趙 盼，張 瑞，張雅倫，范素芳，王 贊，郭麗敏*

（河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（特殊食品監(jiān)管技術(shù)），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050227）

嬰幼兒配方乳粉是在乳類中添加適量的維生素、礦物質(zhì)等，用物理方法制成，供嬰幼兒食用的產(chǎn)品[1]。生物素，又稱VH、輔酶R，分子式C10H16N2O3S，是水溶性B族維生素，可合成VC，用于脂肪和蛋白質(zhì)正常代謝，無(wú)法經(jīng)由人工合成[2-5]，它具有維持人體自然生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抵抗力、有助于脂肪代謝、預(yù)防白發(fā)和脫發(fā)、維持皮膚正常功能等作用。食品中生物素的檢測(cè)[6]通常使用生物法，近年來(lái)微生物法已成為食品安全國(guó)家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)，是嬰幼兒配方食品標(biāo)準(zhǔn)中指定的檢測(cè)方法，具有檢出限低[7]、精確度高等優(yōu)點(diǎn)。生物素是植物乳桿菌生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)素，在生物素測(cè)定培養(yǎng)基中，植物乳桿菌的生長(zhǎng)與待測(cè)試樣中生物素含量呈線性關(guān)系，利用這一特性，根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，即可計(jì)算出試樣中待測(cè)物質(zhì)的含量[2-3]。

由于檢測(cè)過(guò)程可能受方法、人員、樣品、量器、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、儀器設(shè)備及環(huán)境條件等的影響，容易造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)分散性。對(duì)檢測(cè)過(guò)程中可能存在的不確定度進(jìn)行評(píng)定，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，避免因?qū)嶒?yàn)人員操作及檢測(cè)方法的不足對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響，可得到更加真實(shí)、客觀的檢測(cè)結(jié)果[8-10]。本研究按照GB 5009.259—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物素的測(cè)定》，采用微生物法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中生物素含量，通過(guò)分析和評(píng)定實(shí)驗(yàn)中的不確定度來(lái)源，計(jì)算出測(cè)量值的擴(kuò)展不確定度，為嬰幼兒配方乳粉中生物素的檢測(cè)結(jié)果評(píng)定提供一定的指導(dǎo)，同時(shí)為生物法測(cè)定其他維生素的不確定度評(píng)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品A、B、C是從乳粉生產(chǎn)企業(yè)經(jīng)濕法工藝定制而成的不同生物素含量嬰幼兒配方乳粉。

生物素標(biāo)準(zhǔn)品（規(guī)格100 mg/瓶，純度99.9%）天津阿爾塔科技有限公司；生物素測(cè)定培養(yǎng)基（規(guī)格100 g/瓶） 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2700紫外分光光度計(jì)（精確度1 mg）日本島津公司；MIR-254低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋公司；HVE-50自動(dòng)高壓滅菌器 日本Hirayama公司；AC2-4S1生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）、生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.0 μg/mL）、生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 ng/mL）、標(biāo)準(zhǔn)使用液（Ⅰ：0.2 ng/mL，Ⅱ：0.1 ng/mL）分別按照GB 5009.259—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物素的測(cè)定》配制。

1.3.2 接種液的制備

按照GB 5009.259—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物素的測(cè)定》制備。

1.3.3 樣品前處理

分別稱取樣品A、B、C各10 份，精確至0.001 g，于250 mL錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)3%硫酸溶液100 mL，121 ℃水解30 min，冷卻后用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，轉(zhuǎn)到250 mL容量瓶中，用自制的超純水定容，充分混合。用濾紙過(guò)濾，棄去最初幾毫升。吸取濾液5 mL，加入約20 mL水，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8，轉(zhuǎn)至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，作為待測(cè)液備用。

1.3.4 檢測(cè)過(guò)程

取4 只試管，分別加入1、2、3、4 mL試樣待測(cè)液，補(bǔ)水至5 mL，加入5 mL生物素測(cè)定用培養(yǎng)基，混勻，121 ℃滅菌5 min，快速冷卻至室溫，在無(wú)菌操作條件（通過(guò)自動(dòng)高壓滅菌器滅菌，然后在生物安全柜操作）下，向每支測(cè)定管接種1 滴（約50 μL）接種液，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管未接種，空白和樣品空白除外。（37±1） ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h，獲得最大混濁度，再培養(yǎng)2 h透光率無(wú)明顯變化[11-12]。

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定試樣中生物素含量。

1.3.5 數(shù)學(xué)模型建立

試樣消化液中生物素的質(zhì)量濃度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定，試樣中生物素含量按式（1）計(jì)算。

