石禾云，張婭，楊豆豆，王超，張軍，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392；2. 天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津 300410；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，長(zhǎng)沙 410125）

為了滿(mǎn)足速溶茶等茶飲料的香氣，香氣富集回收技術(shù)成為目前香氣研究的一個(gè)熱點(diǎn)，同時(shí)也是難點(diǎn)，尤其回收無(wú)殘留、無(wú)污染、可食用的香氣物質(zhì)應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域更是不易。目前常用的香氣富集方法有溶劑萃取法[1]、超臨界CO2萃取法[2]、酶解法[3]、分子蒸餾法[4-5]等，這些方法大多適合于香氣提取檢測(cè)，不適合工廠大規(guī)模的生產(chǎn)加工，且有溶劑等有害物質(zhì)殘留，不利于食品加工領(lǐng)域。夏云敏[6]采用沸水沖泡紅茶后95 ℃水浸提2 min 過(guò)濾冷卻，再蒸餾（常壓蒸餾和減壓旋蒸）以完全蒸發(fā)完為終點(diǎn)收集茶香氣水，結(jié)果顯示常壓蒸餾法提取揮發(fā)性物質(zhì)總量和數(shù)量較多，但得到的茶香氣水有焦熟味；減壓旋蒸所得到的茶香氣水香氣與原茶湯較接近，但其茶香氣水的香氣較弱。

目前，有許多文獻(xiàn)對(duì)普洱茶中香氣成分進(jìn)行研究，但是對(duì)于普洱茶沖泡過(guò)程中香氣成分變化的研究較少。何理琴等[7]、王彩楠等[8]分別采用正山小種和武夷巖茶通過(guò)沸水浸泡，取浸泡后的茶湯進(jìn)行檢測(cè)分析香氣成分及其釋放規(guī)律。本試驗(yàn)采用冷凝回流的方式對(duì)普洱茶浸提過(guò)程中的香氣物質(zhì)進(jìn)行富集，并以富集后的茶香水為研究對(duì)象，對(duì)其香氣成分進(jìn)行研究。頂空固相微萃?。℉eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）技術(shù)分析普洱茶茶香水中的香氣成分，以期為普洱茶香氣回收技術(shù)提供分析技術(shù)和數(shù)據(jù)支撐，更為后期研究普洱茶香氣熱釋放規(guī)律、香氣物質(zhì)間相互作用及基質(zhì)組分對(duì)香氣物質(zhì)釋放的影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

普洱熟茶（古樹(shù)配方：古樹(shù)熟茶混合茶樣）由云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司提供；NaCl（色譜純）、正癸醇（分析純）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

低溫冷卻循環(huán)泵 無(wú)錫沃信儀器制造有限公司；DZTW 型調(diào)溫加熱套 天津天泰儀器有限公司；BCD-551WPCX 型冰箱 合肥美菱股份有限公司；Trace1310 ISQLT 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、自動(dòng)進(jìn)樣器、超純水機(jī) 美國(guó)Thermo 公司；HP-5MS 石英毛細(xì)管色譜柱 美國(guó)Agilent 公司；75 μm CAR/PDMS 固相微萃取萃取頭 美國(guó)Supelco 公司；移液槍 德國(guó)Eppendorf 公司；ME204T 型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo 公司；標(biāo)準(zhǔn)篩上虞市五星沖壓篩具廠；高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.1.3 樣品制備

普洱茶冷凝回流茶香水樣品制備：稱(chēng)取普洱茶300 g，裝入5 000 mL 圓底燒瓶，加入2.4 L 沸水，采用加熱套給圓底燒瓶加熱，圓底燒瓶上方連接轉(zhuǎn)接口再連冷凝管，冷凝管連接低溫冷卻循環(huán)泵，低溫冷卻循環(huán)泵不斷將0～2 ℃冷凝水循環(huán)進(jìn)冷凝管中，使冷凝管一直處于低溫狀態(tài)，冷凝管另一端放置500 mL三角瓶接收冷凝回流茶香氣水，當(dāng)三角瓶中茶香氣水達(dá)到500 mL 時(shí)停止接收并密封，放入4 ℃冰箱，待測(cè)。

