至室溫，加蒸餾水至刻度線，振蕩混勻后于波長540 nm 處測吸光度，以吸光度為縱坐標，木聚糖質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.4 木聚糖含量的測定

稱取干燥后的木聚糖粗品，加入適量的質(zhì)量分數(shù)為8%的H2SO4溶液，于100 ℃下水解2 h，用濃度為2 mol/L 的氫氧化鈉溶液中和過濾，定容至100 mL，采用DNS 法測還原糖含量。木聚糖提取率的計算方法如下：

式中：C——木聚糖測定的質(zhì)量濃度，mg/mL；

N——稀釋倍數(shù)；

0.9 ——木聚糖聚合系數(shù)；

m——原料的質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素試驗

控制其他條件一樣，分別研究氫氧化鈉質(zhì)量濃度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25），提取溫度（40，50，60，70，80 ℃），料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1 ∶25，1 ∶30），提取時間（3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 h），對煙草秸稈木聚糖提取率的影響，在相同條件下用紫外可見分光光度計檢測待測液的吸光度，數(shù)據(jù)分析得到木聚糖的提取率[9-11]。

1.2.6 響應面試驗

基于單因素試驗，根據(jù)Box-behnken 中心組合試驗設計原理，設置4 個自變量，以木聚糖的提取率Y為響應值，設計四因素三水平的響應面分析試驗，重復5 次中心試驗[12]。

1.2.7 最佳工藝驗證試驗

精確稱取煙草秸稈2.00 g（平行3 份），根據(jù)響應面分析軟件所得最佳工藝條件提取煙草秸稈的木聚糖含量，計算提取率，驗證該工藝的準確性。

2 結果與分析

2.1 木糖標準曲線

根據(jù)1.2.3 的方法，測出不同質(zhì)量濃度的木聚糖的吸光度A，用Excel 表格作線性回歸，得出標準曲線的線性方程Y=10.54X+0.066，相關系數(shù)R2=0.998 2，在0.01～0.05 mg/mL 范圍內(nèi)木糖質(zhì)量濃度和吸光度有良好線性關系。

木糖標準曲線見圖1。

圖1 木糖標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取時間對煙草秸稈木聚糖提取率的影響

在氫氧化鈉質(zhì)量濃度為0.20 g/mL，提取溫度為60 ℃，料液比1∶15 的條件下探究煙草秸稈提取率與提取時間的關系。結果表明，隨著提取時間的延長，煙草秸稈木聚糖提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而提取時間為4.5 h 時提取率最高，因此提取的最佳時間為4.5 h。

提取時間對煙草秸稈木聚糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取時間對煙草秸稈木聚糖提取率的影響

2.2.2 氫氧化鈉質(zhì)量濃度對煙草秸稈木聚糖提取率的影響

在提取時間4.5 h，提取溫度60 ℃，料液比1∶15 的條件下，探究煙草秸稈木聚糖提取率與氫氧化鈉質(zhì)量濃度的關系。結果表明，隨著氫氧化鈉質(zhì)量濃度的增加，煙草秸稈木聚糖提取率先增大后逐漸減少，當NaOH 質(zhì)量濃度為0.2 g/mL 時提取率最高。

氫氧化鈉質(zhì)量濃度對煙草秸稈木聚糖提取率的影響見圖3。

圖3 氫氧化鈉質(zhì)量濃度對煙草秸稈木聚糖提取率的影響

2.2.3 提取溫度對煙草秸稈木聚糖提取率的影響

控制條件料液比1∶15，氫氧化鈉質(zhì)量濃度0.20 g/mL，提取時間4.5 h，探究煙草秸稈木聚糖提取率與提取溫度的關系。結果表明，煙草秸稈木聚糖提取率隨著溫度的升高在上升，在70 ℃提取率達到25.12%；溫度繼續(xù)升高，煙草秸稈木聚糖提取率上升不大。

提取溫度對煙草秸稈木聚糖提取率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對煙草秸稈木聚糖提取率的影響

