謝占維 孫玲玲 石瑞 孫亞萍 崔怡嫻 田軍彪

卒中是全球第二大死亡原因,也是導致疾病負擔增加的第三大原因[1],其中缺血性卒中(cerebral ischemic stroke,CIS)占比約為62.4%,屬中醫(yī)學“中風病”范疇。靜脈溶栓是急性缺血性卒中治療的基石,盡管血管內(nèi)治療已經(jīng)得到長足發(fā)展,但諸多患者仍因時間窗和禁忌癥無法從中獲益[2]。即使閉塞血管再通,缺血區(qū)恢復血流灌注,仍有神經(jīng)功能受損風險,這與發(fā)生了腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemic reperfusion injury,CIRI)有關(guān)[3]。有效保護神經(jīng)血管單元(neurovascular unit,NVU)是改善中風患者神經(jīng)功能最主要的策略。NVU主要由神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞(少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞)、血管細胞(內(nèi)皮細胞、周細胞和平滑肌細胞)和基底層組成,在卒中發(fā)生后的信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮重要作用[4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth inhibitor,VEGF)和Notch信號通路參與了神經(jīng)、血管再生過程, 對于卒中后NVU的修復有調(diào)節(jié)作用[5-6]。益氣活血化濁解毒方是依據(jù)“氣虛血瘀,濁瘀毒損”的病機制定的中藥復方。課題組前期化濁解毒活血通絡方的研究表明[7-8],該方可以抑制Toll樣受體4/核因子-κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor-kappa B,TLR4/NF-κB)通路過度激活,降低促炎因子白細胞介素-1β(interleukin 1β, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)表達,調(diào)控Beclin1等自噬相關(guān)蛋白表達,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本課題擬建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型,探討益氣活血化濁解毒方對腦組織VEGF、Notch1、Dll4表達的影響,初步探究益氣活血化濁解毒方對NVU的保護作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

96只SPF級健康雄性SD大鼠,6～8周周齡,體質(zhì)量(240±20)g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK-(京)2021-0011。所有實驗動物分籠飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學院實驗動物中心屏蔽環(huán)境內(nèi),實驗動物使用許可證號:SYXK(冀)2017-005,室溫21～25℃,濕度50%～70%,均自由進食及飲水,實驗動物于造模前適應性喂養(yǎng)7天,術(shù)前12小時禁食不禁水。本實驗通過河北中醫(yī)學院倫理委員會批準,倫理編號為:DWLL202205006。

1.2 實驗藥物

益氣活血化濁解毒方藥物組成:黃芪20 g、川芎15 g、石菖蒲15 g、地龍12 g、丹參15 g、赤芍15 g、黃連6 g、郁金12 g、茯苓12 g、澤瀉10 g。為廣東一方制藥有限公司免煎顆粒制劑,批號分別為1040403、1043403、1030043、0113893、1012413、1031133、1052213、1051183、1050913、1041763。尼莫地平片規(guī)格為20 mg/片,批準文號為:國藥準字H13022049,由河北醫(yī)科大學制藥廠生產(chǎn)。以上藥物均購于河北省中醫(yī)院藥房。

1.3 主要試劑

2636A4型MCAO線栓(北京西濃科技有限公司),2%TTC染色液(G3005-500,北京索萊寶科技有限公司),4%細胞組織固定液(C01-06002-500ML,北京博奧森生物技術(shù)有限公司),蘇木素—伊紅染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司),TRNzol總RNA提取試劑(天根生化科技北京有限公司),TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A,寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司),TaKaRa qPCR反應體系(RR820A,寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司),VEGF、Notch1、DLL4抗體(BA12086103、BJ12239265、AE042920,北京博奧森生物技術(shù)有限公司),β-actin(12w2944,江蘇親科生物研究中心有限公司),山羊抗兔二抗(BE0101,深圳易瑞生物技術(shù)有限公司),DAB顯色試劑盒(216180927,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.4 實驗儀器

