魏林珍 馬曉梅 張 郎 陳 凡 秦天生

1 甘肅省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,甘肅省蘭州市 730000; 2 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院; 3 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

宮頸癌是女性癌癥死亡第二大原因,宮頸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍舊是診治的難題[1],開發(fā)敏感的診斷方法并找到新的治療策略是研究的熱點(diǎn)。miRNA是小單鏈非編碼RNA,它的過表達(dá)或下調(diào)可引起抑制基因或癌基因的激活,從而參與分化、增殖和存活等生物學(xué)過程。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)研究宮頸癌組織中miR-381-3p的表達(dá)水平,并探索其可能的靶基因及分子調(diào)控機(jī)制,為宮頸癌的防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 miR-381-3p基本資料 通過PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)查詢miR-381-3p相關(guān)的文獻(xiàn),并用miRBase和UCSC等查找miR-381-3p 的物種保守性、染色體定位等基本資料。見表1。

表1 在線數(shù)據(jù)庫(kù)名稱及網(wǎng)址

1.2 miR-381-3p在宮頸癌中的表達(dá) 通過TCGA網(wǎng)站獲取人腫瘤組織與腫瘤旁正常組織的miR-381-3p表達(dá)水平。利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)比較 miR-381-3p在宮頸癌中的差異表達(dá)水平。

1.3 miR-381-3p靶基因預(yù)測(cè) 使用miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。為了提高準(zhǔn)確性,設(shè)定預(yù)測(cè)結(jié)點(diǎn)為3’UTR,預(yù)測(cè)評(píng)分0.95,且同時(shí)能在TargetScan和miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)被預(yù)測(cè)。

1.4 miR-381-3p靶基因的生物信息學(xué)分析 利用DAVID對(duì)miR-381-3p的靶基因?qū)嵭蠫O功能注釋,設(shè)定條件是基因數(shù)目>10且得滿足P<0.05。對(duì)靶基因探究KEGG通路,設(shè)定條件是P<0.05。

1.5 蛋白與蛋白相互作用(PPI) 利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò),利用 Cytohubba插件依EPC篩選前10位關(guān)鍵基因。

1.6 分析關(guān)鍵基因 利用GEPIA分析關(guān)鍵基因在子宮頸癌組織中和正常組織的表達(dá),以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 miR-381-3p基本信息 通過檢索得到 hsa-miR-210-3p定位在14q32.31染色體區(qū)域中,且在人、大鼠、獼猴、小鼠等多種物種之間維系高度保守性。見表2。

表2 miR-381-3p在不同物種中的基本信息

2.2 miR-381-3p在人各腫瘤組織和其在相應(yīng)正常組織的表達(dá)差異 通過數(shù)據(jù)庫(kù)分析:miR-381-3p在多種腫瘤及其鄰近正常組織中都存在著差異表達(dá)。在腎上腺皮質(zhì)癌、結(jié)腸癌、睪丸癌、子宮肉瘤等腫瘤中miR-381-3p呈顯著高表達(dá),可能在這些腫瘤里充當(dāng)癌基因角色。而在宮頸癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤等腫瘤中的表達(dá)顯著降低,miR-381-3p在這些腫瘤中可能發(fā)揮抑癌基因角色。見圖1。

圖1 miR-381-3p在不同的腫瘤組織中和腫瘤旁正常組織之間的表達(dá)

依據(jù)UALCAN平臺(tái)數(shù)據(jù)分析,miR-381-3p在宮頸癌患者組織中呈現(xiàn)顯著的低表達(dá)(見圖2a)。依據(jù)宮頸癌分期的資料與數(shù)據(jù),與宮頸正常組織比較,S2、S3與S4的miR-381-3p表達(dá)水平均顯著性降低,且從其表達(dá)量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),與宮頸癌分期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,但只有S1與S3之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖2b)。依據(jù)宮頸癌分級(jí)的相應(yīng)資料展現(xiàn),與宮頸正常組織比較,G2和G3級(jí)的宮頸癌組織的hsa-miR-381-3p表達(dá)量均顯著降低,但宮頸癌分級(jí)之間并未見數(shù)據(jù)上的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖2c)。 依據(jù)宮頸癌分期的相應(yīng)資料顯示,正常宮頸組與宮頸癌淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,宮頸癌組中有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間也未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖2d)。

a b c d

2.3 篩選miR-381-3p下游靶基因預(yù)測(cè) 通用miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-381-3p行靶基因預(yù)測(cè),剔除重復(fù),預(yù)測(cè)得到1 606個(gè)基因。進(jìn)一步篩查,能被 miRTarBase和miRDB同時(shí)預(yù)測(cè)到,最終得到84個(gè)靶基因。

2.4 miR-381-3p靶基因GO與KEGG信號(hào)通路富集分析 對(duì)篩選出的84個(gè)靶基因?qū)嵭蠫O注釋顯示:miR-381-3p的靶基因富集在對(duì)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄進(jìn)行正向調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物學(xué)過程,富集在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、胞漿、核質(zhì)體、細(xì)胞膜、核體等細(xì)胞組分,富集在蛋白質(zhì)結(jié)合和RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄因子活性序列特異性DNA結(jié)合等分子功能,結(jié)果見圖3。KEGG表明,靶基因富集于癌癥通路、乳腺癌、胃癌、Hippo、MAPK、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)等信號(hào)通路,見圖4。

圖3 miR-381-3p預(yù)測(cè)靶基因生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能

圖4 miR-381-3p靶基因 KEGG信號(hào)通路富集分析

2.5 靶基因 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因 基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)建靶基因蛋白與蛋白的網(wǎng)絡(luò)圖(見圖5),并根據(jù)EPC在CytoHubba插件篩選出網(wǎng)絡(luò)圖中前 10的關(guān)鍵基因,分別是 ESR1、LEF1、PBX1、CCND2、FGFR2、CADM1、TCF3、MPP6、PVRL1、UBE3A(見圖6)。