普洱茶茶葉樣品制備：普洱茶茶葉用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60 目篩，待測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 GC-MS 條件

樣品前處理：用移液槍吸取1 mL1.1.3 制備的茶香水樣品和10 μL 正癸醇（內(nèi)標(biāo)物，質(zhì)量濃度0.133 mg/mL），并用電子分析天平稱(chēng)取不同百分比的NaCl 加入20 mL 頂空瓶中，HS-SPME 程序使用Thermo 自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行，樣品在孵化爐中平衡10 min 后，在不同萃取溫度和不同萃取時(shí)間條件下 ，使用75 μm CAR/PDMS 萃取頭在孵化爐中經(jīng)過(guò)萃取后，立即進(jìn)GC-MS 進(jìn)樣口解吸附5 min 進(jìn)行分析。

普洱茶茶葉檢測(cè)根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行，按茶水比1∶3，將5 mL 二純水、1.66 g 茶葉、20 μL 正癸醇（內(nèi)標(biāo)物，質(zhì)量濃度0.133 mg/mL）、40%NaCl（2 g）加入20 mL 頂空瓶，萃取時(shí)間60 min、萃取溫度61 ℃。其他檢測(cè)條件均與茶香水檢測(cè)一致。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

GC 條件：色譜柱HP-5MS 石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣使用氦氣（純度≥99.999%），流速1.0 mL/min，升溫程序參考徐詠全等[9]的研究。分流模式：分流比為30∶1。

MS 條件：電子電離（Electron ionization，EI）源；電離能量70 eV；離子源溫度：250 ℃；傳輸線(xiàn)溫度：250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～450，溶劑延遲時(shí)間為3 min。

1.2.2 HS-SPME 萃取條件單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以普洱茶冷凝回流茶香水被檢出的香氣化合物總峰面積為考察指標(biāo)，分別研究萃取溫度（30、45、60、75 ℃）、萃取時(shí)間（40、50、60、70 min）、NaCl 的添加量（0、10%、20%、30%、40%）3個(gè)因素對(duì)香氣化合物萃取效果的影響，以普洱茶冷凝回流茶香水中香氣化合物總峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，總峰面積越大說(shuō)明萃取效果越好。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，為增加試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，以被檢出率大于50%的香氣化合物總峰面積為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GC-MS 分析所得的色譜圖經(jīng)過(guò)NIST 譜庫(kù)檢索定性。取匹配度大于700 的揮發(fā)性化合物，根據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道建立普洱茶香氣物質(zhì)及其呈香描述自建庫(kù)，將檢測(cè)到的香氣物質(zhì)采用響應(yīng)面軟件Design Expert 12 和Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2021 作圖。用內(nèi)標(biāo)半定量方法分析茶葉和茶香水中各組分的含量，計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取溫度對(duì)總峰面積的影響

按照1.2.1 方法，添加30%NaCl，分別在30、45、60、75 ℃條件下萃取50 min 后，考察不同萃取溫度對(duì)普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積的影響，從而選擇合適的萃取溫度。試驗(yàn)結(jié)果如圖1。

圖1 萃取溫度對(duì)香氣物質(zhì)總峰面積的影響

在HS-SPME 使用自動(dòng)進(jìn)樣器模式進(jìn)樣時(shí)，萃取溫度就是孵化爐的設(shè)置溫度，自動(dòng)進(jìn)樣器先將樣品放入孵化爐中平衡10 min 后，樣品溫度上升到與孵化爐溫度一致，開(kāi)始萃取。圖1 中，在萃取時(shí)間和NaCl 添加量固定的條件下，隨著萃取溫度的增加普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在30～60 ℃總峰面積快速上升，60 ℃時(shí)香氣物質(zhì)的平均總峰面積最大，60 ℃之后總峰面積快速下降。故本試驗(yàn)選擇萃取溫度為60 ℃進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.2 萃取時(shí)間對(duì)總峰面積的影響