高速離心機(LDZ5-2型,北京離心機廠),干燥箱(MIR-153型,日本三洋公司),切片機(RM2015,德國萊卡公司),數(shù)碼顯微鏡(BX43型,日本奧林巴斯公司),NanoDrop分光光度計(ND-2000型,Thermo fisher),熒光定量PCR儀(ABI7500型,Applied Biosystems),電泳儀、凝膠玻璃板、固定夾、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽(北京六一儀器廠)。

1.5 動物模型制備

本實驗采用Zea-longa線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型[9]。造模大鼠體質(zhì)量250～280 g。用2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,仰臥位固定,頸部備皮,碘伏消毒后于頸部正中切口,逐層分離組織,暴露右側(cè)頸總動脈,并將繼續(xù)向遠心端分離出一段頸內(nèi)動脈和頸外動脈。于頸總動脈近心端和頸外動脈起始部穿線系活結(jié),頸外動脈遠心端系兩個死結(jié)。用微動脈夾夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈,于頸外動脈中部剪一倒“v”型小口,用鑷子將線栓插入血管,當線栓頭部通過頸外動脈起始部進入頸總動脈,系緊頸外動脈起始部的線。在頸外動脈遠端兩個死結(jié)之間剪斷,提起頸外動脈殘端,打開頸內(nèi)動脈處的微動脈夾,將線栓小心送至頸內(nèi)動脈,線栓頭端部朝著內(nèi)上方小心向血管內(nèi)推進,從頸內(nèi)動脈和頸外動脈分叉處開始計算線栓插入長度約18～22 mm,當感覺有輕微阻力時停止進栓,此時線栓頭部的小球即到達大腦中動脈的起始部。再次系緊頸外動脈起始部,打開頸總動脈處的微動脈夾,缺血2小時后拔出線栓,結(jié)扎血管并消毒縫合。假手術(shù)組僅進行血管分離及縫合,不插入線栓。待實驗動物清醒后進行Zea-Longa神經(jīng)功能評分[10],該評分分為0～4分:0分,無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分,癱瘓側(cè)前爪不能完全伸展;2分,行走時向癱瘓側(cè)偏移甚至轉(zhuǎn)圈;3分,行走時向癱瘓側(cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走并出現(xiàn)意識障礙。剔除0分和4分的動物,評分≥1分即可從神經(jīng)缺損評分角度認為造模成功。

1.6 分組與給藥

造模前隨機選取12只作為假手術(shù)組,其余84只大鼠進行造模。本實驗中,大鼠造模失敗共19只,模型制備成功率約為77.4%。隨機選取造模成功的60只大鼠,采用隨機數(shù)字表法分為模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組和尼莫地平組,每組12只。中藥低、中、高劑量組分別按照13.75g/(kg·d)、27.5 g/(kg·d)、55.0 g/(kg·d)進行中藥灌胃,尼莫地平組按照9.375 mg/(kg·d)進行灌胃,假手術(shù)組和模型組予等量生理鹽水灌胃,連續(xù)灌胃3天。連續(xù)再灌注72小時后腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉,斷頭獲取腦組織,一部分-80℃冰箱保存,另一部分固定于4%多聚甲醛溶液。

1.7 觀察和檢測指標

1.7.1 神經(jīng)功能缺損評分 腦缺血再灌注72小時后采用改良版大鼠神經(jīng)功能評分(mNSS評分)進行評估,mNSS評分能從宏觀上反映腦缺血大鼠病理狀態(tài)的嚴重程度,是目前評價局灶性缺血模型構(gòu)建和評價潛在治療方案的“金標準”[11]。主要根據(jù)運動試驗、感覺試驗、反射喪失和不正常運動以及肌張力障礙等四項內(nèi)容進行評分,共計18分。1～6分為輕度神經(jīng)功能損傷,7～12分為中度神經(jīng)功能損傷,13～18分為重度神經(jīng)功能損傷。

