李佳豪 王建云 李靜蘭 李北平 王海軍

抑郁癥是一種臨床常見的精神障礙疾病,以持續(xù)情緒低落、思維認(rèn)知障礙、運動減緩為主要臨床特征[1]。不僅嚴(yán)重影響著人們的生活,甚至對整個家庭帶來各種程度的傷害。近幾年有關(guān)抑郁癥的研究都緊扣著海馬神經(jīng)元的損傷與修復(fù)這一重要環(huán)節(jié)。海馬是一個十分容易受損的邊緣結(jié)構(gòu),長時間的慢性應(yīng)激刺激會極易導(dǎo)致海馬神經(jīng)元細(xì)胞減少,引起情緒和認(rèn)知的改變,在多數(shù)抑郁癥發(fā)生的過程中扮演著突出作用[2]。研究發(fā)現(xiàn),海馬組織能否實現(xiàn)對神經(jīng)功能的調(diào)節(jié),取決于大腦海馬內(nèi)各個神經(jīng)因子能否啟動神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)[3]。

FKBP51與FKBP52是應(yīng)激蛋白Hsp90的分子伴侶蛋白,發(fā)揮著調(diào)節(jié)類固醇激素受體活性的作用,它們能夠調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)的敏感度,抑制了GR的核轉(zhuǎn)移[4-5],同時,FKBP51還可以催化GR成熟,調(diào)在應(yīng)激反應(yīng)的中起調(diào)節(jié)作用[6]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)是神經(jīng)生長存活的重要分子,研究證據(jù)表明BDNF參與情緒障礙,在慢性應(yīng)激活動中,GR/BDNF通路是引發(fā)相關(guān)抑郁癥發(fā)生的關(guān)鍵[6]。BDNF的缺失可致使神經(jīng)元數(shù)量減少,多巴胺受體在低水平的BDNF介導(dǎo)下,導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)育異常[7]。此信號通路被視為治療抑郁的下游靶標(biāo),通過將BDNF補(bǔ)充到大腦中可以在動物實驗中觀測到其能夠發(fā)揮類同與抗抑郁劑樣效應(yīng)[8]。并且,對于慢性應(yīng)激模型動物的行為學(xué)檢測可以證實海馬BDNF的蛋白表達(dá)出現(xiàn)下降趨勢,這也體現(xiàn)出在情緒障礙疾病中BDNF的重要意義[9]。

通過以上論述,我們有理由認(rèn)為應(yīng)激伴侶蛋白FKBP51和FKBP52可以調(diào)節(jié)GR的敏感性,進(jìn)一步影響著BDNF的表達(dá),腧穴“解郁方”是否可以通過此途徑治療抑郁癥,由此我們可以通過動物實驗深入觀察基于FKBPs-GR-BDNF信號通路,探求腧穴“解郁方”在治療抑郁癥時發(fā)揮的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(京)2019-0010]提供SPF級SD雄性大鼠40只,均重(200±20)g。本實驗方案經(jīng)過本單位倫理委員會批準(zhǔn)(批號:2020E2M07)。在山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心清潔級動物實驗室開展實驗飼養(yǎng)觀察,預(yù)養(yǎng)1周后進(jìn)行均衡隨機(jī)化分為4組,空白組、模型組、針刺組,藥物組,每組10只。空白組大鼠同籠飼養(yǎng),其余3組采用單籠孤養(yǎng)的方式進(jìn)行實驗。

1.2 主要儀器

切片機(jī)(湖北,亞光YGQ-Ⅲ);石蠟包埋機(jī)(湖北,亞光YB-6LF);數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海,邦西HH-4);凝膠成像分析儀(美國,Bio-rad U-niversalHood);光學(xué)顯微鏡(日本,尼康 Nikon H550L);自制曠場實驗箱(100 cm×100 cm);大鼠籠和大鼠固定板(由山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗室提供);一次性針灸針(0.3 mm×13 mm)由北京中研太和醫(yī)療器械有限公司提供。電泳儀(BIO-RAD,mini protean 3 cell);電轉(zhuǎn)儀(HOEFER,TE77XP);酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃,MK3);成像系統(tǒng)(Tanon,Tanon-5200)。