按照1.2.1 方法，添加30%NaCl，萃取溫度為60 ℃，萃取時(shí)間分別為40、50、60、70 min?？疾觳煌腿r(shí)間對(duì)普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積的影響。從而選擇合適的萃取時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)香氣物質(zhì)總峰面積的影響

在HS-SPME 前處理試驗(yàn)中，萃取時(shí)間是指將一定纖維涂層的萃取頭暴露于頂空瓶中樣品上空并吸附樣品中揮發(fā)性化合物的時(shí)間。圖2 中，在萃取溫度和NaCl 添加量固定的條件下，隨著萃取時(shí)間的增加普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在萃取40～50 min 總峰面積快速上升，50 min 時(shí)總峰面積達(dá)到最大值。50 min 之后總峰面積快速下降，60～70 min下降速度緩慢。這一變化可能是開(kāi)始時(shí)香氣物質(zhì)從樣品中快速向萃取頭表面擴(kuò)散，隨著萃取時(shí)間的增加萃取頭表面逐漸趨于飽和，吸附不了更多物質(zhì)，反而使萃取頭中的物質(zhì)向空氣或者樣品中擴(kuò)散。本試驗(yàn)選擇萃取時(shí)間為50 min 作為最佳條件進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.3 NaCl 添加量對(duì)總峰面積的影響

按照1.2.1 方法，加入0、10%、20%、30%和40%NaCl，添加量相應(yīng)為0、0.1、0.2、0.3 和0.4 g/mL。在60 ℃條件下萃取50 min，考察不同NaCl 添加量對(duì)普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積的影響。從而選擇合適的NaCl 添加量。試驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3 NaCl 添加量對(duì)香氣物質(zhì)總峰面積的影響

由圖3 結(jié)果顯示，在萃取溫度和萃取時(shí)間固定的條件下，隨著NaCl 添加量的增加普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積也不斷增大，NaCl添加量在30%之后總峰面積增速開(kāi)始下降，可能是NaCl 趨于飽和的原因，添加40%的NaCl 時(shí)香氣物質(zhì)的平均總峰面積最大，萃取效果最好。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果驗(yàn)證

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)表1 中響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)以所有檢測(cè)的響應(yīng)面樣品中被檢出率大于50%的香氣化合物平均總峰面積作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

利用Design Expert 12 響應(yīng)面軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到二次多項(xiàng)回歸模型：Y＝6.410＋0.372A＋0.502B＋2.350C＋0.068AB－0.258AC＋0.379BC－0.979A2－0.327B2－0.100C2。

由表3 可知，該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.140 6），復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方r2＝0.985 0，校正復(fù)相關(guān)系數(shù)為radj2＝0.965 8，說(shuō)明該模型可以解釋96.58%試驗(yàn)所得色譜峰面積的變化，表明回歸方程擬合度良好。Y的變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）表示試驗(yàn)的精確度，CV 值越低，試驗(yàn)的可靠性越高，本試驗(yàn)中CV＝5.90%＜10%，說(shuō)明試驗(yàn)方法可靠[10]。從表中可以看出，B、C、A2對(duì)普洱茶冷凝回流茶香水香氣物質(zhì)總峰面積的影響為極顯著（P＜0.01），A對(duì)香氣物質(zhì)總峰面積的影響為顯著（P＜0.05），說(shuō)明萃取時(shí)間和NaCl添加量對(duì)普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分萃取影響很大，而且說(shuō)明萃取溫度對(duì)普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分萃取的影響以非線(xiàn)性變化為主[11]。響應(yīng)曲面坡度彎曲程度，反映各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響敏感程度，曲面越陡峭，各因素的交互作用對(duì)于響應(yīng)值的影響程度越大，反之則影響越小。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程方差分析

根據(jù)圖4 中曲面陡峭程度，可以得出各因素交互作用對(duì)普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分萃取效果影響程度排序?yàn)椋狠腿囟扰c萃取時(shí)間＞萃取時(shí)間與NaCl 添加量＞萃取溫度與NaCl 添加量。

