胡效林, 郝 鑫, 李文倩, 趙恬恬, 侯思聰

(1. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系, 江蘇 揚(yáng)州, 225001;3. 江蘇省寶應(yīng)縣人民醫(yī)院 消化內(nèi)科, 江蘇 寶應(yīng), 225800)

食管癌是全球主要惡性腫瘤之一,致死率在腫瘤性疾病中居第6位,中國(guó)是食管癌高發(fā)地區(qū),主要的病理類(lèi)型是鱗狀細(xì)胞癌(ESCC), 食管癌患者的5年生存率僅為15%～20%[1]。因此,鑒定ESCC轉(zhuǎn)移過(guò)程的關(guān)鍵分子并探索潛在機(jī)制,將為臨床尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)提供科學(xué)參考。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體溶質(zhì)載體家族1成員5(SLC1A5)是一種以谷氨酰胺為底物、Na+依賴(lài)性的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[2], 可介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)中性氨基酸的攝取,目前已被證明[3-5]在肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等多種上皮來(lái)源的惡性腫瘤中高表達(dá)。既往研究[6]表明,SLC1A5主要通過(guò)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺及正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子參與惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。此外,SLC1A5還可以與銜接因子相關(guān)蛋白復(fù)合物1γ1亞基(AP1G1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)形成異源三聚體復(fù)合物,通過(guò)增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的攝取,上調(diào)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平,促進(jìn)細(xì)胞增殖。

本課題組前期質(zhì)譜結(jié)果[7]發(fā)現(xiàn), SLC1A5是四跨膜蛋白超家族成員1(TM4SF1)的潛在相互作用蛋白。TM4SF1主要通過(guò)與整合素、受體酪氨酸激酶(RTKs)等蛋白相互作用形成的富含四跨膜蛋白的微結(jié)構(gòu)域(TEMs)介導(dǎo)腫瘤黏附、侵襲和遷移[8]。因此,本課題推測(cè)SLC1A5可能通過(guò)與TM4SF1相互作用參與ESCC轉(zhuǎn)移。本研究檢測(cè)SLC1A5在ESCC中的表達(dá)情況,分析其與臨床病理資料的相關(guān)性,旨在探索SLC1A5參與調(diào)控ESCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院2012年12月—2015年12月收治的84例ESCC術(shù)后標(biāo)本,所有癌組織及癌旁正常組織石蠟切片均取自揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院病理科,組織病理已確診,采用免疫組織化學(xué)(IHC)進(jìn)行標(biāo)本染色,所有患者具有完整臨床資料,術(shù)前均未接受放化療。收集2019年12月—2020年12月接受手術(shù)患者的18對(duì)新鮮組織標(biāo)本,包括ESCC組織和臨近的非癌組織(距離癌組織>5 cm), 標(biāo)本收集后,放于-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)研究。本研究通過(guò)揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

本研究所使用的ESCC細(xì)胞系(Eca-109)來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。使用含有10%胎牛血清(FBS)(杭州天杭生物科技股份有限公司,中國(guó))的RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。HEK293T用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)。

1.3 在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析

使用TNM plot在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.tnmplot.com/)比較161個(gè)ESCC組織和418個(gè)正常組織中SLC1A5基因表達(dá)水平。

1.4 構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒

TM4SF1的相應(yīng)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒來(lái)自實(shí)驗(yàn)室前期的構(gòu)建[7]。SLC1A5的全長(zhǎng)cDNA是以Eca-109細(xì)胞總cDNA為模板擴(kuò)增得到,然后亞克隆到pDONR201載體中。隨后通過(guò)Gateway技術(shù)將SLC1A5的cDNA從pDONR201載體中置換到pLenti-CMV-Puro DEST(w118-1)(Addgene,#17452)或pLenti-CMV-Hygro DEST(w117-1)(Addgene, #17454)載體中,從而得到相關(guān)慢病毒表達(dá)載體。

1.5 構(gòu)建病毒包裝感染以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

基于慢病毒的TM4SF1或SLC1A5過(guò)表達(dá)載體與pCAG-HIVgp和pCMV-VSV-G-RSV-Rev共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,收集慢病毒上清液。用所得病毒上清液感染相應(yīng)細(xì)胞72 h后,通過(guò)潮霉素B或嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選,最終獲得相應(yīng)抗性的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1.6 IHC