1.7.2 腦梗死面積測定 腦缺血再灌注72小時后每組取3只大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉,3分鐘內(nèi)迅速斷頭取腦,放置于特定腦模裝置內(nèi),-20℃冰箱內(nèi)冷凍10分鐘,冠狀位將大腦用腦模均分為5片。將切好的腦片放入2% TTC 染液中,37℃避光染色20分鐘,4%多聚甲醛固定,將染好的腦片排列于平板上拍照,正常腦組織著深紅色,梗死腦組織成白色。隨后應用Image J軟件進行圖像處理,測量腦片面積及梗死灶面積,并計算梗死灶面積占整腦面積百分比。

1.7.3 免疫組化檢測腦組織VEGF蛋白表達 每組取3只固定于4%多聚甲醛溶液中的大鼠腦組織,石蠟包埋后切片,對切片進行脫蠟和水化處理。進行抗原熱修復,雙氧水去除內(nèi)源性的過氧化物酶,分別滴加一抗VEGF(稀釋比例1∶100),4 ℃冰箱過夜孵育,滴加山羊抗兔二抗工作液,使用DAB 顯色,復染細胞核,返藍后封片。以胞核及(或)胞漿中呈黃色至棕黃色表達為陽性細胞,每張切片隨機選取3個高倍鏡視野(×400),應用Image J軟件測定陽性區(qū)光密度值,取其均值作為該鼠的平均光密度值。

1.7.4 q-PCR檢測腦組織Notch1、Dll4 mRNA表達 從-80℃冰箱中取每組3只大鼠腦組織50 mg,剪碎放入研缽中研磨,采用TRNzol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取,使用NanoDrop分光光度計測定RNA濃度和純度,采用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit進行反轉(zhuǎn)錄,以此cDNA作為熒光定量模板,引物由GENEWIZ提供,引物序列見表1,通過TaKaRa TB Green Premix Ex Taq II(2X)反應體系進行擴增。根據(jù)q-PCR檢測結(jié)果,按照2-△△ct相對定量計算公式計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果。

表1 引物序列

1.7.5 Western blot檢測腦組織VEGF、Notch1、Dll4蛋白表達 從-80℃冰箱中取每組3只大鼠腦組織100 mg,研磨至細粉末狀,加入RIPA裂解液,離心提取上清液,測定蛋白濃度,95℃變性后SDS-PAGE 凝膠電泳,轉(zhuǎn)模至PVDF膜上,封閉液中封閉1小時,將封閉后的膜放入一抗工作液中(VEGF、Notch1、Dll4稀釋比例為1∶1000,β-actin稀釋比例為1∶10000),4℃反應過夜。洗膜3次后放入二抗工作液中室溫孵育1小時,再次洗膜后進行曝光洗片,掃描膠片,采用Image J軟件測定Western blot條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損,其余各組均有不同程度神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。與假手術(shù)組相比,模型組神經(jīng)功能缺損評分顯著提高(P<0.05);與模型組相比,中藥低、中、高劑量組及尼莫地平組大鼠神經(jīng)功能缺失評分均有所降低(P<0.05),其中中藥高劑量組神經(jīng)功能缺失評分下降最為明顯。各治療組組間比較結(jié)果顯示,除中藥低、中劑量組與尼莫地平組無統(tǒng)計學意義外,余治療組間均有顯著差異。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分比較鼠只=12)

2.2 各組大鼠腦梗死面積比較

假手術(shù)組大鼠腦組織TTC染色通體呈深紅色,其余各組均可見白色梗死灶。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦梗死面積顯著增加(P<0.05);與模型組相比,中藥低、中、高劑量組及尼莫地平組大鼠腦梗死面積均顯著縮小(P<0.05),其中中藥高劑量組梗死面積縮小最為顯著。各治療組組間比較結(jié)果顯示,中藥中劑量組與尼莫地平組組間無統(tǒng)計學差異,其余各治療組間均有明顯差異。結(jié)果見表3、圖1。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色

表3 各組大鼠腦梗死面積百分比比較鼠只=3)

