叢 鵬, 蘇祥杰, 李 永

(四川省南充市中心醫(yī)院 肝膽胰脾外科, 四川 南充, 637000)

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,很多患者確診時已發(fā)展到晚期,預(yù)后不佳[1]。微小RNA(miRNA)在腫瘤組織中差異表達,參與調(diào)控腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為[2]。研究[3-5]發(fā)現(xiàn),微小RNA-433-3p(miR-433-3p)在肺癌、腦膠質(zhì)瘤及乳腺癌組織中差異性表達,并可調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移,但miR-433-3p是否參與調(diào)控胰腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移的研究報道較少。Hedgehog通路在腫瘤細胞中處于激活狀態(tài),參與腫瘤進展[6], 滑蛋白(SMO)基因是Hedgehog通路的重要組成部分,在信號向細胞內(nèi)傳遞過程中扮演著重要角色[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn), SMO在膀胱癌組織中高表達,是膀胱癌患者預(yù)后不良的危險因素。研究[9]還發(fā)現(xiàn),下調(diào)SMO可抑制胰腺癌細胞的生物學(xué)行為,但miR-433-3p是否通過靶向SMO調(diào)控胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展尚不清楚。本研究探討miR-433-3p對胰腺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響及可能機制,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1、人正常胰腺上皮細胞HPNE(本課題組保存),胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibico公司,美國), LiPofectamine 8000、TRIzol及四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒(上海碧云天生物有限公司), RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒(Sigma公司,美國), SMO單克隆抗體(Abnova公司),山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(北京博爾西科技有限公司),熒光定量試劑盒、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(日本TaKaRa公司),雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京Solarbio公司), miR-NC質(zhì)粒、miR-433-3p mimics質(zhì)粒、si-NC質(zhì)粒、si-miR-433-3p質(zhì)粒、Scramble質(zhì)粒(敲低空質(zhì)粒)、si-SMO質(zhì)粒、Vector質(zhì)粒(過表達空質(zhì)粒)、OE-SMO質(zhì)粒、野生型SMO(WT-SMO)、突變型SMO(MUT-SMO)質(zhì)粒(上海吉瑪生物有限公司),重組質(zhì)粒pOK12-MCS1(上海吉瑪生物有限公司)。酶標(biāo)儀(南京貝燈醫(yī)療器械有限公司), PCR儀(ABI公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組: PANC-1、HPNE細胞采用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為5%CO2,37℃。將miR-NC、miR-433-3p mimics、si-NC、si-miR-433-3p、Scramble、si-SMO、Vector、OE-SMO質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至PANC-1細胞中,依次命名為miR-NC組、miR-433-3p mimics組、si-NC組、si-miR-433-3p組、Scramble組、si-SMO組、Vector組及OE-SMO組。將Vector、OE-SMO質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至miR-433-3p組細胞,并命名為si-miR-433-3p+Scramble組、si-miR-433-3p+si-SMO組。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖: 將各組細胞采用胰酶消化制備成單細胞懸液,按照每孔1×104個細胞接種到96孔板,常規(guī)孵育48 h后加入100 μL MTT試劑反應(yīng)30 min, 對照組加入等量二甲基亞砜,酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度(OD)值。