取石蠟包埋的標(biāo)本切片,將組織切片脫蠟和水化,進(jìn)行高壓抗原修復(fù), SLC1A5一抗(CST, 美國(guó),貨號(hào)#8057, 稀釋比例1∶150)在4 ℃冰箱孵育過(guò)夜,二抗工作液37 ℃孵育30 min, 3, 3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DAB)顯色和蘇木素復(fù)染,最后脫水、透明、封片。SLC1A5染色結(jié)果判讀方法如下: 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比分5個(gè)等級(jí),即0分(0%)、1分(>0%～25%)、2分(>25%～50%)、3分(>50%～75%)、4分(>75%～100%); 染色強(qiáng)度分4個(gè)等級(jí),即0分(無(wú)色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕色或棕褐色); 最終染色分?jǐn)?shù)=染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×陽(yáng)性細(xì)胞百分比分?jǐn)?shù)。0～3分為低表達(dá), 4～12分為高表達(dá)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

采用TRIzol試劑(Invitrogen,美國(guó))從組織中提取總RNA,按照制造商說(shuō)明,使用iScript cDNA合成試劑盒(Bio-Rad, 美國(guó))對(duì)分離的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,采用iTaq Universal SYBR Green Kit(Bio-Rad, 美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR。以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行分析。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR相關(guān)的引物序列

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)

從收獲的細(xì)胞中提取總蛋白,用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce, 美國(guó))測(cè)定蛋白濃度,通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(伯樂(lè)系統(tǒng),美國(guó))分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)(Sigma, 美國(guó))膜上。在室溫下封閉1 h, 一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜,二抗在室溫下孵育1 h。用ECL發(fā)光液(Pierce, 美國(guó))檢測(cè)目標(biāo)蛋白。所用一抗包括: TM4SF1(R&D, 美國(guó),貨號(hào)AF7514, 稀釋比例0.5 μg/mL); SLC1A5, p-mTOR, mTOR, p-S6和S6(CST, 美國(guó); 貨號(hào)分別為#8057, #2971, #2972, #2211和#2217; 稀釋比例均為1∶3 000)以及β-actin(Santa Cruz Biotechnology,美國(guó),貨號(hào)#sc-47778, 稀釋比例1∶1 000)。

1.9 免疫共沉淀(IP)

收集1 mg(約1 000 μL)細(xì)胞裂解液中,吸取1/10上清液(約100 μL), 作為Input, 放入-20 ℃冰箱備用,將剩余上清液加入100 μL預(yù)處理的protein A/G瓊脂糖珠(Santa Cruz Biotechnology,美國(guó))中,在4 ℃輪轉(zhuǎn)儀上輪轉(zhuǎn)30 min,離心后留取上清液,分別加入相應(yīng)的抗SLC1A5抗體(CST, 美國(guó),貨號(hào)#8057, 稀釋比例1∶75)及IgG抗體(Bio-Rad, 美國(guó),貨號(hào)#PRABP01, 稀釋比例1∶50), 4 ℃輪轉(zhuǎn)過(guò)夜后,新的100 μL預(yù)處理protein A/G瓊脂糖珠孵育結(jié)合, 4 ℃輪轉(zhuǎn)孵育2 h, 離心并進(jìn)行樣品處理,最后進(jìn)行WB檢測(cè)。

1.10 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將對(duì)應(yīng)的細(xì)胞(3×104個(gè))接種到60 mm培養(yǎng)皿,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后,更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h, 更換為完全培養(yǎng)基,并通過(guò)顯微鏡拍照記錄后,計(jì)數(shù)該視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目。之后每24 h拍照記錄相同視野的細(xì)胞并計(jì)數(shù),共3次。統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)、相同視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)目以記錄細(xì)胞增殖情況,繪制增殖曲線(xiàn)。