2.3 各組大鼠腦組織VEGF蛋白免疫組化比較

光鏡下觀察到VEGF蛋白主要表達于腦缺血區(qū)神經(jīng)細胞胞漿中,呈現(xiàn)棕黃色。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠平均光密度值顯著增大(P<0.05);與模型組相比,中藥低、中、高劑量組及尼莫地平組平均光密度值顯著增大(P<0.05),其中中藥高劑量組平均光密度值增大最為明顯,中藥低劑量組、中藥中劑量組、尼莫地平組組內(nèi)比較無統(tǒng)計學意義,但與中藥高劑量組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),結(jié)果見表4、圖2。

圖2 各組大鼠腦組織VEGF蛋白表達免疫組化(×400)

表4 各組大鼠腦組織VEGF蛋白表達的平均光密度值比較鼠只=3)

2.4 各組大鼠腦組織Notch1、Dll4 mRNA表達水平比較

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織Notch1、Dll4 mRNA表達增加(P<0.05);與模型組相比,中藥低、中、高劑量組及尼莫地平組大鼠腦組織Notch1、Dll4 mRNA表達明顯增加(P<0.05)。其中中藥高劑量組大鼠腦組織Notch1、Dll4 mRNA表達最顯著,中藥低劑量組、中藥中劑量組、尼莫地平組與中藥高劑量組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠腦組織Notch1、Dll4 mRNA表達比較鼠只=3)

2.5 各組大鼠腦組織VEGF、Notch1、Dll4 蛋白表達水平比較

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織VEGF、Notch1、Dll4蛋白表達增加(P<0.05);與模型組相比,中藥低、中、高劑量組及尼莫地平組大鼠腦組織VEGF、Notch1、Dll4 蛋白表達明顯增加(P<0.05)。中藥高劑量組大鼠腦組織VEGF、Notch1、Dll4 蛋白表達最為顯著,中藥低劑量組和尼莫地平組大鼠腦組織VEGF、Notch1、Dll4蛋白表達與中藥高劑量組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05),中藥中劑量組大鼠腦組織的VEGF與Dll4蛋白表達與中藥高劑量組相比亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見表6、圖3。

注: A 假手術(shù)組;B 模型組;C 中藥低劑量組;D 中藥中劑量組;E 中藥高劑量組;F 尼莫地平組。圖3 各組大鼠腦組織VEGF、Notch1、Dll4 蛋白表達比較

表6 各組大鼠腦組織VEGF、Notch1、Dll4蛋白相對表達量比較鼠只=3)

3 討論

缺血性中風患者以老年人多見,患者年老氣虛或久病體虛導致血運無力,瘀血阻滯經(jīng)脈,腦失所養(yǎng)、神機失守,發(fā)為中風。腦為“元神之府”,是主宰生命活動的重要器官,卒中發(fā)生后氣機逆亂,血不行則生瘀血,津不化則釀生痰濁,痰熱瘀血醞釀化毒,火熱毒邪盤踞于內(nèi),進一步損傷腦絡,使病情加重或反復發(fā)作,遂認為“氣虛血瘀”是CIS的重要病理基礎,“濁瘀毒損”是CIS的主要病機特點,故提出益氣活血化濁解毒方。方中黃芪益氣補虛,旨在“氣旺則血行”,川芎為血中之氣藥,通達腦絡氣血,石菖蒲化痰開竅,三藥為君。地龍息風通絡,丹參去瘀生新,赤芍涼血活血,茯苓健脾滲濕,共為臣藥。郁金活血理氣,清心開竅。黃連苦能去濁,澤瀉滲濕泄熱,為方中之佐藥,川芎又可引諸藥上達頭目,為方中之使藥,全方共奏益氣通絡化濁解毒之功。本方在傳統(tǒng)益氣活血方藥的基礎上,增強對風、火、痰、瘀、毒等病理因素及其成因的干預,將益氣活血與化濁解毒功效的常用中藥酌量配伍,已在臨床中取得良好的臨床效果,但其具體作用機制尚不明確,遂對其開展基礎研究。