1.3 主要試劑

鹽酸帕羅西汀(由浙江尖峰藥業(yè)有限公司生產(chǎn),201102)。伊紅/蘇木素染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司);AR0030 PBS 緩沖液(博士德);二甲苯/多聚甲醛(天津市北辰方正式試劑廠);裂解液(碧云天);氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(Thermo,PICPI23223);發(fā)光液(Millipore,WBKLS0100);RIPA組織細(xì)胞快速裂解液(WKSUBIO,YC0020)。

1.4 造模方法

本實驗使用慢性不可預(yù)知性的溫和刺激法進(jìn)行模型制備,要保證動物無法預(yù)料刺激的發(fā)生,同時還需要避免連續(xù)使用相同的刺激。經(jīng)預(yù)實驗檢驗?zāi)軌蛟炷３晒?且避免因刺激過于強(qiáng)烈導(dǎo)致動物死亡的情況。實驗選取了7種不同的溫和刺激方式一起配合使用,包括有:4℃冷水游泳5分鐘、24小時禁水、24小時禁食、晝夜顛倒、吹熱風(fēng)5分鐘、3小時束縛,夾尾5分鐘,對模型組三針刺組和藥物組大鼠每天隨機(jī)選擇1種應(yīng)激刺激方式,并保證1周內(nèi)平均每一種應(yīng)激方式均被選擇1次,按照隨機(jī)原則將每種應(yīng)激方式安排在28天當(dāng)中。參考文獻(xiàn)進(jìn)行制備[10]。

1.5 干預(yù)方法

空白組:不施加任何應(yīng)激刺激因素,每籠五只,正常喂養(yǎng)。模型組:孤養(yǎng),每籠一只,給予28天的不可預(yù)見應(yīng)激刺激。針刺組:孤養(yǎng),每籠一只,施加28天的應(yīng)激刺激,選取燕平教授團(tuán)隊前期通過實驗論證治療抑郁癥的經(jīng)驗腧穴組方:“百會”“神門(雙)”“太沖(雙)”[11]。參照《實驗動物針灸穴位圖譜》取穴。“百會”位于大鼠頭頂骨正中;“神門”位于大鼠前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨橈側(cè)緣凹陷中;“太沖”定位在大鼠足背第一、二跖骨間凹陷處。從造模第1天開始行針刺治療,針刺角度均為平刺,深度為0.2～0.5 cm,留針20分鐘,1次/天。藥物組:孤養(yǎng),每籠一只,進(jìn)行28天的應(yīng)激刺激,從實驗開始當(dāng)天給予藥物鹽酸帕羅西汀,給藥劑量為3.3 mg/kg,臨用時溶于蒸餾水配成混懸液,以1 mL/100 g灌胃給藥。

1.6 觀察指標(biāo)和檢測方法

1.6.1 大鼠體質(zhì)量的測定和一般情況觀察 在每天上午8點安靜狀態(tài)下觀察記錄大鼠的基本活動情況,對各組大鼠的排便和精神活動狀態(tài)進(jìn)行觀察記錄;并在造模實驗開展前1天和第28天對各組大鼠進(jìn)行稱重。

1.6.2 行為學(xué)檢測 曠場實驗:自制敞箱,將箱底等分5×5共25格,觀察者避免大聲驚嚇動物,單只單箱開展實驗。分別于造模開始的前1天及實驗第28天記錄各組每只大鼠的水平跨越移動格數(shù)與上肢直立的次數(shù)。

糖水消耗實驗:在造模開展的前3天適應(yīng)性給予1%蔗糖水,第一天每籠2瓶,第二天1瓶,第3天禁水1晚;造模的前1天,每籠分別給1瓶1%蔗糖水和純水;24小時后,取出水瓶,稱重計量。實驗第28天后,重復(fù)此糖水消耗實驗,對每只大鼠的糖水消耗量稱重記錄。

1.6.3 免疫蛋白印跡法檢測GR、BDNF、FKBP51和FKBP52表達(dá)情況 大鼠取血完成后,迅速暴露其腦組織,在冰塊上小心地將大鼠海馬組織完整取出,用生理鹽水沖洗后,將海馬腦段分成左右兩段,將其中一段置入標(biāo)記好的EP管中,置于液氮中速凍備用;另一段海馬組織用4%多聚甲醛固定液固定6小時以上(4℃),標(biāo)記。

