李開瑩，郭朝萬，陳 杰，裴運(yùn)林，

（1.廣東丸美生物技術(shù)股份有限公司，廣東 廣州 510000；2.廣州美域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司，廣東 廣州 510000）

宋朝陳自明首次明確提出了“女子以血為本”的中醫(yī)學(xué)理論，“今婦人之生，有余于氣，不足于血，以其數(shù)脫血也”被記載于《靈樞·五音五味》中，提示女子以血為本的生理特點(diǎn)易產(chǎn)生“氣有余而血不足”的情況[1]。女子的脈細(xì)、唇舌色淡、面色無華或萎黃，并伴有心悸、健忘、多夢失眠等癥狀是血虛的表現(xiàn)[2]。女性氣血虛會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)一些疾病癥狀，如痛經(jīng)[3]、月經(jīng)過少病[4]、圍絕經(jīng)期綜合征[5]、卵巢功能衰退[6]。針對(duì)以上女性問題，市面上功能性食品常用的藥食同源原料有紅參、阿膠和燕窩等。有研究表明，阿膠對(duì)鹽酸苯肼型貧血小鼠有補(bǔ)血效果[7]，能夠促進(jìn)血細(xì)胞形式功能，提升人體造血能力[8]；燕窩具有提高細(xì)胞免疫功能和促使人體組織與細(xì)胞再生的作用[9]。利用現(xiàn)代酶解技術(shù)制備得到的相應(yīng)的肽類成分，如阿膠肽[10]、燕窩肽和血肽等成分，因?yàn)槠湮章矢呒坝行ё饔玫玫绞袌龈叨日J(rèn)可，但現(xiàn)有的研究報(bào)道主要集中在免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用[11-12]，在氣血方面的作用無較多研究。另外，動(dòng)物續(xù)血液制品將食源性活性肽作為主要成分與紅參進(jìn)行科學(xué)組合得到多肽紅參飲（Polypeptide Hongshen Drink，PPHSD），研究此組合物在調(diào)節(jié)氣血方面的作用，以驗(yàn)證經(jīng)酶解處理后的肽類是否依舊保留原物質(zhì)所具有的功效。

斑馬魚是一種非常重要的模式動(dòng)物，這種動(dòng)物作為一種哺乳動(dòng)物在遺傳學(xué)范疇上與人類相似，基因同源度高達(dá)87%[13]，相對(duì)于大鼠和小鼠動(dòng)物試驗(yàn)，斑馬魚試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂匈M(fèi)用低、試驗(yàn)周期短的特點(diǎn)[14]。近年來，斑馬魚模型已被廣泛用于功能性食品領(lǐng)域的功效評(píng)價(jià)，用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的調(diào)節(jié)免疫力作用[15-16]、改善微循環(huán)[17]、降血脂[18]、抗炎[19]、降血糖作用[20]和神經(jīng)保護(hù)作用[21]等。該課題組采用斑馬魚模型，建立相應(yīng)的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究評(píng)價(jià)由食源性活性肽類為主要成分制備成的組合物飲品的調(diào)節(jié)氣血，提高免疫力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取4 dpf 的野生型AB 品系斑馬魚用于評(píng)價(jià)PPHSD 改善貧血作用；選取4 dpf 黑色素等位基因突變型半透明Albino 品系斑馬魚用于評(píng)價(jià)PPHSD 改善微循環(huán)障礙作用；選取3 dpf 野生型AB 品系斑馬魚用于評(píng)價(jià)PPHSD 改善免疫力作用。斑馬魚均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L 反滲透水中加入200 mg 速溶海鹽，硬度為50~100 mg/L CaCO3，pH值為6.5~8.5，電導(dǎo)率為450~550 μs/cm），試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK（浙） 2022-0004，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC 認(rèn)證（認(rèn)證編號(hào)：001458） 的要求。

1.1.2 試劑與儀器

二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)BCCD8942，Sigma），Switzerland 公司提供；鄰聯(lián)茴香胺（批號(hào)MKBX3619V）， Sigma 公司提供； 苯肼 （批號(hào)YH0170509），上海依赫生物科技有限公司提供；甲基纖維素（批號(hào)C2004046），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供； 戊四唑 （PTZ， 批號(hào)YH0171126），上海依赫生物科技有限公司提供；Latex besads，carboxylate-modified polystyrene，fluirescent red 熒光微球（批號(hào)MKCB2036V），Sigma 公司提供。

解剖顯微鏡（SZX7），OLYMPUS 公司產(chǎn)品；CCD 相機(jī)（VertA1）；6 孔板，Nest 公司產(chǎn)品；精密電子天平（CP214），OHAUS 公司產(chǎn)品；電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100），Nikon 公司產(chǎn)品；心跳血流分析系統(tǒng)（Zebralab3.） 3 PB2084C 公司產(chǎn)品；顯微注射儀（IM-300），Narishige 公司產(chǎn)品；拉針儀（PC-10），Narishige 公司產(chǎn)品；行為分析儀（V3.11），ViewPoint Life Sciences 公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)藥物

