成 騁，賈紅華，陳可泉，何冰芳，宮長斌

(南京工業(yè)大學(xué)生物化學(xué)工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，江蘇 南京 210018)

酶的特性實(shí)驗(yàn)是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中一個(gè)重要教學(xué)內(nèi)容[1]。通過該實(shí)驗(yàn)，學(xué)生可以親自進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，有效加深對酶活性的影響因素的認(rèn)識、進(jìn)一步理解酶的性質(zhì)和作用，從而更好地掌握酶的特異性及其動力學(xué)性質(zhì)等。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證酶的性質(zhì)和作用，不僅可以加深學(xué)生對生物化學(xué)理論知識的理解，還可以激發(fā)學(xué)生的興趣，對于學(xué)習(xí)生物化學(xué)的理論知識具有很大幫助[2-3]。

通過酶化學(xué)實(shí)驗(yàn)可以培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作技能，例如細(xì)胞破壁，蛋白質(zhì)提取、酶促反應(yīng)體系的設(shè)置、測定方法等[1]。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證酶的性質(zhì)和作用，可以幫助學(xué)生更深入地理解和掌握生物化學(xué)理論知識，加深對生物化學(xué)理論知識的理解。還可以通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)一步探究酶的性質(zhì)和作用機(jī)制，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)本專業(yè)知識的興趣，培養(yǎng)其獨(dú)立思考和解決問題的能力[4-5]。選取合適的實(shí)驗(yàn)體系對酶化學(xué)部分教學(xué)的實(shí)驗(yàn)開展具有重要的促進(jìn)作用。

圖1 酸性磷酸酯酶水解磷酸苯二鈉生成酚和無機(jī)磷Fig.1 Acid phosphatase hydrolyzes disodium benzene phosphate to produce phenol and inorganic phosphorus

酸性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1)是一種非特異性的酸性水解酶，廣泛存在于植物組織的細(xì)胞器中。它具有最適pH值在6.0以下的特性，能夠水解磷酸單酯鍵。酸性磷酸酯酶在代謝調(diào)節(jié)、能量轉(zhuǎn)化等重要的生命活動中發(fā)揮重要作用，不同底物表現(xiàn)出不同最大反應(yīng)速度和Km值[6]。由于其具有原料易得，提取方便，分析方法完善等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、生物工程、農(nóng)業(yè)和環(huán)保等領(lǐng)域[6]。酸性磷酸酯酶可以豆芽，麥芽為原料，通過細(xì)胞破壁等方式提取，提取后的酶在60 ℃以下相對穩(wěn)定，可在4 ℃情況下保存3～4天[6-7]，這些特性使得它較為適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)的使用。

針對酸性磷酸酯酶的來源，酶學(xué)性質(zhì)的分析和比較，以及蛋白含量的檢測等方面的研究，本課題選取豆芽為酶的來源，磷酸苯二鈉為底物，以酸性磷酸酯酶催化磷酸苯二鈉水解生成酚和無機(jī)磷酸的過程為主線，設(shè)計(jì)了酸性磷酸酯酶為核心的生物化學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，其中包括酸性磷酸酯酶的提取與酶促動力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程設(shè)計(jì)

圖2 實(shí)驗(yàn)過程教學(xué)設(shè)計(jì)Fig.2 Teaching design of the experimental process