在冰上將組織剪成小碎片,將0.5 mL裂解液與40 mg組織放入勻漿器中使組織完全裂解。裂解后的樣品4℃ 12000 r/min離心15分鐘,取上清,進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。先準(zhǔn)備酶標(biāo)板各孔標(biāo)好,將配制比例為50∶1的BCA工作液,加入到酶標(biāo)板中震蕩混勻,測定吸光值,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品溶液稀釋,所得溶液共20 mL,與200 mL的BCA工作液混勻,37℃下靜置0.5小時后,以0號管做為參照,測定吸光值。再將樣品的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)的蛋白含量(mg),進(jìn)而得到樣品實際蛋白濃度(實際蛋白濃度=蛋白含量×稀釋倍數(shù)/20)。然后依據(jù)蛋白分子量的大小確定凝膠濃度,配置聚丙烯酰胺下層分離膠與濃縮膠,完成蛋白電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)模。將NC膜放平皿中,加入封閉液,搖床振蕩2小時,用TBST洗膜5分鐘,重復(fù)三次,稀釋一抗,放至平皿中,放NC膜置搖床上,在4℃下過夜,第2日取出NC膜,使用TBST洗滌3次,每次10分鐘,加二抗稀釋液稀釋二抗,把NC膜放置二抗中,室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)2小時,將NC膜夾出,TBST洗滌3次,每次5分鐘。配ECL顯色液,取ECL顯色液A和B等量混勻加在膜的正面暗室避光5分鐘,使用G:BOX chemiXR5掃描成像;使用Gel-Pro32軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.6.4 HE染色觀察大鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞的變化 從抗凍緩沖液中選取大鼠腦組織切片,先二甲苯脫蠟,再用酒精梯度濃度浸泡,最后蒸餾水沖洗。然后入蘇木精水溶液中進(jìn)行染色,根據(jù)染色程度調(diào)整時間,約為5分鐘。再在乙酸水和氨水中分化顏色,流水沖洗。然后用伊紅染色,時間2分鐘。分別以70%、80%、90%、純酒精進(jìn)行梯度脫水,用二甲苯透明切片,晾干加膠后壓蓋玻片封固。在光鏡下觀察海馬組織,并用BX53熒光顯微成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況

在進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周以后,各組大鼠的精神體貌和活躍度均表現(xiàn)良好,施加應(yīng)激前各組大鼠體質(zhì)量對比無明顯差異。在持續(xù)的慢性應(yīng)激過程中:空白組大鼠因未施加任何干預(yù),其毛色、活動度均表現(xiàn)良好,大便無異常;模型組與之進(jìn)行比較,精神狀態(tài)、活躍度差,出現(xiàn)焦躁、啃咬鼠籠等情況,大便稀溏時有出現(xiàn),且毛色欠光;針刺組精神狀態(tài)相對良好,大鼠反應(yīng)基本靈敏,毛色尚有光澤,大小便正常;藥物組精神狀態(tài)一般,毛色缺乏光澤,出現(xiàn)大便時干時稀的情況。

大鼠實驗前后體質(zhì)量的變化:實驗后,模型組與空白組大鼠體質(zhì)量增長明顯降低,存在顯著差異(P<0.05);針刺組與藥物組同模型組相比較,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 實驗前后各組大鼠體質(zhì)量的變化

2.2 各組大鼠行為學(xué)檢測結(jié)果比較

2.2.1 各組大鼠曠場實驗結(jié)果的比較 實驗開始前,各組大鼠曠場實驗水平運動和直立次數(shù)沒有表現(xiàn)出明顯的差別(P>0.05);經(jīng)過28天的應(yīng)激干預(yù)后,空白組大鼠較之前的行為學(xué)表現(xiàn)上沒有發(fā)生明顯改變,而模型組大鼠水平與直立運動較第1天所測頻次明顯減少(P<0.05),說明造模成功。施加28天應(yīng)激刺激并進(jìn)行治療干預(yù)的針刺組與模型組相比較,水平與直立次數(shù)存在差異(P<0.05),同時也可以觀察到藥物組與模型組的行為學(xué)檢測對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠曠場實驗水平運動和站立次數(shù)應(yīng)激前后比較次)

