譚萬紅，鄧愛華，王 云，危 婷，謝 鵬，劉大宏

（1.湖南文理學院生命與環(huán)境科學學院，湖南 常德 415000；2.湖南泥頭山油茶開發(fā)有限公司，湖南 常德 415700）

近年來，由于保健型功能酒具有增強藥物療效的作用而引起研究者的關(guān)注[1]。據(jù)《中華本草》 記載，山茶科植物油茶（Camellia oleifera Abel） 的葉片具有治療瘡疽、鼻衄和皮膚瘙癢等多種功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，油茶葉含有多種活性成分，如多糖、多酚、蛋白及黃酮類等[2]，具有抑制癌細胞生長、降血糖、抗血栓及提高免疫力[3-4]等功效。研究發(fā)現(xiàn)，用50%的乙醇水溶液提取的油茶葉提取物富含黃酮類化合物，預防雄性激素依賴性疾病效果較好[5]。此外，蜂蜜常用來改善配制酒的口感及品質(zhì)[6]。為此，通過響應面設(shè)計試驗優(yōu)化料液比、浸泡時間、浸泡溫度、蜂蜜添加量和冰糖添加量等參數(shù)，獲得高品質(zhì)油茶葉功能酒的制備工藝，為油茶葉功能酒的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

新鮮油茶葉，湖南泥頭山油茶開發(fā)有限公司提供；蘆?。?99%），中國藥品生物制品檢定所提供；52°清香型白酒（食品級），北京前門釀酒廠提供；蜂蜜（食品級），南昌清之峰食品有限公司提供；冰糖（食品級），湖南多來蜜食品制造廠提供；氫氧化鈉、乙醇、亞硝酸、硝酸鋁，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 試驗儀器

UV-1600 型紫外可見分光光度計，翱藝儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品；LGJ-10 型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠產(chǎn)品；DZKW-S-6 型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；EX225D 型分析天平，美國奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；YB-700A 型高速多功能粉碎機，永康市速鋒工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 標準曲線的繪制

參考文獻[7]報道方法，進行適當修改。稱取100.0 mg 蘆丁溶于體積分數(shù)60%的乙醇中，用250 mL 容量瓶定容，得到質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的蘆丁標準液。吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 標準液分別裝入25 mL 容量瓶中，用體積分數(shù)30%的乙醇溶液補充到10 mL，加入質(zhì)量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉溶液1.0 mL 搖勻，5 min 后加1.0 mL 的10%硝酸鋁溶液搖勻，5 min 后加質(zhì)量分數(shù)為4%的氫氧化鈉溶液10.0 mL 搖勻，用體積分數(shù)30%的乙醇溶液定容，放置15 min。于波長510 nm 處測定其吸光度，試劑空白為參比液，繪制標準曲線及回歸方程。

2.2 單因素試驗設(shè)計

以感官評價和黃酮含量為品質(zhì)評價指標，取5 份相同質(zhì)量的油茶葉凍干粉，采用浸泡法配制油茶葉功能酒，分別考查料液比（1∶50，1∶100，1∶150，1∶200，1∶250 g/mL）、浸泡時間（1，6，12，18，24 h）、浸泡溫度（25，35，45，55，65 ℃）、蜂蜜添加量（1%，2%，3%，4%，5%）、冰糖添加量（0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%） 5 個因素對油茶葉功能酒品質(zhì)的的影響；單因素試驗時，設(shè)定其他參數(shù)為料液比1∶150（g∶mL），浸泡時間12 h，浸泡溫度35 ℃，蜂蜜添加量1%，冰糖添加量0.8%。

2.3 響應面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)定浸泡溫度45 ℃，以料液比（A）、浸泡時間（B）、蜂蜜添加量（C） 和冰糖添加量（D） 作為自變量，油茶葉功能酒感官評分（Y） 為因變量，根據(jù)Box-behnken 中心組合設(shè)計原理，設(shè)計響應面法試驗方案。

各試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 各試驗因素與水平設(shè)計

2.4 油茶葉黃酮含量計算

取油茶葉功能酒待測液1 mL 于具塞試管中，加入體積分數(shù)為30%的乙醇溶液4 mL、質(zhì)量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL。搖勻放置5 min，再加質(zhì)量分數(shù)為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min，加入質(zhì)量分數(shù)為4%的氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，用體積分數(shù)30%的乙醇溶液補充至10 mL。用分光光度計于波長510 nm 處測定吸光度。根據(jù)標準曲線方程計算油茶葉提取物中黃酮的質(zhì)量濃度，根據(jù)式（1） 計算黃酮得率（Y）。

式中：M1——油茶葉功能酒中黃酮的質(zhì)量，mg；

V——油茶葉功能酒的體積，mL。

2.5 感官評價方法

參考文獻[8]設(shè)計油茶葉功能酒的感官評價。挑選20 名經(jīng)過培訓的感官評價員從油茶葉功能酒的色澤、澄清度、香氣、滋味、風格5 個方面依照表2的評定標準進行感官評價。

表2 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 油茶葉功能酒感官評價

油茶葉功能酒感官評價見表2。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標準曲線的繪制

以吸光度（Y） 為縱坐標，質(zhì)量濃度（X） 為橫坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為Y=0.01X+0.007 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。說明在16~80 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍里蘆丁質(zhì)量濃度同吸光度線的線性關(guān)系良好。

蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

3.2 單因素試驗

3.2.1 料液比對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響

料液比對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響見圖2。

圖2 料液比對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響

由圖2 可知，當料液比低于1∶150（g∶mL）時，油茶葉功能酒中黃酮含量及感官評分隨料液比的增加而增加；繼續(xù)增大料液比，黃酮含量及感官評分出現(xiàn)下降趨勢，酒的口感偏淡，最適料液比為1∶150（g∶mL） 左右。