式中：X為試樣中生物素的含量/（μg/100 g）；ρ為試樣中生物素質(zhì)量濃度平均值/（ng/mL）；f為樣液的稀釋倍數(shù)；m為稱取試樣質(zhì)量/g；100、1 000均為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)檢測(cè)過(guò)程對(duì)影響生物素檢測(cè)結(jié)果的各不確定度分量來(lái)源進(jìn)行分析評(píng)估，不確定度的來(lái)源主要有樣品重復(fù)性檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品稱量及稀釋制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、紫外分光光度計(jì)產(chǎn)生的不確定度等[7,13-16]。具體魚骨圖見(jiàn)圖1。

圖1 嬰幼兒配方乳粉中生物素檢測(cè)不確定度來(lái)源Fig.1 Sources of uncertainty in the detection of biotin in infant formula

2.2 不確定度評(píng)定

2.2.1 重復(fù)性檢測(cè)產(chǎn)生的不確定度urel（x）

樣品A、B、C分別測(cè)定10 次，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of sample repeatability testμg/100 g

按A類不確定度[17-20]，根據(jù)貝塞爾公式（2）計(jì)算重復(fù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差（s），2 次重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生的不確定度（u）按式（3）計(jì)算，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（urel）按式（4）計(jì)算。

式中：n表示測(cè)定次數(shù)。

樣品A重復(fù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差s（xA）=0.893 μg/100 g，重復(fù)性檢測(cè)產(chǎn)生的不確定度u（xA）=0.632 μg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（xA）=0.031 8。

樣品B重復(fù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差s（xB）=0.875 μg/100 g，重復(fù)性檢測(cè)產(chǎn)生的不確定度u（xB）=0.618 μg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（xB）=0.020 4。

樣品C重復(fù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差s（xC）=2.345 μg/100 g，重復(fù)性檢測(cè)產(chǎn)生的不確定度u（xC）=1.658 μg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（xC）=0.031 2。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度urel（C）

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度產(chǎn)生的不確定度urel（p）

根據(jù)生物素標(biāo)準(zhǔn)品證書，其純度為99.9%，擴(kuò)展不確定度為±0.5%，包含因子k＝2，取正態(tài)分布[21]，則由生物素標(biāo)準(zhǔn)品純度產(chǎn)生的不確定度按式（5）計(jì)算，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（6）計(jì)算。

2.2.2.2 天平稱量產(chǎn)生的不確定度urel（m）

用電子天平準(zhǔn)確稱取生物素標(biāo)準(zhǔn)品100.3 mg，不確定度主要來(lái)源于天平稱量，電子天平檢定證書給出的天平示值誤差（稱量范圍為0～50 g）為0.3 mg，產(chǎn)生的不確定度為u（m1），天平重復(fù)性為0.3 mg，產(chǎn)生的不確定度為u（m2），取均勻分布[15,17,22]，均按式（7）計(jì)算，天平稱量誤差產(chǎn)生的不確定度按式（8）計(jì)算，天平稱量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度按式（9）計(jì)算。

2.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液移取、定容產(chǎn)生的不確定度urel（c）

生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液移取、定容時(shí)產(chǎn)生的不確定度來(lái)源主要是使用的玻璃量器和液體體積膨脹[23-24]。標(biāo)準(zhǔn)溶液移取、定容使用250、500、1 000 mL容量瓶各1 次，100 mL容量瓶、1、5 mL分度吸量管各2 次，容量瓶、分度吸量管為A級(jí)，均計(jì)量檢定合格，根據(jù)JJG 196—2006《玻璃儀器檢定規(guī)程》查得容量允差[25]，歐盟分析化學(xué)中心認(rèn)為服從三角分配[26-29]，由玻璃器皿容量允差產(chǎn)生的相對(duì)不確定度按計(jì)算，詳見(jiàn)表2。

表2 玻璃量器產(chǎn)生的不確定度Table 2 Uncertainty arising from volumetric glassware

玻璃量器產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（10）計(jì)算。

實(shí)驗(yàn)室溫度變化介于（20±3） ℃，因溫度效應(yīng)導(dǎo)致的試液體積變化為±αVΔT，α為水的膨脹系數(shù)，在20 ℃時(shí)為2.1×10-4，溫度差ΔT為3 ℃，V為定容體積。最大允許誤差的不確定度服從矩形分布，按照B類評(píng)定，定容液體積膨脹產(chǎn)生的相對(duì)不確定度按式（11）計(jì)算。

全部定容液體積膨脹產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（12）計(jì)算。

標(biāo)準(zhǔn)溶液移取、定容產(chǎn)生的不確定度按式（13）計(jì)算。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度按式（14）計(jì)算。

2.2.3 樣品稱量及稀釋制備產(chǎn)生的不確定度urel（T）

2.2.3.1 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度urel（m）

樣品稱量產(chǎn)生的不確定度主要來(lái)源于天平稱量，樣品A、B、C稱樣量分別為2.500 4、1.500 0、1.000 4 g，天平稱量誤差產(chǎn)生的不確定度u（m）=0.244 9 mg，天平稱量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel（mA）=0.000 098，urel（mB）=0.000 163，urel（mC）=0.000 245（計(jì)算方法同2.2.2.2節(jié)）。