2.2.2 各組大鼠糖水?dāng)z入量的結(jié)果比較 由表3可見,實驗開始前,各組大鼠糖水?dāng)z入量對比無明顯差異(P>0.05),施加應(yīng)激刺激28天后,各組大鼠的糖水?dāng)z入量發(fā)生明顯改變,模型組大鼠糖水?dāng)z入明顯降低,并且顯著低于空白組(P<0.05),針刺組與藥物組糖水?dāng)z入量明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但是針刺組與藥物組之間的糖水?dāng)z入差異不明顯(P>0.05)。

表3 各組大鼠糖水?dāng)z入量實驗前后比較

2.3 各組大鼠海馬的GR、BDNF、FKBP51和FKBP52的蛋白表達(dá)結(jié)果

如表4、圖1所示,模型組比空白組大鼠的FKBP51蛋白表達(dá)有所增加,而GR、BDNF、FKBP52的蛋白表達(dá)降低;針刺組與模型組相比,GR、BDNF、FKBP52平均光密度值顯著提升,FKBP51的蛋白表達(dá)有所降低(P<0.05);藥物組與模型組比較其上調(diào)GR、BDNF、FKBP52與降低FKBP51的蛋白表達(dá)能夠取得類同與針刺組的治療效益,但針刺組與藥物組治療所產(chǎn)生的效應(yīng)趨勢無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

圖1 各組大鼠海馬GR、BDNF、FKBP51和FKBP52的蛋白表達(dá)情況

表4 各組大鼠海馬GR、BDNF、FKBP51、FKBP52水平的比較

2.4 各組大鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)目的影響

在400倍鏡視野下可觀察到空白組大鼠海馬CA3區(qū)大量的錐體細(xì)胞排列有序,細(xì)胞核藍(lán)染均勻,核仁明顯,胞質(zhì)均勻,細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常改變;與之相對比,模型組的錐體細(xì)胞數(shù)目明顯減少,細(xì)胞畸形、間隙增大,且細(xì)胞排列不規(guī)則。許多的細(xì)胞胞漿空泡狀明顯,細(xì)胞核呈脊?fàn)?、三角形或不?guī)則突起,出現(xiàn)了明顯的形態(tài)結(jié)構(gòu)病理改變。與模型組比較,藥物組大部分椎體細(xì)胞相對完整、細(xì)胞與周圍組織聯(lián)系較為緊密、雖然有部分胞核出現(xiàn)固縮呈不規(guī)則形,但形態(tài)優(yōu)于模型組,有部分胞核出現(xiàn)固縮呈不規(guī)則形,細(xì)胞核藍(lán)染欠均勻、細(xì)胞質(zhì)較為均勻致密;針刺組錐體細(xì)胞整體形態(tài)要優(yōu)于模型組和藥物組,偶有胞漿空泡狀染色質(zhì)邊集、個別細(xì)胞胞核固縮呈三角形,見圖2。

注:A為空白組;B為模型組;C為藥物組;D為針刺組。圖2 鏡下觀察各組大鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異(HE,×400)