圖5 miR-381-3p靶基因蛋白與蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 網(wǎng)絡(luò)圖中前 10的關(guān)鍵基因

2.6 驗(yàn)證核心基因 利用 GEPIA在線分析網(wǎng)站,比較核心基因在宮頸癌和正常對(duì)照中的表達(dá),結(jié)果顯示:與正常組織相比,宮頸癌組織中ESR1、PBX1、CCND2在表達(dá)水平較低(P<0.05)。見圖7。

圖7 宮頸癌組織(T)與正常宮頸組織(N)中ESR1、PBX1、 CCND2的表達(dá)

3 討論

宮頸癌不僅影響女性的生殖健康,而且對(duì)心理健康也造成一定的影響。因此,研究宮頸癌早期的診治標(biāo)記物顯得尤為重要?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),miRNA與宮頸癌有著一定的關(guān)系,可作為宮頸癌早期診治的標(biāo)記物,也可以作為生物治療的靶點(diǎn)[2]。

前期研究發(fā)現(xiàn),miR-381-3p與多種腫瘤關(guān)系密切,且在不同腫瘤中表現(xiàn)為抑癌基因或癌基因[3]。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)miR-381-3p在宮頸癌組織中表達(dá)降低,這與Shang等[4]的研究相符。同時(shí),根據(jù)UALCAN在線分析,miR-381-3p在宮頸癌患者的組織中出現(xiàn)顯著低表達(dá),且與腫瘤分期、分級(jí)間有一定的關(guān)系,與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果表明miR-381-3p在宮頸癌疾病中可作為抑癌基因,可能與宮頸癌發(fā)生有一定聯(lián)系。

為進(jìn)一步探討miR-381-3p表達(dá)異常與宮頸癌的相互關(guān)系,需要預(yù)測(cè)靶基因及靶基因的功能。本研究利用miRWalk獲取 miR-381-3p的靶基因,為了增加準(zhǔn)確性,且靶基因能在miRDB和miRTarBase中被預(yù)測(cè)到,共獲得84個(gè)miR-381-3p的靶基因。GO注釋表明,靶基因主要富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的負(fù)向調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程,富集在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組分,富集在蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能。

KEGG結(jié)果表明,癌癥通路、乳腺癌、胃癌、Hippo、MAPK、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞的骨架調(diào)節(jié)等關(guān)鍵信號(hào)通路被富集。已有研究表明[5]MAPK途徑是從細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要橋梁。由于遺傳和表觀遺傳學(xué)的變化,在包括癌癥內(nèi)的各種疾病中發(fā)現(xiàn)了信號(hào)級(jí)聯(lián)的改變。MAPK對(duì)癌癥治療的反應(yīng)具有影響,特別是對(duì)實(shí)驗(yàn)性MAPK抑制的反應(yīng)中的補(bǔ)償途徑的激活。Hippo信號(hào)通路受到廣泛的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號(hào)的調(diào)控,在許多癌癥類型中都觀察到了Hippo信號(hào)的失調(diào), Hippo途徑的核心成分可能通過誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞和增殖而啟動(dòng)腫瘤發(fā)生,最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)移和耐藥性,廣泛發(fā)生于宮頸癌[6]。

進(jìn)一步證實(shí)miR-381-3p異常表達(dá)與宮頸癌關(guān)系,對(duì)miR-381-3p的核心基因進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示ESR1、PBX1、CCND2水平在CESC組織中低于正常組織。ESR1是編碼雌激素受體α的基因,是乳腺癌中最常見的核轉(zhuǎn)錄因子。激活ESR1配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變產(chǎn)生組成/配體非依賴性轉(zhuǎn)錄活性,并在延長(zhǎng)一線激素治療方案后出現(xiàn),這些突變對(duì)ER轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移傾向和腫瘤微環(huán)境的多模式影響[7]。Hu等[8]研究發(fā)現(xiàn)ESR1通過與HS1BP3啟動(dòng)子融合抑制肝癌的增殖并改善其預(yù)后。CCND2是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在惡性腫瘤中起重要作用。最近研究表明,CCND2的功能異常會(huì)加速腫瘤進(jìn)展。例如,CCND2調(diào)節(jié)并促進(jìn)結(jié)直腸癌干細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展,抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)[9-10]。PBX1與重要的發(fā)育程序有關(guān),其表達(dá)失調(diào)與癌癥在內(nèi)的多因素疾病有關(guān)。相關(guān)研究表明 PBX1 可能參與避免免疫破壞和促進(jìn)腫瘤的炎性標(biāo)志物[11]。此外,本研究通過數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-381-3p與ESR1、PBX1、CCND2存在靶向調(diào)控關(guān)系,結(jié)合靶基因的表達(dá)水平,推測(cè)miR-381-3p參與宮頸癌的疾病進(jìn)程可能與ESR1、PBX1、CCND2靶基因相關(guān)。后期,筆者結(jié)合臨床宮頸癌組織標(biāo)本進(jìn)一步驗(yàn)證miR-381-3p與靶基因關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-381-3p可作為宮頸癌的抑癌基因,并可能靶向ESR1、PBX1和CCND2影響宮頸癌的進(jìn)展。由于ESR1、PBX1和CCND2表達(dá)與宮頸癌相關(guān),提示它們可能為宮頸癌診斷和治療的靶點(diǎn),但是仍需進(jìn)一步證實(shí)miR-381-3p與宮頸癌,miR-381-3p與ESR1、PBX1和CCND2復(fù)雜作用機(jī)制。