1.11 Tranwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

使用24孔Transwell小室(Corning,美國(guó))評(píng)價(jià)食管癌細(xì)胞的侵襲能力。預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基配制Matrigel, 按每個(gè)小室100 μL鋪膠, 37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h。消化細(xì)胞,在無(wú)菌上室中加入200 μL的細(xì)胞懸液(3×104個(gè)),在下室中加入500 μL含有10%FBS培養(yǎng)基, 37 ℃培養(yǎng)箱中孵育12 h, 用鑷子小心取出小室,用甲醇室溫固定30 min, 結(jié)晶紫室溫染色15～30 min, 室溫晾干后顯微鏡下拍照并選取3個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)結(jié)果。遷移實(shí)驗(yàn)無(wú)需鋪膠,在無(wú)菌上室中加入200 μL的細(xì)胞懸液(2×104個(gè)), 在下室中加入500 μL含有10%FBS培養(yǎng)基, 于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育8 h后,其余步驟參考侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 SLC1A5在ESCC組織中的表達(dá)情況

通過(guò)TNM plot在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.tnmplot.com/) 分析比較SLC1A5基因在ESCC組織和正常組織中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示, ESCC組織中的SLC1A5基因表達(dá)水平高于正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖1A。為進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果,本研究提取了新鮮ESCC組織及癌旁正常組織中的總RNA(18對(duì)),采用qRT-PCR對(duì)組織中SLC1A5表達(dá)水平進(jìn)行分析,結(jié)果顯示, ESCC組織中SLC1A5mRNA水平高于正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 見(jiàn)圖1B。此外,利用IHC分析了84例ESCC組織石蠟切片標(biāo)本中SLC1A5蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示, SLC1A5蛋白在癌旁組織(圖2 E、2F、2G、2H)中的表達(dá)水平低于癌組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2 A、2B、2C、2D)。以上結(jié)果提示, SLC1A5在ESCC組織中高表達(dá)。

A: TNM plot在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析比較食管癌組織及正常組織中SLC1A5基因表達(dá)差異; B: ESCC組織和正常組織中SLC1A5 mRNA表達(dá)差異。與正常組織比較, **P< 0.01。圖1 ESCC組織中SLC1A5 mRNA表達(dá)水平

A、B、C、D: SLC1A5蛋白在癌組織標(biāo)本中的IHC染色; E、F、G、H: SLC1A5蛋白在癌旁組織標(biāo)本中的IHC染色。A、C、E、G的原始放大倍數(shù)為100倍, B、D、F、H的原始放大倍數(shù)為200倍,比例尺為100 μm。圖2 SLC1A5在ESCC組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本中IHC染色的代表性圖片

2.2 SLC1A5表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系

根據(jù)上述IHC結(jié)果中SLC1A5的表達(dá)情況,將患者分為2組,即高表達(dá)組(>3分,n=60)和低表達(dá)組(≤3分,n=24), 并分析其表達(dá)情況與臨床病理資料的相關(guān)性,結(jié)果顯示, SLC1A5的表達(dá)與患者的臨床分期(P=0.036)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.029)呈正相關(guān),與年齡、性別、吸煙史、T分型、分化程度、腫瘤直徑無(wú)相關(guān)性(P>0.05), 見(jiàn)表2。

表2 SLC1A5表達(dá)和臨床病理資料的相關(guān)性分析[n(%)]

2.3 SLC1A5表達(dá)對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

構(gòu)建外源性SLC1A5穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的Eca109細(xì)胞(SLC1A5-OE組),利用WB驗(yàn)證SLC1A5過(guò)表達(dá)效率,確保穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞構(gòu)建成功,結(jié)果顯示,與對(duì)照組細(xì)胞(Con組)相比, SLC1A5-OE組細(xì)胞SLC1A5蛋白表達(dá)水平升高,見(jiàn)圖3A。為進(jìn)一步研究SLC1A5是否與ESCC細(xì)胞增殖、遷移能力有關(guān),細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示, SLC1A5-OE組和Con組細(xì)胞增殖能力比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)圖3B; Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Con組相比, SLC1A5-OE組細(xì)胞遷移和侵襲能力提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01), 見(jiàn)圖3C。

A: WB驗(yàn)證SLC1A5在Eca-109細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)效率; B: 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SLC1A5過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖能力的影響; C: Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SLC1A5過(guò)表達(dá)對(duì)Eca-109細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響(比例尺為50 μm)。2組比較, **P<0.01。圖3 上調(diào)SLC1A5表達(dá)對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

2.4 SLC1A5與TM4SF1存在相互作用

本課題組在前期工作中的質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)SLC1A5是TM4SF1的潛在相互作用蛋白[7], 故本研究首先在SLC1A5過(guò)表達(dá)的Eca-109細(xì)胞中,通過(guò)IP驗(yàn)證了其與TM4SF1的相互作用,見(jiàn)圖4。

