陳欣彤 綜述,盛漢松 審校

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科,浙江溫州 325000

髓母細(xì)胞瘤(MB)是一種常見于兒童小腦或后顱窩的高侵襲性惡性腫瘤,占所有兒童顱內(nèi)腫瘤的10%～20%。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,MB根據(jù)基因表達(dá)譜至少可以分為4種分子亞型:WNT、SHH、Group3和Group4[1-2],近年來也有不少研究表明可將這些亞型分為更詳細(xì)的亞組[3-4]。兒童MB主要根據(jù)分子亞型確定危險(xiǎn)度分層及預(yù)后[2,5]。因此,MB的診斷、預(yù)后和治療靶點(diǎn)的確定依賴于腫瘤的分子特征[2]。目前臨床上主要通過組織活檢來表征,但這種方式存在一定的局限性:由于其具有侵入性,組織活檢的使用會(huì)受限于腫瘤的位置、大小等;通過隨機(jī)和局部的組織活檢獲得的樣本可能會(huì)遺漏腫瘤異質(zhì)性;腫瘤基因組特征可能隨著腫瘤發(fā)展而動(dòng)態(tài)演變,在腫瘤治療過程中或復(fù)發(fā)時(shí),無法隨時(shí)進(jìn)行組織活檢獲取腫瘤信息,使臨床診療的精確性受到限制[6-8]。循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)的腦脊液活檢有可能克服上述局限,它能以一種侵入性較小的形式,通過識(shí)別和驗(yàn)證腫瘤生物標(biāo)志物,提供實(shí)時(shí)信息以幫助診斷和監(jiān)測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)惡性腫瘤[9]。在本綜述中,筆者將概述腦脊液ctDNA活檢在MB中的研究進(jìn)展,討論其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值及轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐工具需要克服的挑戰(zhàn)。

1 腦脊液ctDNA

細(xì)胞游離DNA(cfDNA)是指由細(xì)胞脫落到生物體液中的DNA片段,其中由腫瘤細(xì)胞脫落的cfDNA即為ctDNA。ctDNA主要來自凋亡和壞死的腫瘤細(xì)胞,也可以由原發(fā)腫瘤中的任何細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移性病變釋放[6]。多項(xiàng)研究表明腦脊液是ctDNA的可靠來源,在診斷CNS腫瘤方面比血漿或血清更有優(yōu)勢(shì)[10-11]。ctDNA可以根據(jù)健康細(xì)胞DNA中未發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性突變與cfDNA進(jìn)行區(qū)分,提供高特異性的生物標(biāo)志物。隨著腫瘤的生長(zhǎng),細(xì)胞更新速率加快,釋放出更多的ctDNA,因此ctDNA豐度的縱向監(jiān)測(cè)為評(píng)估腫瘤負(fù)荷提供了可追溯的生物標(biāo)志物,并且鑒于ctDNA的半衰期相對(duì)較短(約2 h),通過ctDNA分析實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤反應(yīng)具有可行性[6,12]。

腦脊液ctDNA的檢測(cè)過程主要為腦脊液樣本收集,離心處理后通過核酸試劑盒提取與純化DNA,繼而采用ctDNA的檢測(cè)和分析技術(shù),如新一代測(cè)序(NGS)技術(shù)、數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)、BEAMing技術(shù)進(jìn)行DNA測(cè)序,對(duì)腫瘤特異性遺傳和表觀遺傳學(xué)改變(如基因突變、擴(kuò)增、重排、甲基化等)進(jìn)行定量分析[8,13-15]。目前,ctDNA常用檢測(cè)方法主要分為靶向和非靶向兩大類。靶向方法檢測(cè)特定的、已知分子變化的靶向ctDNA,常使用基于PCR的技術(shù)或采用靶向基因測(cè)序,如數(shù)字PCR技術(shù)、BEAMing技術(shù),能檢測(cè)到極低水平ctDNA中的突變,靈敏度高,適用于初始診斷和分子腫瘤分類,但受到檢測(cè)突變數(shù)量的限制;非靶向方法一般采用全基因組或全外顯子組測(cè)序,如NGS技術(shù),能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的多種變異,也包括腫瘤分子譜未知的ctDNA突變,適用于分析播散和轉(zhuǎn)移性腫瘤隨時(shí)間變化的基因組表現(xiàn)[6,16-18]。