1.2.3 Transwell檢測細胞遷移和侵襲: 采用胰酶消化細胞后,采用不含血清的培養(yǎng)基制備單細胞,將1×105個細胞加入到Transwell小室的上室,下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基,常規(guī)孵育24 h后吸去培養(yǎng)基,用棉簽拭去上室中未遷移的細胞, 4%多聚甲醛固定, 0.1%結(jié)晶紫染色,晾干,光學(xué)顯微鏡下拍照,低倍鏡下隨機選取5個視野,計算遷移細胞平均值。對于侵襲實驗,預(yù)先在上室中鋪入無菌基質(zhì)膠,其余步驟同遷移實驗。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測細胞miR-433-3p和SMOmRNA表達水平: 取對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化,離心。加入1 mL Trizol, 利用一步法提取總RNA, 檢測濃度。根據(jù)試劑盒說明書合成cDNA, 反應(yīng)條件為: 30 ℃下10 min, 42 ℃下30 min, 99 ℃下5 min, 4 ℃下5 min。按照熒光定量試劑盒說明進行PCR, 循環(huán)條件為: 95 ℃下5 s, 60 ℃下34 s, 共40個循環(huán),構(gòu)建溶解曲線,相對表達量采用2-△△Ct法計算。內(nèi)參使用U6。miR-433-3p: F為5′-ACACTCCAGCTGGGATCATGATGGGCTCCT-3′, R為5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6: F為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, R為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;SMO: F為5′-CTGGGAGTGGGAGCATAT-3′, R為5′-CAAGGGCAAGACGAGAAG-3′;β-actin: F為5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′, R為5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′。

1.2.5 Weston blot檢測SMO蛋白表達: 收集細胞,加入RIPA細胞裂解溶液提取總蛋白, 100 ℃煮5 min, 使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度及純度,加入5×loading稀釋蛋白, -20 ℃保存。制備分離膠、濃縮膠,每孔加入30 μg樣品,先設(shè)置電壓70 V, 待蛋白maker分離后調(diào)整電壓為120 V, 蛋白loading到達分離膠邊緣時停止電泳,小心切膠,放在濾紙、PVDF膜上, 150 mA條件下轉(zhuǎn)膜1 h, 5%脫脂奶粉常溫封閉1 h, 加入SMO(1∶1 000)孵育4 ℃過夜,次日洗膜3次后加入二抗室溫孵育1 h。洗滌3次后,加入曝光液,上機ECL法發(fā)光, Image J分析條帶灰度值,以β-actin作為參照,分析目的蛋白表達水平。

1.2.6 在線網(wǎng)站預(yù)測miR-433-3p與SMO的靶向關(guān)系: 使用TargetScan在線網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)預(yù)測miR-433-3p與SMO的靶向關(guān)系。

1.2.7 熒光素酶報告實驗: 將miR-NC或miR-433-3p mimics分別與WT-SMO、MUT-SMO載體共轉(zhuǎn)染至PANC-1細胞,繼續(xù)孵育48 h后收集各孔細胞,裂解各組細胞并收集上清液,然后按照試劑盒說明檢測細胞熒光素酶相對活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PANC-1、HPNE細胞SMO及miR-433-3p表達水平

PANC-1細胞SMO基因mRNA表達水平為(3.32±0.15), 高于HPNE細胞的(0.64±0.11), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.95,P<0.000 1); PANC-1細胞SMO蛋白表達水平高于HPNE細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.15,P<0.000 1); PANC-1細胞miR-433-3p表達水平為(0.34±0.04), 低于HPNE細胞的(2.94±0.25), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.79,P<0.000 1)。見圖1。

A: PANC-1細胞與HPNE細胞SMO蛋白表達水平; B: PANC-1細胞與HPNE細胞SMO蛋白表達水平柱狀圖; C: PANC-1細胞與HPNE細胞SMO基因mRNA表達水平; D: PANC-1細胞與HPNE細胞miR-433-3p表達水平。HPNE與PANC-1比較, ****P<0.000 1。圖1 PANC-1細胞與HPNE細胞SMO及miR-433-3p表達水平比較

2.2 SMO及miR-433-3p干擾效果驗證

miR-433-3p組細胞的miR-433-3p表達水平高于miR-NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1); si-miR-433-3p組細胞的miR-433-3p表達水平低于si-NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); SMO組細胞SMO基因mRNA及其蛋白表達量高于Vector組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); si-SMO組細胞SMO基因mRNA、蛋白低于Scramble組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001或P<0.000 1)。見圖2。