3.2.2 浸泡時間對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響

浸泡時間對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響見圖3。

圖3 浸泡時間對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響

由圖3 可知，油茶葉功能酒中黃酮含量及感官評分隨浸泡時間的延長不斷增加；到12 h 后，繼續(xù)延長浸泡時間，黃酮含量增加較為平緩，感官評分下降；浸泡時間過長，會導致其他可溶性雜質(zhì)（如色素、膠質(zhì)等） 的溶出，影響酒的口感，合適的浸泡時間為12 h 左右。

3.2.3 浸泡溫度對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響

浸泡溫度對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響見圖4。

圖4 浸泡溫度對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響

由圖4 可知，適當提高浸泡溫度，油茶葉功能酒中黃酮含量及感官評分不斷增加；當溫度達到45 ℃后，提高浸泡溫度對油茶葉黃酮含量影響不明顯，而功能酒的口感及色澤評分下降；可能是溫度過高導致雜質(zhì)的溶出以及黃酮結(jié)構(gòu)的破壞，從而影響酒的口感，最適浸泡溫度為45 ℃左右。

3.2.4 蜂蜜添加量對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響

蜂蜜添加量對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響見圖5。

圖5 蜂蜜添加量對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響

由圖5 可知，隨蜂蜜添加量的增加，油茶葉功能酒中黃酮含量不斷下降，可能是添加蜂蜜增加了體系的黏度，不利于黃酮的溶出；功能酒感官評分在2%達到最佳值，適當添加蜂蜜，可以增加酒的風味及口感，綜合考慮最適蜂蜜添加量為2%左右。

3.2.5 冰糖添加量對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響

冰糖添加量對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響見圖6。

圖6 冰糖添加量對油茶葉功能酒品質(zhì)的影響

由圖6 可知，隨冰糖添加量的增加，油茶葉功能酒中黃酮含量略有升高，可能是冰糖有助于黃酮的穩(wěn)定；適當添加冰糖，可以增加酒的風味及消除植物的澀味，綜合考慮最適冰糖添加量為1%左右。

3.3 響應面試驗

3.3.1 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果

響應面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

3.3.2 回歸模型的建立與分析

將表2 試驗數(shù)據(jù)代入Design Expert 8.0 軟件進行響應面分析，油茶葉功能酒得分與各變量的響應面回歸數(shù)學模型：

響應面回歸模型方差分析見表3。

表3 響應面回歸模型方差分析

由表3 可知，該回歸模型極顯著（p<0.001），失擬項不顯著（p>0.05），說明模型可靠；R2=0.967 3，R2Adj=0.934 6，說明模型與試驗值擬合較好；由F值可知，各因素對油茶葉功能酒感官評分影響大小依次為冰糖添加量（D） >浸泡時間（B） >料液比（A） >蜂蜜添加量（C）；一次項B、D，二次項A2、B2、C2和D2對感官評分的影響非常顯著（p<0.001）；一次項A對感官評分的影響顯著（p<0.05）；各因素兩兩交互作用對感官評分影響不顯著（p>0.05）。

3.3.3 交互作用分析

料液比與浸泡時間交互作用的響應面與等高線見圖7，料液比與蜂蜜添加量交互作用的響應面與等高線見圖8，料液比與冰糖添加量交互作用的響應面與等高線見圖9，浸泡時間與蜂蜜添加量交互作用的響應面與等高線見圖10，浸泡時間與冰糖添加量交互作用的響應面與等高線見圖11，蜂蜜添加量與冰糖添加量交互作用的響應面與等高線見圖12。

圖7 料液比與浸泡時間交互作用的響應面與等高線

圖11 浸泡時間與冰糖添加量交互作用的響應面與等高線

圖12 蜂蜜添加量與冰糖添加量交互作用的響應面與等高線

由圖7 ~圖12 可知，對比曲面陡峭程度，發(fā)現(xiàn)各因素兩兩交互作用影響不顯著（p>0.05），與方差分析結(jié)果一致。

3.3.4 最佳制備工藝條件確定

利用Design Expert 8.0 軟件由所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得出最佳制備工藝參數(shù)為料液比154.23（g∶mL），浸泡時間13.21 h，蜂蜜添加量1.84%，冰糖添加量1.06%，油茶葉功能酒感官評分為92.57 分。考慮到實際操作的方便，選取調(diào)整后的最優(yōu)制備參數(shù)為料液比1∶150（g∶mL），浸泡時間13 h，蜂蜜添加量1.8%，冰糖添加量1%，預測油茶葉功能酒感官評分為91.75 分，在此條件下進行3 次驗證試驗，感官評分為（91.84±0.743） 分，與預測值無顯著性差異（p>0.05），說明模型可靠；經(jīng)檢測優(yōu)化工藝下制備的油茶葉功能酒中黃酮含量為3.74%。

4 結(jié)論

油茶葉功能酒的最佳制備工藝參數(shù)為料液比1∶150（g∶mL），蜂蜜添加量1.8%，冰糖添加量1%，在45 ℃下浸泡時間13 h，油茶葉功能酒感官評分為（91.84±0.743）分，油茶葉功能酒中黃酮含量為3.74%。為了進一步拓展油茶葉功能酒在提高免疫力、抗腫瘤等功能食品及保健產(chǎn)品方面的應用，可以繼續(xù)開展油茶葉功能酒質(zhì)量標準及藥理學試驗等方面的研究。