2.2.2 模型驗(yàn)證

對(duì)回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到HS-SPME 法分析普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分的最佳條件為萃取時(shí)間60 min、萃取溫度61.38 ℃、NaCl 添加量40%，預(yù)測(cè)普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分總峰面積為9.223×109。調(diào)整最佳條件為萃取時(shí)間60 min、萃取溫度61 ℃、NaCl 添加量40%進(jìn)行模型驗(yàn)證。此條件下，普洱茶冷凝回流茶香水香氣成分總峰面積為10.025×109，測(cè)出的試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值接近，且試驗(yàn)值比預(yù)測(cè)值高，說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型良好。

2.2.3 普洱茶香氣成分分析

在頂空固相微萃取條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用GC-MS 對(duì)普洱茶茶香水和茶葉進(jìn)行定性和定量分析，得到普洱茶茶香水和茶葉總離子流色譜圖如圖5 和圖6 所示。

圖6 普洱茶茶葉GC-MS 總離子流色譜圖

根據(jù)普洱茶茶香水和茶葉揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果與普洱茶香氣物質(zhì)及其呈香描述自建庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，得到普洱茶茶香水和茶葉中的香氣成分及其呈現(xiàn)氣味如表4 所示。

由表4 可知，普洱茶冷凝回流茶香水中被檢出率大于50%的香氣化合物有31 種，（E，E）-2，4-庚二烯醛、1，2，3-三甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯、3，4-二甲氧基甲苯、α-松油醇、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酮、芳樟醇、（Z）-茉莉酮、香葉醇、異佛爾酮、棕櫚酸乙酯等15 個(gè)香氣物質(zhì)被檢出率為100%，改變NaCl 添加量、萃取時(shí)間、萃取溫度等條件后依然能在樣品中檢測(cè)到，可見(jiàn)這些物質(zhì)是普洱茶中較為重要的香氣化合物，且穩(wěn)定性較好。

在響應(yīng)面最佳前處理?xiàng)l件下檢測(cè)分析結(jié)果顯示，普洱茶中主要含有甲氧基苯類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)等六大類(lèi)香氣成分，其中甲氧基苯類(lèi)主要貢獻(xiàn)陳香、木香的香氣[18]；醇類(lèi)主要呈現(xiàn)玫瑰等甜花香；酮類(lèi)主要呈現(xiàn)果香、紫羅蘭等花香香氣。GC-MS 的檢測(cè)結(jié)果顯示，在普洱茶茶葉中檢測(cè)出揮發(fā)性化合物92 種，其中有30 種在目前已有的茶文獻(xiàn)中被鑒定為呈香成分，它們的總含量為7.60 mg/L，其中醛類(lèi)8 種（0.51 mg/L），醇類(lèi)7 種（0.90 mg/L），酮類(lèi)6 種（0.34 mg/L），甲氧基苯類(lèi)4 種（4.74 mg/L），酯類(lèi)3 種（0.91 mg/L），其他化合物2 種（0.21 mg/L）；提取出的茶香水中揮發(fā)性化合物有144 種，呈香成分有30 種，總含量 16.30 mg/L，包括8 種醇類(lèi)（2.63 mg/L）、8 種酮類(lèi)（3.02 mg/L）、6 種醛類(lèi)（2.10 mg/L）、4 種甲氧基苯類(lèi)（7.85 mg/L）、3 種酯類(lèi)（0.63 mg/L）、其他化合物1 種（0.49 mg/L）。因此，從揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量上來(lái)看，茶香水中揮發(fā)性化合物比茶葉多52種，且茶香水中包含了茶葉中絕大部分香氣成分；從香氣成分含量上來(lái)看，和普洱茶葉相比，提取出的茶香水香氣成分總含量增加了2.14 倍，具有普洱茶獨(dú)特陳香的甲氧基苯類(lèi)物質(zhì)增加1.66 倍，尤其是普洱茶中陳香的主要貢獻(xiàn)性香氣物質(zhì)1，2，3-三甲氧基苯；醛類(lèi)增加4.12 倍；醇類(lèi)增加2.92 倍；酮類(lèi)增加9.01 倍；而酯類(lèi)物質(zhì)則減少。這種不同程度增加和下降的原因還可能與普洱茶主要水溶性基質(zhì)組分和香氣物質(zhì)相互作用有關(guān)[19]。此外，茶香水中以花香和果香為主的酮類(lèi)物質(zhì)與其他物質(zhì)的相對(duì)含量增率最大，一定程度上增加了其花香和果香的比例，因此，香氣物質(zhì)之間的相互作用，使得茶香水中甲氧基苯類(lèi)物質(zhì)的陳味、霉味、草藥味受到抑制[20]，使提取出的茶香水除了具有陳味、草藥味外，還具有更多的花香和果香等特征香氣。提取出的茶香水香氣物質(zhì)含量的增加說(shuō)明這種香氣富集回收技術(shù)具有可行性，此技術(shù)不需要溶劑萃取，安全無(wú)污染且操作簡(jiǎn)單，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