良好的實(shí)驗(yàn)過程設(shè)計(jì)能夠激發(fā)學(xué)生對所學(xué)課程的興趣，加深對理論課中所學(xué)概念的理解，并且培養(yǎng)科學(xué)研究思維的能力和解決實(shí)驗(yàn)過程中遇到的復(fù)雜問題的能力[8]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置五個(gè)部分：酶的提取、酶活檢測、酶促動力學(xué)曲線測定、雙倒數(shù)作圖法測定Vmax和Km值和SDS-PAGE初步測定蛋白分子量。通過這些實(shí)驗(yàn)的設(shè)置，強(qiáng)化了學(xué)生在理論教學(xué)中學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)的分離純化，酶促反應(yīng)動力學(xué)和蛋白質(zhì)的分析鑒定方法等知識點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生將學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備、儀器設(shè)備的使用以及化學(xué)污染物的處理等技能和知識。這些有助于培養(yǎng)學(xué)生的職業(yè)規(guī)范、工程意識和環(huán)保意識等實(shí)驗(yàn)室中的職業(yè)素養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)?zāi)芰ΑＭ瑫r(shí)，通過數(shù)據(jù)分析和實(shí)驗(yàn)過程的改進(jìn)，有效培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力[9-11]。通過課堂教師的思政引領(lǐng)、實(shí)驗(yàn)案例的分析以及學(xué)生主動參與實(shí)驗(yàn)方案改進(jìn)，我們將加深學(xué)生對酶化學(xué)部分所學(xué)知識的理解，提升應(yīng)用生物化學(xué)的知識、運(yùn)用科學(xué)研究的思路和方法解決實(shí)驗(yàn)過程中遇到問題的能力。

2 實(shí)驗(yàn)過程

酸性磷酸酯酶的提取與酶促動力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目分為四個(gè)單元性實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，包括酶的提取、酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的制作和初速度的測定，酶活力和米氏常數(shù)的測定，SDS-PAGE等，具體的實(shí)驗(yàn)過程如下：

2.1 酶的提取

用天平稱取100 g的綠豆芽，掐去根和葉，再次稱重并記錄所得到的綠豆芽莖的重量。脫去手套，將綠豆芽莖放入碾缽中，并使用碾錘使勁碾壓和仔細(xì)研磨20 min，以確保徹底搗碎，將研磨好的綠豆芽莖室溫靜置10 min；使用雙層紗布擠濾磨碎的綠豆芽莖，收集濾液。如配備有離心機(jī)，可將濾液放入離心管中，以5000 r/min的速度離心20 min，再將離心管中上清液倒入量筒中(如不離心可用濾紙和漏斗過濾，濾液直接用量筒收集)；測量并記錄濾液的總體積，然后將其倒入三角燒瓶中，使用塑料薄膜嚴(yán)密封閉三角燒瓶口，將其保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的制作

將步驟一中提取的酸性磷酸酯酶溶液稀釋20倍，取試管12支，并按照0～11的順序逐管編號，其中第12號管為空白管。各管內(nèi)加入磷酸苯二鈉溶液，在1～11管內(nèi)，分別加入預(yù)熱2 min后的酶液。在恒溫器中置于35 ℃下，開始定時(shí)酶反應(yīng)(酶液加入時(shí)為起始時(shí)間，碳酸鈉溶液加入時(shí)為終止時(shí)間)。當(dāng)酶反應(yīng)進(jìn)行到上述相應(yīng)的時(shí)間時(shí)，加入1 M碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，再向試管中加入福林-酚溶液，保溫約10 min顯色。12號管所加試劑相同，但酶液最后加入。以12號管作空白，在可見光分光光度計(jì)上680 nm波長處讀取各管的吸光度A680。以上操作過程見表1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果小組討論后，調(diào)整酶濃度或底物濃度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)至獲得較理想數(shù)據(jù)。

表1 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的測定與制作Table 1 Determination and preparation of enzymatic kinetic curve