圖4 IP檢測(cè)ESCC細(xì)胞中與SLC1A5存在相互作用的膜蛋白

2.5 SLC1A5-TM4SF1復(fù)合物促進(jìn)下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路活化及ESCC細(xì)胞遷移

為進(jìn)一步研究SLC1A5-TM4SF1復(fù)合物介導(dǎo)ESCC細(xì)胞遷移的分子機(jī)制,本研究在Con組或SLC1A5-OE組的Eca-109細(xì)胞中上調(diào)TM4SF1表達(dá),即TM4SF1過(guò)表達(dá)細(xì)胞(TM4SF1-OE組)、SLC1A5和TM4SF1共表達(dá)細(xì)胞(SLC1A5+TM4SF1組)。WB結(jié)果顯示,與Con組相比, TM4SF1-OE組細(xì)胞中p-mTOR、p-S6蛋白表達(dá)水平升高,在SLC1A5+TM4SF1組中進(jìn)一步提高,見(jiàn)圖5。對(duì)應(yīng)的Transwell實(shí)驗(yàn)比較了各組細(xì)胞遷移能力,結(jié)果顯示,與Con組相比, TM4SF1-OE組細(xì)胞遷移能力增強(qiáng); 分別與SLC1A5-OE組和TM4SF1-OE組比較, SLC1A5+TM4SF1組細(xì)胞遷移能力進(jìn)一步增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01), 見(jiàn)圖6。

圖5 WB檢測(cè)SLC1A5-TM4SF1復(fù)合物下游關(guān)鍵信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)

A: Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)SLC1A5、TM4SF1及SLC1A5-TM4SF1復(fù)合物對(duì)Eca-109細(xì)胞遷移能力的影響(比例尺為50 μm); B: 分別過(guò)表達(dá)SLC1A5、TM4SF1及SLC1A5-TM4SF1復(fù)合物對(duì)Eca-109遷移細(xì)胞數(shù)的影響。2組比較, *P<0.05, **P<0.01。圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SLC1A5-TM4SF1復(fù)合物介導(dǎo)的細(xì)胞遷移

3 討 論

隨著手術(shù)、放療、化療、免疫治療、靶向治療等技術(shù)不斷發(fā)展, ESCC的病死率有所下降。但由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和不可切除病灶的存在, ESCC患者5年生存率整體較低。因此,探索ESCC轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的相關(guān)機(jī)制,有助于篩選和發(fā)掘新的生物標(biāo)志物及有效的干預(yù)靶點(diǎn)[9]。

TNMplot是主要基于TCGA數(shù)據(jù)的在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù),該數(shù)據(jù)庫(kù)詳細(xì)記錄了臨床腫瘤患者正常組織、腫瘤組織及轉(zhuǎn)移組織的基因差異性表達(dá)。本研究通過(guò)TNMplot在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn),SLC1A5基因在ESCC組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織,并結(jié)合18對(duì)新鮮組織標(biāo)本對(duì)該結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。既往研究[10]發(fā)現(xiàn), SLC1A5表達(dá)的升高與多種上皮惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在肺癌中, SLC1A5轉(zhuǎn)錄受到MYC的直接調(diào)控,吸入高氧通過(guò)抑制MYC/SLC1A5軸驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)代謝重編程,抑制谷氨酰胺攝取及腫瘤轉(zhuǎn)移。在裸鼠動(dòng)物模型[5]中發(fā)現(xiàn),敲除SLC1A5顯著縮小了結(jié)腸腺癌和肺腺癌腫瘤的體積,表明SLC1A5是調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵分子。此外, SLC1A5可作為微小RNA-122(miRNA-122)、miRNA-199的直接靶標(biāo),發(fā)揮促進(jìn)卵巢癌、甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用[4, 11]。但SLC1A5在ESCC中的表達(dá)及臨床意義尚不確定,其對(duì)ESCC細(xì)胞生物學(xué)功能及機(jī)制的研究報(bào)道較少。本研究首次通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn),SLC1A5在ESCC組織中的表達(dá)高于正常組織,后續(xù)在配對(duì)的ESCC和癌旁組織中分別檢測(cè)SCL1A5mRNA及其蛋白水平表達(dá)情況,證實(shí)其在癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。經(jīng)過(guò)對(duì)84例患者的術(shù)后標(biāo)本分析,發(fā)現(xiàn)SLC1A5高表達(dá)與臨床腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。上述結(jié)果提示SLC1A5在ESCC中具有促癌作用,其具有作為預(yù)測(cè)食管癌轉(zhuǎn)移的可靠生物標(biāo)志物的潛力。