除了香氣化合物含量，香氣閾值也是一個(gè)值得關(guān)注的指標(biāo)。氣味閾值即該化合物在水中的嗅覺(jué)閾值濃度，低閾值的化合物很可能是重要賦香化合物[21]，試驗(yàn)中可以將化合物的含量與其氣味閾值同時(shí)作為考察其對(duì)于普洱茶整體香氣貢獻(xiàn)程度的指標(biāo)。某化合物的含量與其氣味閾值的比值等于氣味活性值（Odor activity value，OAV）[22]，OAV 經(jīng)常用于評(píng)價(jià)化合物對(duì)香氣的貢獻(xiàn)程度，OAV 越大，則該化合物對(duì)香氣貢獻(xiàn)越大，某些化合物雖然在樣品中的含量低，但其氣味閾值也很低的情況下，OAV 值就高[23]。含量不是很高但閾值較低的化合物有：香葉醇、芳樟醇和α-紫羅蘭酮，說(shuō)明這幾個(gè)香氣化合物的香氣貢獻(xiàn)率也不低，給普洱茶增加了更多的木香、花香等特征香氣。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析得到普洱茶冷凝回流茶香水HS-SPME 最佳萃取時(shí)間60 min、萃取溫度61 ℃、NaCl 添加量40%，在此條件下，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近，且驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果高于預(yù)測(cè)值，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性和準(zhǔn)確性良好。并從普洱茶冷凝回流茶香水中檢測(cè)出31 種被檢出率大于50%的香氣化合物，被檢出率等于100%的香氣化合物有15 種。在響應(yīng)面試驗(yàn)得到的最優(yōu)條件下檢測(cè)普洱茶茶葉，與茶香水相比較，發(fā)現(xiàn)采用冷凝回流方式收集的茶香水中揮發(fā)性化合物比茶葉原料中的揮發(fā)性化合物多52 種，茶香水中主要香氣物質(zhì)與普洱茶茶葉基本一致，以1，2，3-三甲氧基苯為首的甲氧基苯類(lèi)物質(zhì)含量均最高，為普洱茶茶香水和茶葉中主要的香氣化合物。此香氣回收技術(shù)提取出的茶香水香氣物質(zhì)含量比茶葉原料中的香氣物質(zhì)含量增加了2.14 倍，這種香氣富集回收技術(shù)具有可行性，此技術(shù)不需要溶劑萃取，安全無(wú)污染，操作簡(jiǎn)單，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。茶香水中不同種類(lèi)化合物不同程度增加或者下降的原因有可能與普洱茶基質(zhì)組分和香氣釋放相互作用有關(guān)，香氣釋放規(guī)律及影響香氣釋放因素等還需深入研究。本文采用冷凝回流的方式進(jìn)行普洱茶中香氣物質(zhì)的富集及茶香水中香氣物質(zhì)的研究，為普洱茶沖泡過(guò)程中香氣熱釋放規(guī)律及基質(zhì)組分對(duì)香氣釋放影響的研究提供了理論基礎(chǔ)。