2.3 米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm)的測定

取試管7支，按照1～7的順序逐管編號。1～6號管按下表加入不同體積的磷酸苯二鈉溶液，并分別補(bǔ)充乙酸鹽緩沖液至0.5 mL。逐管加入35 ℃預(yù)熱過的酸性磷酸酯酶酶液0.5 mL，開始計(jì)時(shí)，搖勻，精確反應(yīng)10 min。反應(yīng)時(shí)間到達(dá)后立即加入5 mL 1 M碳酸鈉溶液，再加入福林—酚稀溶液，搖勻，35 ℃保溫顯色約10 min。7號管內(nèi)先加入磷酸苯二鈉溶液，再加入碳酸鈉溶液和福林-酚稀溶液，最后加入酶液，其它操作與1～6管相同。冷卻后以7號管作空白，在VIS-7220型可見分光光度計(jì)680 nm波長處讀取各管的吸光度A680。整個(gè)操作過程見表2。用各管的A680在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)的酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的mL數(shù)c，則產(chǎn)物的濃度為0.4c，這樣，各種底物濃度下的速度ν=0.4c/10，取相應(yīng)的倒數(shù)，填入表2內(nèi)。以1/ν為縱座標(biāo)，1/[S]為橫座標(biāo)作圖，求出Km和Vm。

表2 米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm)的測定Table 2 Double reciprocal plot method for determining Vmax and Km values

表3 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目對應(yīng)培養(yǎng)方案實(shí)踐能力要求Table 3 The experimental items correspond to the practical ability requirements of the training program

2.4 SDS-PAGE電泳法測定酸性磷酸酯酶分子量

本實(shí)驗(yàn)采用5%的濃縮膠和10%分離膠測定酸性磷酸酯酶分子量，設(shè)備采用大連競邁生物科技有限公司MV-24型蛋白垂直板電泳裝置。利用垂直板電泳裝置分兩步配置10%分離膠和5%的濃縮膠后，蛋白樣品沸水浴中加熱5 min處理冷卻至室溫、取20 μL處理過的蛋白質(zhì)溶液和5 μL marker標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，分別點(diǎn)到點(diǎn)樣孔中，在120 V電壓穩(wěn)壓電泳90 min。取出PAGE膠，放入固定液(乙醇∶冰醋酸∶水=5∶1∶4)中固定0.5 h，取出加入考馬斯亮藍(lán)R250染色液(0.29 g考馬斯亮藍(lán)R-250溶解在250 mL脫色液中)中染色0.5 h、取出用脫色液(250 mL乙醇，80 mL冰醋酸，用重蒸餾水定容至1000 mL)反復(fù)脫色至背景為無色，拍照并分析酸性磷酸酯酶分子量。

3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程的主要改進(jìn)與創(chuàng)新之處

(1)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)作為生命學(xué)科中最為重要的基礎(chǔ)課程之一，讓學(xué)生掌握基本理論知識的同時(shí)，加強(qiáng)他們創(chuàng)新思維的訓(xùn)練與解決問題的能力培養(yǎng)，是一個(gè)重要的改進(jìn)和創(chuàng)新點(diǎn)，對生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)至關(guān)重要。本課程實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)過程改進(jìn)與教學(xué)方式的改變，從多個(gè)角度培養(yǎng)學(xué)生的能力，這樣的教學(xué)方法不僅提高了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?，還培養(yǎng)了他們的團(tuán)隊(duì)合作精神和科學(xué)研究思維。

(2)在本課程實(shí)驗(yàn)中，引入問題分析與實(shí)驗(yàn)方案再設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)過程中酶促進(jìn)程曲線測定與繪制和雙倒數(shù)作圖法測定Vmax和Km，對酶濃度和底物濃度要求較高，這要求學(xué)生對酶濃度和底物濃度有一定的理解和掌握。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析對比，適當(dāng)調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案，通過前后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對比，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。通過這樣的模式，一方面加深了學(xué)生對生化知識的理解，另一方面提高了學(xué)生分析問題，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和解決問題的能力，培養(yǎng)了他們科學(xué)研究的思考方式。

這些改進(jìn)和創(chuàng)新之處使得生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)更加貼近實(shí)際科學(xué)研究的需求，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維能力和問題解決能力，為他們未來的學(xué)術(shù)和職業(yè)發(fā)展打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，通過團(tuán)隊(duì)合作和實(shí)驗(yàn)過程中的探索，學(xué)生也能更好地感受科學(xué)研究的樂趣和挑戰(zhàn)。