2 ctDNA腦脊液活檢用于診斷MB的臨床價(jià)值

2.1輔助MB診斷、分類及預(yù)后預(yù)測(cè) 腦脊液ctDNA的突變能高度體現(xiàn)腫瘤組織的基因型,可用于腫瘤的病理分型,協(xié)助診斷MB,并通過分子分型結(jié)合患者年齡、手術(shù)切除程度、有無轉(zhuǎn)移、組織病理類型輔助對(duì)MB的危險(xiǎn)度進(jìn)行分層[2],進(jìn)而預(yù)測(cè)MB患者的預(yù)后。MB亞組主要通過分析與其相關(guān)的突變基因(BCOR、CTDNEP1、CTNNB1、DDX3X、GFI1、GFI1 act、GFI1B act、KBTBD4、KDM6A、KMT2C、KMT2D、PRDM6 act、PTCH1、SMARCA4、SMO、SUFU、TERT、TERT啟動(dòng)子、TP53、ZMYM3等)、染色體拷貝數(shù)變異(CNV,包括GLI2、MYC、MYCN、OTX2擴(kuò)增,PTEN、SUFU 缺失等)及細(xì)胞遺傳學(xué)特征(如1q+,2+,4-,5+,6-,7+,8-,8+,9p+,9q-,10-,10q-,11-,13-,13+,14+,14q-,15-,16-,16q-,17p-,17p+,18+,21-)進(jìn)行分類[10,19]。ESCUDERO等[10]研究表明腦脊液ctDNA概括了原發(fā)性腫瘤中存在的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性及腫瘤突變負(fù)荷,對(duì)于腦脊液細(xì)胞學(xué)結(jié)果陰性的患者,腦脊液中的ctDNA水平比血漿中的更高,并且腦脊液ctDNA的外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性腫瘤樣本中檢測(cè)到的突變也可以在匹配的腦脊液ctDNA中檢測(cè)出,二者的變異等位基因頻率具有顯著相關(guān)性。研究中檢測(cè)到的基因組改變包括MB常見突變(PTCH1、TP53)、CNV(MYCN和GLI2擴(kuò)增)和臂級(jí)染色體畸變(染色體17p丟失),表明ctDNA分析能為MB分子診斷與危險(xiǎn)度分層提供充足的信息。LIU等[20]利用MB染色體不穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)將腦脊液cfDNA中CNVs作為可測(cè)量殘留病灶(MRD)標(biāo)志物,在67例基線樣本[63.81%(67/105)]中檢測(cè)到MRD,且與相應(yīng)的原發(fā)性腫瘤CNV譜呈高度相關(guān)。此外,有研究發(fā)現(xiàn)基線樣本中MRD的可檢測(cè)性與年齡、性別、切除范圍、細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)及從切除到腦脊液取樣的持續(xù)時(shí)間無關(guān),但與MB風(fēng)險(xiǎn)分組、轉(zhuǎn)移狀態(tài)、分子亞組和腫瘤位置顯著相關(guān),這些因素又具體表現(xiàn)在MB的危險(xiǎn)度分層中[20-21]。腦脊液ctDNA輔助MB診斷與危險(xiǎn)度分層,繼而為MB的預(yù)后提供預(yù)測(cè)信息,有研究表明雖然基線MRD的可檢測(cè)性無顯著預(yù)后價(jià)值,但放療后、化療中期或治療結(jié)束時(shí)的連續(xù)MRD評(píng)估與患者的無進(jìn)展生存時(shí)間顯著相關(guān),無論初始風(fēng)險(xiǎn)分組如何,在輔助治療期間或結(jié)束時(shí)持續(xù)的MRD陽性能高度預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展情況,反之,早期(例如在放療后的時(shí)間點(diǎn))MRD陰性則可以作為治療降級(jí)的附加標(biāo)準(zhǔn)[20]。因此,相較于傳統(tǒng)的組織活檢分析分子特征的方法,腦脊液ctDNA能較全面、動(dòng)態(tài)地反映腫瘤的基因組特征,從而輔助MB的診斷、分類與預(yù)后預(yù)測(cè)。