后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),在ESCC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SLC1A5可以促進(jìn)細(xì)胞遷移,同時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著影響。作為一項(xiàng)延續(xù)性研究,前期課題組的質(zhì)譜結(jié)果顯示, SLC1A5可能是TM4SF1的相互作用蛋白,因此推測(cè)SLC1A5可能通過(guò)膜功能復(fù)合物的形式調(diào)控ESCC的轉(zhuǎn)移。因此,本研究通過(guò)IP法驗(yàn)證了在ESCC細(xì)胞中SLC1A5與TM4SF1二者相互作用的存在,并證明了二者的協(xié)同調(diào)控在ESCC轉(zhuǎn)移中具有重要作用。SLC1A5通過(guò)AP1G1與EGFR相互作用,形成SLC1A5-AP1G1-EGFR異源三聚體復(fù)合物,且該復(fù)合物在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中是西妥昔單抗的靶點(diǎn)。西妥昔單抗治療后,以AP1G1依賴(lài)性方式誘導(dǎo)SLC1A5-EGFR復(fù)合物表達(dá)下調(diào),降低癌細(xì)胞的谷氨酰胺攝取及細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平,從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[6]。但TM4SF1同樣作為四跨膜蛋白,既往報(bào)道[12]證實(shí),其可以通過(guò)與不同的蛋白質(zhì)相互作用,形成TEMS, 進(jìn)而在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、腫瘤血管生成、侵襲偽足生成中發(fā)揮重要作用。例如, TM4SF2與整合素β1形成功能復(fù)合物,激活FAK-Src-Ras-ERK1/2信號(hào)通路,進(jìn)而誘導(dǎo)EMT, 增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[13]。此外,本研究發(fā)現(xiàn)TM4SF1通過(guò)與整合素α6相互作用,以層黏連蛋白依賴(lài)性方式激活FAK/PI3K/AKT信號(hào)通路,介導(dǎo)ESCC細(xì)胞遷移和侵襲[7]。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也可以與四跨膜蛋白結(jié)合形成膜功能復(fù)合物,參與調(diào)控疾病的病理表型。研究[14-15]發(fā)現(xiàn), TM4SF5可以結(jié)合胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(由SLC3A2和SLC7A11組成),介導(dǎo)肺纖維化期間細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和活性氧水平的調(diào)節(jié)。

mTOR信號(hào)經(jīng)常在腫瘤中被激活,通過(guò)控制不同代謝途徑的營(yíng)養(yǎng)攝取和流量、基于感知細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)來(lái)協(xié)調(diào)代謝重編程,支持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖。研究[16]發(fā)現(xiàn), SLC1A5通過(guò)與盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體1(DDR1)相互作用,以溶酶體依賴(lài)性的方式穩(wěn)定SLC1A5, 從而影響mTOR1信號(hào)通路,促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展。相反,用GPNA(SLC1A5的選擇性抑制劑)或SLC1A5小干擾RNA(SLC1A5 siRNA)處理的膀胱癌細(xì)胞中, mTORC1活性降低,且細(xì)胞的增殖和細(xì)胞活力受到顯著抑制[17]。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),在SLC1A5和TM4SF1共表達(dá)的Eca-109細(xì)胞中, mTOR下游關(guān)鍵信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子S6磷酸化增強(qiáng),揭示SLC1A5與TM4SF1相互作用誘導(dǎo)了mTOR信號(hào)通路激活。然而, TM4SF1-SLC1A5功能復(fù)合物如何調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究證實(shí)了SLC1A5在ESCC中高表達(dá),且與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。從分子機(jī)制層面來(lái)說(shuō),SLC1A5可能通過(guò)與TM4SF1形成膜功能復(fù)合物,激活下游的mTOR信號(hào)通路,從而促進(jìn)ESCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)可以為SLC1A5作為預(yù)測(cè)ESCC轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物及有效干預(yù)靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。