2.2.3.2 樣品稀釋制備產(chǎn)生的不確定度urel（V）

樣品稀釋制備產(chǎn)生的不確定度來(lái)源主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液移取、定容使用的玻璃量器和液體體積膨脹，其中使用250、100 mL容量瓶、5 mL分度吸量管各1 次，產(chǎn)生的不確定度按式（15）計(jì)算（計(jì)算方法同2.2.2.3節(jié)的玻璃量器）。

溫度波動(dòng)±3 ℃，因溫度波動(dòng)液體體積膨脹產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（16）計(jì)算。

樣品稀釋制備產(chǎn)生的相對(duì)不確定度按式（17）計(jì)算。

樣品稱量及稀釋制備產(chǎn)生的相對(duì)不確定度按式（18）計(jì)算。

計(jì)算得urel（TA）=0.002 19，urel（TB）=0.002 19，urel（TC）=0.002 20。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度urel（ρ）

用100 μg/mL生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其含量分別為0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 ng。實(shí)驗(yàn)采用8 個(gè)濃度水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，得出吸光度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 生物素標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表Table 3 Data for preparation of biotin standard curve

表3采用最小二乘法線性回歸求得R2=0.987 5，斜率B1=0.527 1，截距B0=0.163 9，回歸曲線方程為式（19）。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度按式（20）～（22）計(jì)算。

式中：SY/C為回歸曲線的強(qiáng)度測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)差；B0為截距；B1為斜率；Yij為儀器測(cè)得的吸光度（生物素含量為Ci時(shí)）；B0＋B1Ci為按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的理論吸光度（生物素含量為Ci時(shí)）；m為生物素含量點(diǎn)數(shù)；n為每個(gè)點(diǎn)測(cè)量次數(shù)；為標(biāo)準(zhǔn)系列管各管生物素含量的平均值/ng，Cj為標(biāo)準(zhǔn)系列管中各生物素含量/ng；Cx為樣品測(cè)試系列管中生物素含量的平均值/ng；p為樣品系列管測(cè)定次數(shù)[7,15,30]。

按照GB 5009.259—2016檢測(cè)各試樣測(cè)試管的吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得各試樣測(cè)試管中生物素含量，數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 試樣系列管中生物素含量Table 4 Results of determination of biotin contents in dilutions of three samples

樣品A標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度和相對(duì)不確定度分別按式（23）～（24）計(jì)算。

同理計(jì)算，樣品B標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度u（ρB）=0.016 12 ng，相對(duì)不確定度urel（ρB）=0.069 3，樣品C標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度u（ρC）=0.015 37 ng，相對(duì)不確定度urel（ρC）=0.059 1。

2.2.5 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

根據(jù)上述各相對(duì)不確定度分量，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel按式（25）計(jì)算，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u按式（26）計(jì)算，擴(kuò)展不確定度U按式（27）計(jì)算。

計(jì)算得：urel（A）=0.071 4，urel（B）=0.072 6，urel（C）=0.067 2。

計(jì)算得：u（A）=1.418 μg/100 g，u（B）=2.203 μg/100 g，u（C）=3.573 μg/100 g。

計(jì)算得：U（A）=2.837 μg/100 g，U（B）=4.406 μg/100 g，U（C）=7.146 μg/100 g。

各相對(duì)不確定分量的貢獻(xiàn)率見(jiàn)表5。

表5 相對(duì)不確定度分量的貢獻(xiàn)率Table 5 Contribution of uncertainty components

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)嬰幼兒配方乳粉中生物素含量的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定，得出在95%置信區(qū)間內(nèi)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為19.87 μg/100 g時(shí)，擴(kuò)展不確定度為2.84 μg/100 g，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為30.35 μg/100 g時(shí)，擴(kuò)展不確定度為4.41 μg/100 g，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為53.15 μg/100 g時(shí)，擴(kuò)展不確定度為7.15 μg/100 g。可見(jiàn)，隨著樣品中生物素含量的增高，檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)展不確定度也隨之增大。在各個(gè)不確定度分量中，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的影響最大，其次為重復(fù)性檢測(cè)，其影響大小依次為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合urel（ρ）＞重復(fù)性檢測(cè)urel（x）＞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制urel（C）＞樣品稱量及稀釋制備urel（T）。因此，建議在日常檢驗(yàn)時(shí)，增加標(biāo)準(zhǔn)曲線及重復(fù)性檢測(cè)的次數(shù)，提高檢測(cè)技術(shù)人員的水平，以提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，更好地為食品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)服務(wù)提供保障。