謝曉霄，徐 劼，方學(xué)雷，溫豪駿

(嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

由人類生產(chǎn)、生活所引發(fā)的環(huán)境重金屬污染問題，已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)環(huán)境問題之一[1]。重金屬作為一類有害物質(zhì)，能借助在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化及在生物圈的蓄積對動植物產(chǎn)生毒害作用并最終通過食物鏈對人體健康構(gòu)成潛在威脅[2]。植物修復(fù)技術(shù)是借助植物的吸收作用來去除環(huán)境中污染物的一種環(huán)境友好型的原位處理技術(shù)[3]。在相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中，通常會選用水培法來評價植物對重金屬的耐性及吸收累積特性。

觀賞植物應(yīng)用于重金屬污染環(huán)境的修復(fù)，一方面不會對環(huán)境造成二次污染，另一方面也不會因食物鏈而危及人體健康，因此在近年來得到了人們的廣泛關(guān)注。吊蘭屬于百合科吊蘭屬，為常見觀賞植物，具有環(huán)境適應(yīng)生存能力強(qiáng)、易栽培等特點(diǎn)。本研究以吊蘭為實(shí)驗(yàn)對象，通過水培實(shí)驗(yàn)探究銅脅迫下吊蘭的生理響應(yīng)及對銅的吸收特性。研究結(jié)論能為重金屬銅污染地區(qū)的環(huán)境治理與修復(fù)提供參考依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

試劑：硫酸銅、硝酸、鹽酸、高氯酸、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、無水乙醇、丙酮。以上試劑均為分析純，購置于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器：FA1204B型電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TDZ5-WS臺式低速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JC-FW-100植物粉碎機(jī)，青島聚創(chuàng)嘉恒分析儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；iCE 3500型原子吸收分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用實(shí)驗(yàn)室水培開展，新購買的吊蘭幼苗于空白營養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)3周(營養(yǎng)液配方參照文獻(xiàn)配制[4])，當(dāng)根系達(dá)到一定長度后開始Cu2+脅迫(CuSO4)處理。選取長勢一致的吊蘭幼苗作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對象，Cu2+脅迫實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個處理組，水培營養(yǎng)液中Cu2+的濃度分別為0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L和60 mg/L。每5 d更換1次營養(yǎng)液，培養(yǎng)周期為25 d。每個實(shí)驗(yàn)處理均設(shè)三組平行，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為三組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生理特性指標(biāo)

吊蘭葉片中葉綠素含量的測定參照乙醇-丙酮提取法測定[5]：稱取各實(shí)驗(yàn)處理組經(jīng)洗凈、剪碎的新鮮吊蘭葉片0.1 g于比色管中，隨后加入10 mL丙酮∶乙醇(1∶1體積)混合液于暗處放置24 h后，最后提取液在波長663 nm、645 nm下利用分光光度計(jì)測定吸光度，以1∶1丙酮-乙醇混合液為空白，最后計(jì)算葉片中葉綠素的含量。

吊蘭根和葉片組織中丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法[6]：稱取實(shí)驗(yàn)各處理組吊蘭根或葉片組織樣品1 g于研缽中。隨后加入2 mL 10%三氯乙酸和少量石英砂，研磨至勻漿后再加8 mL三氯乙酸進(jìn)一步研磨后進(jìn)行離心(4000 r/min 10 min)處理。取離心上清液2 mL(對照為2 mL去離子水)，加入2 mL 0.6% 硫代巴比妥酸溶液，混勻物于沸水浴上加熱反應(yīng)15 min，迅速冷卻后再離心。最后取上清液，分別于532 nm、600 nm和450 nm波長下的吸光度，根據(jù)公式計(jì)算吊蘭根和葉片組織中丙二醛的含量。

1.3.2 吊蘭根和葉片組織中銅含量的測定

Cu2+脅迫處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將不同Cu2+脅迫處理組吊蘭根和葉分別洗凈并烘干處理。稱取烘干的吊蘭根或葉片組織樣品0.1 g于150 mL三角瓶中，利用HNO3-HCl-HClO4法消解完全[7]；1% HNO3定容后利用原子吸收光譜儀測定并根據(jù)公式計(jì)算吊蘭根和葉片組織中的銅含量水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 銅脅迫對吊蘭葉片葉綠素含量變化的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其在對光能的吸收及轉(zhuǎn)化過程中作用巨大，因而其含量變化是反映植物光合作用正常與否的關(guān)鍵指標(biāo)[8]。在不同Cu2+濃度脅迫處理的第5 d、10 d、15 d、20 d和25 d，對吊蘭葉片葉綠素含量水平進(jìn)行了測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 銅脅迫對吊蘭葉片葉綠素含量變化的影響Fig.1 Effects of copper stress on chlorophyll content in Chlorophytum leaves