A: 各組細胞miR-433-3p表達水平(與miR-NC比較, ****P<0.000 1, 與si-miR-433-3p比較, ***P<0.001); B: 各組細胞SMO基因mRNA水平(與Vector比較, **P<0.01, 與si-SMO比較, ***P<0.001); C: 各組細胞SMO蛋白表達水平; D: SMO蛋白表達水平柱狀圖(與Vector比較, **P<0.01, 與si-SMO比較, ****P<0.000 1)。圖2 SMO及miR-433-3p干擾效果驗證

2.3 miR-433-3p對細胞增殖、侵襲及遷移的影響

miR-433-3p組細胞72 h OD值、侵襲及遷移細胞數(shù)低于miR-NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01或P<0.000 1); si-miR-433-3p組細胞72 h OD值、侵襲及遷移細胞數(shù)高于si-NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01或P<0.000 1)。見圖3。

A: MTT結(jié)果(miR-433-3p與miR-NC比較, si-miR-433-3p與si-NC比較, **P<0.01); B: 遷移實驗結(jié)果; C: 侵襲實驗結(jié)果; D: 各組細胞侵襲、遷移細胞數(shù)量柱狀圖(si-miR-433-3p與si-NC比較, miR-433-3p與miR-NC比較, *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1)。圖3 miR-433-3p對細胞增殖、侵襲及遷移的影響

2.4 SMO對細胞增殖、侵襲及遷移的影響

SMO組細胞48、72 h OD值、侵襲及遷移細胞數(shù)高于Vector組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.001或P<0.000 1); si-SMO組細胞48、72 h OD值、侵襲及遷移細胞數(shù)低于Scramble組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.001或P<0.000 1)。見圖4。

A: MTT結(jié)果(SMO與Vector比較, si-SMO與Scramble比較, ***P<0.001); B: 遷移實驗結(jié)果; C: 侵襲實驗結(jié)果; D: 各組細胞侵襲、遷移細胞數(shù)量柱狀圖(SMO與Vector比較, si-SMO與Scramble比較, *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.000 1)。圖4 SMO對細胞增殖、侵襲及遷移的影響

2.5 下調(diào)SMO逆轉(zhuǎn)了miR-433-3p低表達對細胞增殖、侵襲及遷移的促進作用

si-miR-433-3p+Scramble組細胞SMO蛋白表達量、72 h OD值、侵襲及遷移細胞數(shù)高于si-NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01或P<0.000 1); si-miR-433-3p+si-SMO組細胞SMO蛋白表達量、72 h OD值、侵襲及遷移細胞數(shù)低于si-miR-433-3p+Scramble組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

A: 各組細胞SMO蛋白表達; B: SMO蛋白表達水平柱狀圖(與si-miR-433-3p+Scramble比較, **P<0.01); C: MTT結(jié)果(與si-miR-433-3p+Scramble比較, **P<0.01); D: 侵襲、遷移實驗結(jié)果; E: 侵襲、遷移細胞數(shù)量柱狀圖(與si-miR-433-3p+Scramble比較, *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1)。圖5 下調(diào)SMO逆轉(zhuǎn)了miR-433-3p低表達對細胞增殖、侵襲及遷移的促進作用

2.6 miR-433-3p與SMO的靶向關(guān)系

TargetScan在線網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn), miR-433-3p與SMO存在結(jié)合位點。miR-433-3p+WT-SMO組細胞熒光素酶活性低于miR-NC+WT-SMO組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); miR-433-3p+MUT-SMO組細胞熒光素酶活性與miR-NC+MUT-SMO組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。miR-433-3p組細胞SMO蛋白表達水平低于miR-NC組, si-miR-433-3p組細胞SMO蛋白表達水平高于si-NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