3 討論

本實驗選用腧穴“解郁方”由百會、神門、太沖三穴組成,是山西中醫(yī)藥大學(xué)燕平教授團(tuán)隊篩選出的對抑郁癥有明確療效的組穴,并且進(jìn)行了大量的實驗論證[12-14]。百會,位巔上,屬督脈,稱“三陽五會”,手足三陽經(jīng)之陽氣匯聚之處。宋代《銅人腧穴針灸圖經(jīng)》中記載:“驚悸健忘針百會二分,得氣即瀉,可灸……又治思慮過多,心下怔仲,或自悲感慨?！薄夺樉拇蟪伞分杏小鞍贂臒?驚悸健忘,忘前失后,心神恍惚”。百會從屬督脈,督脈為陽脈之海,與大腦關(guān)系密切。針刺百會穴可振奮陽氣、醒腦開竅、安神定志;神門穴為手少陰心經(jīng)的輸穴、原穴,為心氣出入之門戶,有益氣寧心、通絡(luò)安神之功,《靈樞·五邪》篇論:“邪在心,則病心痛喜悲,時眩仆,視有余不足而調(diào)之其輸也?！毙闹餮},又主神明。刺本穴可開心氣之郁結(jié),可以減少抑郁焦慮癥狀,治療各種情志疾病;太沖穴屬陰主血為足厥陰肝經(jīng)的輸穴、原穴,厥陰經(jīng)多血少氣;五臟有疾當(dāng)取之十二原,針灸該穴可以調(diào)整肝臟氣機(jī)從而起到保護(hù)肝臟,平穩(wěn)情志,發(fā)揮“肝主疏泄,調(diào)情志”的作用,使情志和調(diào),氣血和暢;三穴相配能振奮心陽,益氣和血,疏肝解郁從而治療抑郁癥。

本實驗通過免疫蛋白印跡法測定各組海馬GR、BDNF、FKBPs蛋白的表達(dá)水平情況,動物應(yīng)激模型中,大鼠海馬GR、BDNF水平均出現(xiàn)了降低,且比較空白組有明顯差異。說明在慢性應(yīng)激刺激下,導(dǎo)致GR受體表達(dá)下降,不能完全介入HPA軸進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié),與此同時GR的表達(dá)可能會影響腦神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的表達(dá),我們觀察針刺組與藥物組可以幫助應(yīng)激大鼠海馬GR和BDNF的表達(dá)增高,這與觀察到的行為學(xué)抑郁狀態(tài)的改善是一致的。BDNF作為非常重要的腦神經(jīng)營養(yǎng)因子,它對大腦神經(jīng)元的保護(hù)是十分明確的,BDNF能夠通過多種分泌方式與其受體結(jié)合,是5-HT能神經(jīng)元的生長因子[15-16]。當(dāng)機(jī)體BDNF的水平迅速下降,會導(dǎo)致神經(jīng)元樹突狀結(jié)構(gòu)異常促使中樞神經(jīng)神經(jīng)元減少,進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、神經(jīng)的可塑性發(fā)生改變[17-18]。本次實驗結(jié)果顯示,慢性應(yīng)激會升高FKBP51的蛋白表達(dá),降低GR、BDNF、FKBP52的蛋白表達(dá),促使海馬神經(jīng)元的可塑性下降,導(dǎo)致海馬神經(jīng)的功能受損。針刺“解郁方”可以提高FKBP52、GR和BDNF的表達(dá),提高神經(jīng)元的可塑性,從而發(fā)揮抗抑郁效益。

海馬區(qū)是主要調(diào)控一些情緒反應(yīng)與學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū),其中海馬CA3區(qū)含有豐富的椎體神經(jīng)細(xì)胞,對神經(jīng)反射調(diào)節(jié)極其敏感,同時該區(qū)的神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)也最易發(fā)生可塑性改變[19-20]。既往的研究發(fā)現(xiàn)CUMS干預(yù)會引起大鼠腦內(nèi)海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷,導(dǎo)致海馬神經(jīng)元萎縮和凋亡,是抑郁癥的重要原因[21]。通過本實驗微觀形態(tài)上觀察可以清楚地看出,慢性應(yīng)激會使大鼠海馬CA3區(qū)大量的錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損傷,細(xì)胞數(shù)量減少,出現(xiàn)許多錐體細(xì)胞腫脹,胞漿呈空泡狀,細(xì)胞核呈脊?fàn)睢⑷切位虿灰?guī)則突起。

本研究觀察到針刺“解郁方”和給予藥物帕羅西汀對應(yīng)激大鼠海馬CA3椎體細(xì)胞形態(tài)有著不同程度的改善。在肯定針刺治療療效的同時,我們也應(yīng)更多的關(guān)注海馬神經(jīng)元及其功能的修復(fù)在治療中的重要性,可以基于此方面,進(jìn)一步挖掘當(dāng)前有關(guān)精神障礙類疾患的發(fā)病與治療機(jī)制。