從圖1可以看出不同Cu2+濃度脅迫對吊蘭葉片葉綠素含量隨培養(yǎng)時間的變化存在不同的影響。當(dāng)水培液中不含Cu2+時，隨著培養(yǎng)時間的延長吊蘭葉片中葉綠素的含量增加明顯，與培養(yǎng)第5 d的數(shù)據(jù)相比，在培養(yǎng)的第25 d吊蘭葉片葉綠素的含量水平增加了54.54%。當(dāng)水培液中Cu2+的濃度為15 mg/L時，隨著培養(yǎng)時間的延長吊蘭葉片葉綠素含量呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢，在水培的第15 d葉綠素含量水平最高(1.22 mg/g)，這說明在短期內(nèi)低濃度的Cu2+脅迫對吊蘭的光合過程存在促進(jìn)作用。銅是植物生長的必需元素之一，因而體系中適量銅的存在對吊蘭的生長起到了一定的促進(jìn)作用。但相關(guān)研究也表明體系中過量銅的存在會造成植物葉色色失綠，并最終影響植物生長[9]。本實(shí)驗(yàn)研究也觀察到類似結(jié)果，當(dāng)水培液中Cu2+濃度進(jìn)一步增大(30 mg/L和60 mg/L)，隨著培養(yǎng)時間的延長Cu2+脅迫導(dǎo)致葉片葉綠素含量呈明顯下降趨勢；與培養(yǎng)第5 d的數(shù)據(jù)相比，在培養(yǎng)的第25 d吊蘭葉片葉綠素的含量水平分別降低了36.70%(30 mg/L)和67.57%(60 mg/L)；這說明高濃度的Cu2+脅迫對吊蘭光合過程存在明顯的抑制作用。研究認(rèn)為這主要是源于體系中過量存在的Cu2+會與諸如8-氨基乙酰丙酸合成酶、原葉綠素酸酯還原酶和膽色素原脫氨酶的-SH結(jié)合，使得這些在葉綠素合成過程中起關(guān)鍵作用的酶因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而失效[10]。也有研究表明體系中過量存在的Cu2+會對葉片細(xì)胞中的葉綠體結(jié)構(gòu)直接產(chǎn)生破壞作用，從而導(dǎo)致葉綠素含量的降低[9]。

2.2 銅脅迫對吊蘭根和葉組織中丙二醛含量變化的影響

本實(shí)驗(yàn)在不同Cu2+濃度脅迫處理的第5 d、10 d、第15 d、第20 d和第25 d，對吊蘭根和葉組織中丙二醛的含量水平進(jìn)行了測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2 銅脅迫對吊蘭根組織中丙二醛含量變化的影響Fig.2 Effect of copper stress on malondialdehyde content in Chlorophytum root

圖3 銅脅迫對吊蘭葉片組織中丙二醛含量變化的影響Fig.3 Effects of copper stress on malondialdehyde content in Chlorophytum leaves

在污染環(huán)境下，存在于植物器官組織細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸會在氧自由基的氧化作用下反應(yīng)生成丙二醛，其結(jié)果是由于細(xì)胞質(zhì)膜的氧化損傷而導(dǎo)致其選擇性功能弱化及喪失[11]。因此在逆境脅迫環(huán)境下，植物器官組織細(xì)胞膜的氧化及變性程度強(qiáng)弱可用其組織細(xì)胞中丙二醛含量的多寡來評判[12]。由圖2數(shù)據(jù)可以看出，空白對照處理組(Cu2+濃度為0 mg/L)中隨著水培時間的延長，吊蘭根組織中的丙二醛含量變化不明顯(3.05～3.29 μmol/g)，說明在正常水培條件下吊蘭根系組織能正常生長。當(dāng)水培液體系中添加了Cu2+后，由于Cu2+的脅迫作用使得根系組織中丙二醛的含量增加，并且表現(xiàn)為60 mg/L>30 mg/L>15 mg/L。水培前期(<20 d)，在各Cu2+添加水平條件下，吊蘭根系組織中丙二醛含量增加不明顯；但培養(yǎng)后期(>20 d)，在高Cu2+添加水平條件下(30 mg/L和60 mg/L)，吊蘭根系組織中丙二醛含量增加明顯。這說明隨著培養(yǎng)時間的延長，高濃度Cu2+脅迫對吊蘭根系組織的毒性作用更加明顯。