多肽紅參飲PPHSD 由阿膠肽、燕窩肽、血肽和紅參等組成。多肽類成分為相應(yīng)原料經(jīng)過酶解工藝制備得到，然后將多種原料按科學(xué)配比經(jīng)過溶解、均質(zhì)、過濾等步驟制備得到。配方采用食品級(jí)原料組成，以保證長期服用無毒性。

瑞克R生血寧片，以下簡稱生血寧片，黑綠色片劑，批號(hào)為20211003，武漢聯(lián)合藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，陰涼干燥貯存，用超純水配制成50.0 mg/mL母液，現(xiàn)配現(xiàn)用；毛蕊異黃酮，白色粉末，批號(hào)211218044，華中海威（北京） 基因科技有限公司提供，冷藏干燥貯存。用DMSO 配制成3.41 mg/mL 母液，現(xiàn)配現(xiàn)用；破壁靈芝孢子粉，褐色粉末，批號(hào)為2112001，金日制藥（中國） 有限公司提供，陰涼、干燥貯存，用超純水配制成50.0 mg/mL 母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PPHSD 最大可用濃度考查（MTC）

在進(jìn)行功效評(píng)價(jià)之前先考查3 種斑馬魚模型對(duì)不同質(zhì)量濃度PPHSD 的耐受情況，使用質(zhì)量濃度分別為72.9，146，292，583，1 167 μg/mL 的PPHSD對(duì)3 種模式斑馬魚進(jìn)行毒性作用考查。隨機(jī)選取對(duì)應(yīng)模式斑馬魚于6 孔板中，30 尾/孔/試驗(yàn)組，分別水溶給予不同質(zhì)量濃度的PPHSD 水溶液，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組（標(biāo)準(zhǔn)稀釋水） 和模型對(duì)照組，每孔容量為3 mL。在試驗(yàn)過程中，觀察記錄斑馬魚的死亡情況并移除死亡的斑馬魚，確定不同質(zhì)量濃度PPHSD 對(duì)不同模式斑馬魚的毒性作用。

1.2.2 研究PPHSD 的改善貧血作用

隨機(jī)選取4 dpf 野生型AB 品系斑馬魚于6 孔板中，30 尾/ 孔。受試組分別水溶給予多肽紅參飲PPHSD，陽性對(duì)照組給予生血寧片250 μg/mL，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，每孔容量為3 mL。28 ℃條件下處理6 h 后，除正常對(duì)照組外，其余各試驗(yàn)組均水溶給予苯肼建立斑馬魚營養(yǎng)性貧血模型。28 ℃條件下繼續(xù)處理18 h 后，用鄰聯(lián)茴香胺染色，染色結(jié)束后每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)選取10 尾斑馬魚置于解剖顯微鏡下拍照，用NIS-Elements D 3.20 高級(jí)圖像處理軟件采集數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計(jì)斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度，以心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義評(píng)價(jià)多肽紅參飲PPHSD 對(duì)營養(yǎng)性貧血改善作用。

1.2.3 研究PPHSD 的改善微循環(huán)作用

隨機(jī)選取4 dpf 黑色素等位基因突變型半透明Albino 品系斑馬魚于6 孔板中，每孔均處理30 尾斑馬魚。分別水溶給予PPHSD，陽性毛蕊異黃酮4.26 μg/mL 質(zhì)量濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，每孔容量為3 mL。28 ℃處理1d 后，每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)選取10 尾斑馬魚置于斑馬魚心跳血液分析系統(tǒng)中錄制視頻并采集數(shù)據(jù)，分析節(jié)間血管血流速度，以該指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)PPHSD 改善微循環(huán)功效。

1.2.4 研究PPHSD 的增強(qiáng)免疫力作用

隨機(jī)選取3 dpf 野生型AB 品系斑馬魚于6 孔板中，30 尾/孔。受試組分別水溶給予PPHSD，陽性對(duì)照組給予破壁靈芝孢子粉2 000 μg/mL，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，每孔容量為3 mL。于28 ℃條件下處理4 d 后，每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)選取10 尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照，用Image J 軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚熒光微球殘留數(shù)目，以該指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)PPHSD 增強(qiáng)免疫力功效。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述1.2.1~1.2.4 的研究結(jié)果均用mean±SE 表示，方差分析和Dunnett's T- 檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.05 表明具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPHSD 試驗(yàn)濃度確定

試驗(yàn)研究中所涉及的3 種斑馬魚模型的試驗(yàn)終點(diǎn)，PPHSD 在72.9~1 167 μg/mL 的所有濃度組中斑馬魚無死亡現(xiàn)象，也無明顯形態(tài)和行為異常。在功效評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，PPHSD 選取適宜濃度進(jìn)行分組試驗(yàn)。