CIRI是CIS發(fā)生后最主要的病理生理過程,血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)損傷、炎癥反應、氧化應激、興奮性氨基酸釋放、鈣超載等諸多環(huán)節(jié)參與其中,各環(huán)節(jié)相互關(guān)聯(lián)和重疊,最終導致缺血區(qū)細胞的凋亡或壞死[12]。神經(jīng)與血管功能之間的密切聯(lián)系是腦血循環(huán)最顯著的特征之一。有研究表明,CIS會導致NVU穩(wěn)態(tài)遭到破壞,NVU中的細胞和非細胞基質(zhì)組分相互作用聯(lián)系,共同引起B(yǎng)BB通透性破壞,神經(jīng)元功能障礙,神經(jīng)傳導束傳導異常[13]。BBB是NVU表現(xiàn)出的一種功能表型,其緊密連接結(jié)構(gòu)被認為是構(gòu)成BBB的重要結(jié)構(gòu)和功能基礎[14-15]。課題組前期研究表明[16-17],化濁解毒活血通絡方通過增加閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens protein,ZO-1)、閉合蛋白(Occludin)等緊密連接蛋白表達,減少水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)、水通道蛋白9(aquaporin 9,AQP9)等水通道蛋白表達,來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮間緊密連接,減輕血管源性水腫,進而調(diào)節(jié)NUV各組分間的關(guān)系,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。維持NVU穩(wěn)態(tài)是改善缺血性卒中的要點,VEGF和Notch信號通路在保護NVU,減輕CIRI損傷方面發(fā)揮重要作用[18-19]。

VEGF是一種具有血管通透性的蛋白質(zhì),是血管和淋巴管發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子,參與腦缺血后的血管生成、能量代謝、軸突生長等一系列神經(jīng)損傷修復的過程[20-21]研究表明,在缺血、缺氧和低灌注的刺激下,VEGF在神經(jīng)元、血管內(nèi)皮、小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞的表達顯著上調(diào),通過促進血管新生以改善局部血流發(fā)揮腦保護作用。VEGF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員,可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的可塑性,增強神經(jīng)元的生存活性來發(fā)揮神經(jīng)修復功能[22-23]。Notch信號通路是在進化上高度保守的單次跨膜信號受體蛋白家族,它可由VEGF激活,亦可刺激VEGF表達[24]。Notch信號通路由Notch受體(Notch1-Notch4)、Notch配體(Dll1、Dll3、Dll4,Jagged 1和Jagged 2)和轉(zhuǎn)錄因子CBF1/RBP-Jκ組成[25]。有研究表明[26-27],Notch1可以誘導梗塞周圍區(qū)域的血管生成,抑制小膠質(zhì)細胞活化減輕腦缺血后的炎癥反應,阻斷Notch1的表達會導致神經(jīng)營養(yǎng)作用消失。He Huang等人的研究還證實[28],Notch1還可通過促進神經(jīng)干細胞分化改善神經(jīng)功能。Dll4主要在新生血管尖端細胞中表達,可以與鄰近細胞的Notch受體結(jié)合,激活Notch信號通路促進新生血管形成[29]。Dll4也可以通過調(diào)控Notch信號誘導神經(jīng)生發(fā)的過程[30]。

本研究結(jié)果表明,益氣活血化濁解毒方可以改善大鼠神經(jīng)功能缺損,減少大鼠腦梗死面積,增加腦皮質(zhì)缺血區(qū)VEGF、Notch1、Dll4蛋白表達和Notch1、Dll4 mRNA的表達,推測益氣活血化濁解毒方可以通過VEGF/Notch通路保護NVU發(fā)揮腦保護作用。中藥具有多組分、多靶點、多機制的作用特點,符合NVU多細胞的結(jié)構(gòu)、功能特點及“多細胞保護”治療策略。課題組將進一步研究益氣活血化濁解毒方對NVU的作用機制,為其在臨床中使用和推廣提供實驗基礎和理論依據(jù)。