3 討 論

胰腺癌作為消化系統(tǒng)惡性程度較高的腫瘤,早期容易發(fā)生轉(zhuǎn)移,就診時已處于晚期,治療效果不佳,預(yù)后不良[10]。miRNA作為近年來發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA, 研究[11-13]發(fā)現(xiàn)多種miRNAs與胰腺癌細胞惡性表型密切相關(guān)。因此,探討與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的miRNA及分子機制對于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

miR-433-3p是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA, 在多種腫瘤組織中差異表達,參與了腫瘤細胞的各種惡性行為的調(diào)控,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[14-15]。白雨微等[16]研究發(fā)現(xiàn), miR-433-3p在結(jié)直腸癌細胞中呈低表達,上調(diào)miR-433-3p可通過靶向Ras相關(guān)蛋白1A(RAP1A)抑制結(jié)直腸癌細胞的惡性表型。在肺癌細胞中, miR-433-3p可通過靶向N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶1(GALNT1)抑制肺癌細胞的增殖、侵襲及遷移[17]。ZHANG J等[18]研究發(fā)現(xiàn), miR-433-3p通過靶向AJUBA抑制腦膠質(zhì)瘤細胞惡性表型。本研究通過qRT-PCR檢測了胰腺癌、正常胰腺上皮細胞中miR-433-3p的表達,發(fā)現(xiàn)miR-433-3p在胰腺癌細胞中呈低表達,提示miR-433-3p可能是胰腺癌的抑癌基因。為進一步探討miR-433-3p對胰腺癌的作用,作者構(gòu)建了miR-433-3p過表達及敲低胰腺癌細胞,結(jié)果顯示,上調(diào)miR-433-3p抑制了細胞增殖、侵襲及遷移,下調(diào)miR-433-3p則促進了腫瘤細胞的生物學(xué)行為。上述結(jié)果提示miR-433-3p對子宮頸鱗狀細胞癌(CSCC)具有抑制作用,是乳腺癌的抑癌基因,這與miR-433-3p在其他腫瘤中的作用一致。

miRNA一般通過靶向調(diào)控下游基因發(fā)揮作用,為了進一步探討miR-433-3p調(diào)控胰腺癌細胞增殖、侵襲及遷移的機制,本研究首先利用生物學(xué)信息網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn), miR-433-3p與SMO存在核苷酸序列結(jié)合位點,雙熒光素酶實驗則進一步明確了miR-433-3p與SMO存在結(jié)合位點。本研究結(jié)果還顯示,上調(diào)miR-433-3p的胰腺癌細胞低表達SMO, 而下調(diào)miR-433-3p的細胞則高表達SMO, 提示miR-433-3p可負性調(diào)控SMO的表達。本研究結(jié)果還顯示,下調(diào)SMO逆轉(zhuǎn)了miR-433-3p低表達對細胞增殖、侵襲及遷移的促進作用,提示過表達miR-433-3p通過負性調(diào)控SMO促進胰腺癌的惡性生物學(xué)行為。Hedgehog通路是腫瘤細胞常見的信號通路,在調(diào)控腫瘤進展中扮演著重要角色[19-20]。SMO是Hedgehog通路中最重要的蛋白之一,參與Hedgehog通路的調(diào)控[21-22]。SMO在多種腫瘤組織中高表達,與腫瘤進展、預(yù)后有關(guān)[23-24]。李東偉[25]研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌組織SMO高表達,與腫瘤分化程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,胰腺癌細胞高表達SMO, 上調(diào)SMO可促進胰腺癌細胞惡性表型,下調(diào)SMO則抑制胰腺癌細胞惡性表型,提示SMO是胰腺癌的促癌基因。

本研究的局限性: ① miR-433-3p、SMO與胰腺癌臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系需要進一步明確; ② miR-433-3p、SMO對乳腺癌的影響需要動物體內(nèi)實驗進行驗證。

綜上所述,胰腺癌細胞低表達miR-433-3p, 高表達SMO, 過表達miR-433-3p通過負性調(diào)控SMO抑制胰腺癌細胞增殖、侵襲及遷移, miR-433-3p、SMO可能是胰腺癌的潛在治療靶點。