2.2 PPHSD 的改善貧血作用

多肽紅參飲改善營養(yǎng)性貧血功效試驗(yàn)結(jié)果（n=10） 見表1。

表1 多肽紅參飲改善營養(yǎng)性貧血功效試驗(yàn)結(jié)果（n=10）

由表1 可知，正常對(duì)照組斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度與模型對(duì)照組比較有顯著性差異（p<0.001），而陽性對(duì)照藥生血寧組斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度與模型對(duì)照組比較顯著上升（p<0.001），表明模型建立成功。PPHSD 中、高濃度組292 和583 μg/mL 斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色平均強(qiáng)度分別為4 729 和4 789，與模型對(duì)照組比較顯著增加，增加率為29.7%和31.34%，差異均顯著（p<0.01)。結(jié)果表明，在該試驗(yàn)濃度條件下，PPHSD 對(duì)苯肼誘導(dǎo)的斑馬魚貧血具有明顯的改善作用。

多肽紅參飲處理后斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度典型圖見圖1。

圖1 多肽紅參飲處理后斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度典型圖

由圖1 可知，模型組的心臟紅細(xì)胞染色程度明顯比正常對(duì)照組少，多肽紅參飲（PPHSD） 組心臟紅細(xì)胞染色程度明顯比模型組高，其結(jié)果與上述描述的一致。

2.3 PPHSD 的改善微循環(huán)作用

多肽紅參飲改善微循環(huán)功效試驗(yàn)結(jié)果（n=10）見表2。

表2 多肽紅參飲改善微循環(huán)功效試驗(yàn)結(jié)果（n=10）

由表2 可知，陽性對(duì)照組毛蕊異黃酮的血管血流速度與正常對(duì)照組相比，顯著上升（p<0.001）。PPHSD 的低中高292，583，1 167 μg/mL 這3 個(gè)劑量組斑馬魚平均血管血流速度分別為646，665，674 μm/s，與正常對(duì)照組比較顯著上升，分別提升了30.37%，34.10%，35.88%（p<0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，PPHSD 可以促進(jìn)正常斑馬魚的血液流動(dòng)，改善斑馬魚微循環(huán)。

2.4 PPHSD 的增強(qiáng)免疫力作用

多肽紅參飲對(duì)斑馬魚吞噬熒光微球作用（n=10）見表3。

表3 多肽紅參飲對(duì)斑馬魚吞噬熒光微球作用（n=10）

由表3 可知，陽性對(duì)照組破壁靈芝孢子粉（2 000 μg/mL） 的斑馬魚體內(nèi)熒光微球殘留數(shù)目與正常對(duì)照組相比，降低率為21.39%，具有顯著性（p<0.05）。PPHSD 的低中高72.9，146，292 μg/mL 這3 個(gè)劑量組斑馬魚體內(nèi)熒光微球殘留數(shù)目與正常對(duì)照組相比，分別降低31.96%，32.22%，32.73%，具有顯著差異（p<0.01）。

紅參多肽飲處理后斑馬魚熒光微球殘留數(shù)目典型圖見圖2。

圖2 紅參多肽飲處理后斑馬魚熒光微球殘留數(shù)目典型圖

由圖2 可知，多肽紅參飲組（PPHSD） 紅色熒光數(shù)明顯少于正常對(duì)照組。當(dāng)熒光微球在體內(nèi)殘留量少，說明斑馬魚體內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)外來異物的吞噬能力強(qiáng)。結(jié)果表明，PPHSD 具有增強(qiáng)免疫力作用。

3 結(jié)論

采用現(xiàn)代模式生物模型——斑馬魚模型研究組合物在氣血調(diào)節(jié)方面的作用及作用機(jī)理。試驗(yàn)結(jié)果表明，72.9~1 167 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍的PPHSD 對(duì)斑馬魚無毒性；292 和583 μg/mL PPHSD 組能夠明顯提升苯肼誘導(dǎo)的貧血斑馬魚的心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度增強(qiáng)，與模型對(duì)照組相比增加率為29.7%和31.34%，差異均顯著（p<0.01）；給予PPHSD 的斑馬魚組的血管血流速度明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組，292，583，1 167 μg/mL 的PPHSD 對(duì)斑馬魚平均血管血流速度分別提升了30.37%，34.10%，35.88%，具有顯著性差異（p<0.05）；72.9，146，292 μg/mL 的PPHSD明顯降低斑馬魚體內(nèi)熒光微球殘留數(shù)目，與正常對(duì)照組相比分別降低31.96%，32.22%，32.73%，差異均顯著（p<0.01），其增強(qiáng)免疫力作用明顯且優(yōu)于陽性對(duì)照破壁靈芝孢子粉。綜上所述，食源性多肽為主的組合物具有增強(qiáng)免疫力、改善貧血及改善微循環(huán)作用，可改善斑馬魚的總體氣血狀況。試驗(yàn)結(jié)果與已有的原料功效認(rèn)知相一致，具有綜合調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，共同改善機(jī)體貧血并增強(qiáng)免疫力的作用。不僅為此類活性多肽成分的功效提供試驗(yàn)佐證，而且也為具有評(píng)價(jià)此類功效提供了新的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>