由圖3數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)Cu2+濃度為0 mg/L時，吊蘭處于正常生長狀態(tài)因而葉片組織中丙二醛含量波動不大(5.05～5.72 μmol/g)。當(dāng)水培液體系中添加了Cu2+后，隨著水培過程的進(jìn)行，吊蘭根系吸收的Cu2+會轉(zhuǎn)運(yùn)至葉部?？梢院苊黠@的看出，由于Cu2+的脅迫作用使得吊蘭葉片組織中丙二醛的含量顯著增加，同樣表現(xiàn)為60 mg/L>30 mg/L>15 mg/L。而且在各Cu2+添加水平條件下，一方面葉片組織中的丙二醛含量水平均高于根組織中的含量(圖2)；另一方面，在整個水培實(shí)驗(yàn)階段吊蘭葉片組織中丙二醛的含量均隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷增大。這說明在相同濃度Cu2+水培條件下，吊蘭葉片組織對Cu2+脅迫作用的響應(yīng)敏感性高于根系組織。

2.3 不同銅濃度處理對吊蘭根和葉Cu含量的影響

Cu2+脅迫處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將不同脅迫處理組吊蘭根和葉組織中的銅含量水平進(jìn)行了測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，在同一Cu2+濃度脅迫條件下，吊蘭根組織中的銅含量水平均明顯高于葉片組織。隨著Cu2+濃度的增大，根組織中銅的含量水平也顯著增高；而三個Cu2+濃度脅迫水平下，吊蘭葉片組織中的含量水平則變化不明顯。這說明對于吊蘭而言，根系是外界銅蓄積的主要器官組織，吊蘭根系吸收的銅向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)有限，從而盡可能的減少對植株地上部的毒害作用。

圖4 不同Cu2+濃度處理?xiàng)l件下吊蘭根和葉部銅含量的變化Fig.4 Changes of copper content in roots and leaves of Chlorophytum under copper stress

植物種類不同，根系吸收的銅向地上部轉(zhuǎn)移的能力也存在較大差異。如研究發(fā)現(xiàn)對大多數(shù)植物物種而言銅富集能力最強(qiáng)的是根系組織，而葉片對銅的富集能力最弱，這是植物對銅脅迫的一種適應(yīng)性表現(xiàn)[13-16]。這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論相一致。當(dāng)然某些植物因體內(nèi)存在一些特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或特定的可溶性Cu伴侶，因而可將根系吸收的銅向植株地上部轉(zhuǎn)運(yùn)并輸送至葉片組織[17]。如研究發(fā)現(xiàn)銅脅迫環(huán)境下，向日葵幼苗地上部的最高銅含量水平可以是根系組織含量水平的4倍[18]。

3 結(jié) 論

以吊蘭為實(shí)驗(yàn)對象，采用水培法研究了不同濃度Cu2+脅迫對吊蘭光合作用、根和葉組織中丙二醛含量變化的影響及吊蘭對銅的吸收特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：短期內(nèi)低濃度Cu2+脅迫(15 mg/L)對吊蘭的光合過程存在促進(jìn)作用，高濃度Cu2+脅迫(30 mg/L和60 mg/L)對吊蘭光合過程存在明顯抑制作用；由于Cu2+的脅迫作用使得吊蘭根、葉片組織中丙二醛的含量顯著增加，并且隨著培養(yǎng)時間的延長高濃度Cu2+脅迫作用對吊蘭根系組織的毒性作用更加明顯；在相同濃度Cu2+水培條件下，吊蘭葉片組織對Cu2+脅迫作用的響應(yīng)敏感性高于根系組織；不同濃度Cu2+脅迫條件下，吊蘭根組織中的銅含量水平均明顯高于葉片組織，并且隨著Cu2+濃度的增大，根組織中銅的含量水平也顯著增高，而葉片組織中的銅含量水平則變化不明顯。