2.2.4 料液比對煙草秸稈木聚糖提取率的影響

在氫氧化鈉質(zhì)量濃度為0.20 g/mL，提取溫度為60 ℃，提取時間4.5 h 條件下，探究煙草秸桿木聚糖提取率與料液比的關系。結果表明，隨著料液比的增加，煙草秸稈木聚糖提取率明顯升高，而當料液比大于1∶15 時，煙草秸稈木聚糖提取率明顯下降，結果表明在料液比1∶15 時提取率最高。

料液比對煙草秸稈木聚糖提取率的影響見圖5。

圖5 料液比對煙草秸稈木聚糖提取率的影響

2.3 響應面Box-behnken 分析

響應面試驗因素與水平設計見表1，Box-behnken試驗設計見表2。

表1 響應面試驗因素與水平設計

表2 Box-behnken 試驗設計

以煙草秸稈的木聚糖提取率為響應值，采用Design Expert 8.0 軟件對各試驗因素進行回歸擬合，得到的回歸方程式為：

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

從響應面的方差分析可得模型的F檢驗結果p＜0.01，其差異有統(tǒng)計學意義；失擬度的F檢驗結果p＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。試驗數(shù)據(jù)與模型相符，模型能夠較好地反映試驗結果。表3 中顯示A、D、AB、AC、AD對木聚糖提取率影響顯著（p＜0.05）。B、A2、B2、C2、D2對木聚糖提取率影響極顯著（p＜0.01）。兩因素的交互作用可通過等高線的密集程度來判斷，等高線越密集，木聚糖提取量變化越大，交互作用越明顯。曲面越偏呈橢圓，交互作用越大。各因素對煙草秸稈中木聚糖提取率的影響程度為氫氧化鈉質(zhì)量濃度（B） ＞料液比（D） ＞提取時間（A） ＞提取溫度（C）。

提取時間與氫氧化鈉質(zhì)量濃度影響木聚糖提取的等高線（a） 及曲面圖（b） 見圖6。

圖6 提取時間與氫氧化鈉質(zhì)量濃度影響木聚糖提取的等高線（a） 及曲面圖（b）

由圖6（b） 可知，提取時間與氫氧化鈉質(zhì)量濃度的交互作用很強，因為曲面較陡，由圖6（a） 可知，當提取時間不變時，氫氧化鈉質(zhì)量濃度為0.15～0.20 g/mL 時可以達到較好的提取效果，當氫氧化鈉質(zhì)量濃度不變時，提取時間在4.5 h 條件下有較好的提取效果。氫氧化鈉質(zhì)量濃度的提取率曲面較提取時間曲面彎曲程度更大，因此氫氧化鈉質(zhì)量濃度比提取時間對木聚糖提取率的影響更重要。

提取溫度與提取時間影響木聚糖提取的等高線（a） 及曲面圖（b） 見圖7。

圖7 提取溫度與提取時間影響木聚糖提取的等高線（a） 及曲面圖（b）

由圖7（b） 可知，提取溫度與提取時間的交互作用顯著，由圖7（a） 可知，當提取時間不變時，提取溫度為60～80 ℃時可以達到較好的提取效果，當提取溫度不變時，提取時間在4.5 h 有較好的提取效果。提取時間的提取率曲面較提取溫度曲面彎曲程度更大，因此提取時間比提取溫度對木聚糖提取率的影響更重要。

提取時間與料液比影響木聚糖提取的等高線 （a） 及曲面圖（b） 見圖8。

圖8 提取時間與料液比影響木聚糖提取的等高線（a） 及曲面圖（b）

由圖8（b） 可知，提取時間與料液比的交互作用顯著，由圖8（a） 可知，當提取時間不變時，在1∶15 的料液比條件下可以達到較好的提取效果，當料液比不變時，提取時間為4.5 h 有良好的提取效果。料液比的提取率曲面較提取時間曲面彎曲程度更大，因此料液比比提取時間對木聚糖提取率的影響更重要。