2.2監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)、腫瘤進(jìn)展與復(fù)發(fā) 在患者隨訪期間,通過監(jiān)測(cè)ctDNA水平和MRD,有助于評(píng)估治療反應(yīng)與腫瘤進(jìn)展。ESCUDERO等[10]通過縱向分析腦脊液ctDNA、檢測(cè)MRD,確定了腫瘤內(nèi)和病灶間的異質(zhì)性,揭示了腫瘤在復(fù)發(fā)時(shí)的基因組轉(zhuǎn)化;通過對(duì)MB患者術(shù)前、術(shù)后及隨訪時(shí)的腦脊液ctDNA分析發(fā)現(xiàn),在治療結(jié)束時(shí)腦脊液樣本中仍然觀察到少量ctDNA,表明腦脊液ctDNA分析可以檢測(cè)到患者體內(nèi)殘留的小結(jié)節(jié),并且在部分通過磁共振成像未觀察到的樣本中也能檢測(cè)到。LIU等[20]研究發(fā)現(xiàn),50%的患者通過MRD檢測(cè)到的病情進(jìn)展比放射學(xué)檢測(cè)到的早3個(gè)月以上,即MB中ctDNA的增加先于放射學(xué)進(jìn)展,表明腦脊液ctDNA可以彌補(bǔ)影像技術(shù)檢測(cè)的滯后性,促進(jìn)MB患者中MRD的鑒定。

MB復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者,腦脊液ctDNA中檢測(cè)到的MB相關(guān)改變比來自腫瘤組織的基因組DNA更豐富,具有與原發(fā)腫瘤不共有的分子譜[10,20-21]。ESCUDERO等[10]分析腦脊液ctDNA發(fā)現(xiàn),除檢測(cè)到腫瘤特異性突變(常見的4個(gè)預(yù)測(cè)驅(qū)動(dòng)因素包括PTCH1:p.L1024Pfs,TP53:p.N239Tfs,CDKN2B:p.G124D,KMT2A:p.W1199S)外,還檢測(cè)到其他突變,揭示了復(fù)發(fā)時(shí)腫瘤的基因組轉(zhuǎn)化。LIU等[20]對(duì)有疾病進(jìn)展及在早期時(shí)間點(diǎn)與疾病進(jìn)展時(shí)MRD均陽性的患者進(jìn)行腦脊液與腫瘤樣本匹配的CNV譜分析發(fā)現(xiàn),80.00%患者(12/15)的染色體非整倍性存在,提示染色體克隆選擇或進(jìn)化,其中2例患者在原發(fā)腫瘤與基線ctDNA比較的亞群中檢測(cè)到不同CNV譜,并且ctDNA的CNV譜與復(fù)發(fā)腫瘤更一致,提示患者基線時(shí)的腦脊液樣本包括驅(qū)動(dòng)疾病進(jìn)展的侵襲性亞克隆。因此,ctDNA分析可能更真實(shí)地代表最終驅(qū)動(dòng)疾病進(jìn)展的惡性細(xì)胞基因組信息,對(duì)腫瘤進(jìn)展與復(fù)發(fā)的診斷有補(bǔ)充作用,有助于在復(fù)發(fā)時(shí)調(diào)整治療策略。

MB還呈現(xiàn)異常DNA甲基化改變的表觀遺傳學(xué)特征[7],腦脊液ctDNA分析可以檢測(cè)到具有診斷和預(yù)后價(jià)值的DNA甲基化標(biāo)志物。LI等[22]分析了MB患者腦脊液ctDNA基因組中的表觀遺傳標(biāo)志,包括DNA甲基化和羥甲基化,表明腦脊液ctDNA還可以進(jìn)行表觀遺傳學(xué)分析,在ctDNA中鑒定的DNA甲基化標(biāo)志具有潛在的診斷和預(yù)后價(jià)值,并且腦脊液樣品中的DNA甲基化的變化可用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和腫瘤復(fù)發(fā)。

3 ctDNA腦脊液活檢用于診斷MB面臨的挑戰(zhàn)

首先是腦脊液獲取方面的挑戰(zhàn)。腦積液抽取在患有后顱窩腫瘤(如MB)的兒童中較為常見,需在手術(shù)治療前進(jìn)行腦脊液外引流以減輕顱內(nèi)壓,并在MB臨床診療過程中,常規(guī)收集腦脊液樣品用于細(xì)胞學(xué)分析,因此腦脊液樣本的獲取對(duì)MB患兒一般不會(huì)造成額外傷害,且獲取腦脊液的侵入性明顯低于手術(shù)。但通過腰椎穿刺的方式獲取腦脊液也存在一定限制,其禁忌證包括顱內(nèi)壓異常、腦疝風(fēng)險(xiǎn)和凝血異常等[9]。

其次,收集和處理腦脊液ctDNA的方法尚需標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化[23],如樣本采集的日期,尤其是術(shù)后采集日期,因?yàn)閯?chuàng)傷誘導(dǎo)的cfDNA在手術(shù)后長(zhǎng)達(dá)4周內(nèi)豐度可能會(huì)稀釋ctDNA的比例,進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果[24];樣本量也會(huì)影響ctDNA的檢測(cè)結(jié)果[6];溫度、儲(chǔ)存條件等因素會(huì)影響ctDNA的完整性[25]。

此外,ctDNA并未在所有CNS惡性腫瘤患者的腦脊液中檢測(cè)到,其檢測(cè)結(jié)果可能受腫瘤負(fù)荷、腫瘤進(jìn)展和解剖位置的影響[20-21],尚需進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍、確定檢測(cè)涉及的影響因素以及提高檢測(cè)技術(shù)的敏感性[9]。影像學(xué)檢查技術(shù)有時(shí)反映出的“腫瘤進(jìn)展”可能是治療引起的炎癥反應(yīng)過程,即假性進(jìn)展[26],尚需進(jìn)一步的研究來調(diào)查腦脊液ctDNA分析是否有助于區(qū)分真實(shí)進(jìn)展和假性進(jìn)展。

4 總結(jié)與展望

目前腫瘤分子特征的分析已成為確定MB類型、預(yù)后以及治療靶點(diǎn)的重要組成部分。腦脊液ctDNA分析從降低侵入性、更全面反映腫瘤異質(zhì)性、樣本獲取的方便性等方面彌補(bǔ)了組織活檢的不足,對(duì)MB的臨床管理有潛在價(jià)值。腦脊液ctDNA分析可以反映MB的基因組特征,輔助MB早期、準(zhǔn)確的分子診斷(包括亞型和危險(xiǎn)度分層)與預(yù)后預(yù)測(cè),腦脊液ctDNA分析還可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者的疾病進(jìn)展,提供有關(guān)MRD、腫瘤演變和復(fù)發(fā)時(shí)的基因組信息。但ctDNA腦脊液活檢尚面臨處理方法標(biāo)準(zhǔn)化、檢測(cè)技術(shù)優(yōu)化等方面的挑戰(zhàn),因此有必要進(jìn)行更大隊(duì)列的研究,從優(yōu)化檢測(cè)技術(shù)、確立活檢的納入、處理與分析標(biāo)準(zhǔn)等方面解決腦脊液ctDNA分析向臨床轉(zhuǎn)化的困難,最終為MB患者提供更便捷、精準(zhǔn)的臨床管理等醫(yī)療服務(wù)。