2.4 條件優(yōu)化與驗證

響應面分析結果顯示最佳工藝條件為提取時間4.44 h，氫氧化鈉質(zhì)量濃度0.21 g/mL，提取溫度71.62 ℃，料液比1∶15.21。結合實驗室實際情況，按提取時間4.4 h，氫氧化鈉質(zhì)量濃度0.21 g/mL，提取溫度71.6 ℃，料液比1∶15，控制反應條件，平行3 次驗證試驗，煙草秸稈木聚糖提取率為26.27%，實際值和理論值25.94 %接近，相對誤差為1.3%，試驗模型很好地預測了實際值，試驗結果理想。

3 討論與結論

通過響應面方法對提取工藝進行優(yōu)化，得到的最佳工藝條件為提取時間4.4 h，氫氧化鈉質(zhì)量濃度0.21 g/mL，提取溫度71.6 ℃，料液比1∶15。預測煙草秸稈木聚糖最終提取率為25.94%。驗證試驗測得煙草秸稈木聚糖平均提取率為26.27%，試驗值與理論值的誤差為1.3%，該模型R2=0.967 8，說明該模型與試驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.913 2，說明回歸方程與試驗值具有高度擬合性，該模型可很好解釋響應值的變化，試驗的工藝條件提取木聚糖簡便快速、綠色環(huán)保、效率較高，可為進一步開發(fā)商洛地區(qū)的煙草秸稈資源提供參考。

在單因素試驗中，隨著提取時間的增加，煙草秸稈半纖維素（主要是木聚糖） 與其他物質(zhì)之間的共價鍵易被破壞，木聚糖完全溶解在堿液中，木聚糖提取率迅速提高，結果顯示提取率在4.5 h 后達到最高；而在高溫環(huán)境下容易產(chǎn)生大量的單糖[13]，因此4.5 h 為較合適的時間。隨著氫氧化鈉質(zhì)量濃度的增加，木聚糖更容易從煙草秸稈中提取出來，但氫氧化鈉質(zhì)量濃度不斷增加，木聚糖的結構容易被破壞，提取率降低。隨著溫度的升高，木聚糖分子和溶劑的動能增加，分子擴散加速，使原料充分溶脹，溫度繼續(xù)升高，木聚糖的提取率增加低于1%，但糖的水解、脫水作用增加，生成有害物質(zhì)，如糠醛等，顏色變深[14]，因此水浴溫度為70 ℃較為適宜。隨著料液比的增大，溶劑對木聚糖的溶解能力增強，但繼續(xù)增大料液比，木聚糖溶解速率達到了動態(tài)平衡，不再繼續(xù)溶出，單位體積溶劑的溶解量減少，提取率下降，因此1∶15 為合適的料液比。

試驗采用堿法提取，用響應面分析法優(yōu)化了提取時間、氫氧化鈉質(zhì)量濃度、提取溫度、料液比4 個工藝條件。在響應面法中，選擇合適的模型，并使用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計工具，多項式近似用于近擬每個因素與多因素試驗中指標之間的關系，得到的模型系數(shù)與調(diào)整系數(shù)相近且都大于0.9，說明模型建立比較好，分析函數(shù)的輪廓和響應面，并研究響應面和響應因子，因素與因素的關系。響應面法具有試驗少、周期短、回歸方程精度高等優(yōu)點，可以研究多個因素之間的相互作用的回歸分析方法。Box-behnken 設計可以評價指標和因素間的非線性關系，對試驗影響因素的研究比較全面，能夠準確反映提取過程的最優(yōu)條件，并能從圖形分析中找到最優(yōu)的試驗考查因子值，對非線性影響因素的預測更具指導性，具有較好的應用價值[15]。

木聚糖是植物秸稈中廣泛存在的化合物，資源開發(fā)的潛力很大，以煙草秸稈為原材料，采用響應面優(yōu)化的方法探索提取木聚糖的有利條件，并通過驗證試驗考查所得工藝條件的準確性，有利于資源的有效利用和環(huán)境保護，木聚糖的提取效率增加還可以為木寡糖的制備提供更多原料，制備出更多的加工產(chǎn)品，加速研究成果的轉(zhuǎn)換為經(jīng)濟效益，環(huán)境效益，有利于走一條可持續(xù)發(fā)展的道路。