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        通過血液靶向NGS檢測布氏桿菌感染1例分析

        2023-10-03 22:55:04張文瑩張小河
        醫(yī)學(xué)理論與實踐 2023年17期
        關(guān)鍵詞:檢測

        李 祥 張文瑩 張小河

        廣東省揭西縣人民醫(yī)院 515400

        布氏桿菌病是人獸共患病,其主要從感染的動物宿主傳染給人。布氏桿菌是小型革蘭陰性需氧菌,屬于兼性胞內(nèi)寄生菌。馬耳他布魯菌可通過氣霧播散,在流行區(qū),動物通過吸入病原菌感染是主要的感染途徑[1]。為病畜接生、剝牛羊皮、剪毛、切肉改刀等均可受染,經(jīng)口攝入感染的生乳、乳制品或病畜肉類未煮熟都會造成感染跡象[2]。布氏桿菌病通常潛伏期1~3周,也可更長。臨床表現(xiàn)多樣,可出現(xiàn)高熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)痛等癥,部分可伴有肝脾、淋巴結(jié)腫大等,常缺乏特異性癥狀。由于布氏桿菌是胞內(nèi)菌,因而相對抗生素而言不易接觸到病原菌,很難根治且易復(fù)發(fā),故治療上強調(diào)抗生素聯(lián)合應(yīng)用、長療程治療[3]。 由于布氏桿菌感染的不確定性,許多患者施行了不必要的診斷性治療,消耗了醫(yī)療資源,也給患者帶來了痛苦,甚至終身的手術(shù)并發(fā)癥[4]。因此,如何提高患者的診斷準確率至關(guān)重要,近年來人們在基因測序檢測方面取得了突破,提高了布氏桿菌感染的診斷率。本文現(xiàn)通過血液靶向二代基因測序(Next generation sequencing technology,NGS)檢測1例布氏桿菌感染,總結(jié)病例特點及檢測優(yōu)勢,幫助臨床醫(yī)生在遇到類似病例時有效選擇相應(yīng)的檢測方法,避免時間和資源浪費,報道如下。

        1 病例資料

        患者女,31歲,因“反復(fù)發(fā)熱3d”于2022年8月25日收入我院內(nèi)一科?;颊咴V3d前無明顯誘因出現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱,最高溫度為39.5°C,無畏寒,無頭暈、頭痛,無咳嗽、咳痰,無胸悶、氣促、心悸,無午后潮熱、盜汗,無關(guān)節(jié)疼痛、皮疹,無腹痛、腹瀉、腹脹,無尿急、尿痛、尿頻,無四肢乏力、腫脹等,自行口服退熱藥治療(具體藥物不詳),癥狀反復(fù),自起病以來,睡眠、食欲、精神一般,大小便正常,體力、體重?zé)o明顯變化。既往史、月經(jīng)史、婚育史及家族史無特殊。個人史:在本地經(jīng)營一家羊肉店,平素以販賣羊肉為主業(yè),余無特殊。入院體檢:T:38.4℃,P:104次/min,R:20次/min,BP:110/73mmHg(1mmHg=0.133kPa)。神志清,查體合作,對答切題,全身皮膚黏膜無黃染,未見蜘蛛痣及肝掌。全身淺表淋巴結(jié)未捫及腫大。心肺查體未見異常,肝脾未觸及腫大,余查體未見異常。入院后查:血常規(guī)五分類套餐+全程C反應(yīng)蛋白:白細胞 5.90×109/L、血小板 156×109/L、中性粒細胞絕對值 2.01×109/L、嗜酸性粒細胞絕對值 0.00×109/L、中性粒細胞百分比 34.00%、淋巴細胞百分比 59.50%、C-反應(yīng)蛋白 <6.00mg/L、超敏C-反應(yīng)蛋白 3.51mg/L。N末端-B型鈉尿肽前體 1 383.80 pg/ml,降鈣素原 0.12ng/ml。 貧血三項:維生素B12629.90pmol/L,甲功五項:促甲狀腺激素 7.930μIU/ml。尿常規(guī)、大便常規(guī)、PCT、血沉、抗核抗體17項、狼瘡二項及狼瘡抗凝物質(zhì)等未見異常。2022年8月25日 螺旋CT胸部:雙肺上葉多發(fā)結(jié)節(jié)灶,考慮炎性肉芽腫,建議隨診復(fù)查。入院后8月25日開始予“頭孢唑肟 2g q12h 靜滴+多西環(huán)素 0.1g bid 口服”抗感染治療及相關(guān)支持治療,8月25日、8月26日、8月27日三日均有持續(xù)中—低熱,其中8月27日 18:30 Tmax39.2℃。2022年8月27日靶向病原精簡版90種病原體(DNA+RNA+耐藥基因):(1)細菌:未檢出;(2)真菌:煙曲霉(820);(3)DNA病毒:未檢出;(4)RNA病毒:未檢出;(5)菌屬:布魯菌屬(214);(6)其他病原體:未檢出;(7)耐藥或毒力基因:未檢出。結(jié)合患者病史、病情及血NSG結(jié)果考慮患者為布氏桿菌感染,于8月27日夜間加用“注射液硫酸鏈霉素1g:肌注 qd”,8月28日開始,患者未再次出現(xiàn)發(fā)熱。8月28日暫停頭孢唑肟,后續(xù)以多西環(huán)素+鏈霉素聯(lián)合治療。8月29日B超檢查:子宮+肝膽胰脾+雙腎膀胱+心胞:肝右葉內(nèi)強回聲斑,考慮:肝內(nèi)膽管結(jié)石?鈣化灶?請結(jié)合臨床。脾大;脾門處異常實質(zhì)性聲像,考慮副脾。心包積液(少量)。膽胰、泌尿系、子宮、雙側(cè)附件區(qū)未見明顯異常聲像。8月31日布魯菌抗體三項結(jié)果回報:布魯菌IgG抗體(+),布魯菌病試管凝集試驗1∶400,布魯菌病虎紅平板凝集試驗(+)。繼續(xù)維持前治療,9月12日暫停鏈霉素(共使用15d),至9月13日患者出院未再出現(xiàn)發(fā)熱。入院經(jīng)過積極診治,病情已得到控制,體溫恢復(fù)正常,出院后患者繼續(xù)口服“多西環(huán)素 0.1g bid”,定期至我院隨診,無訴發(fā)熱。

        2 方法

        NGS 檢測:(1)儀器試劑:北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品生產(chǎn)的血液基因組 DNA 提取試劑盒;邁基諾基因科技公司完成NGS。(2)檢測:采集患者外周血標(biāo)本5ml,EDTA 抗凝,應(yīng)用DNA 提取試劑盒提取患者體內(nèi)3~5μg DNA 。設(shè)計布魯菌病相關(guān)基因列表,該基因組合(panel)未申請專利或參加臨床試驗。BDHAP-2014包含217個布魯菌病致病基因的全部外顯子及剪接位點目標(biāo)序列捕獲探針。收集提取到的 DNA,用超聲波打斷并制備DNA文庫,通過捕獲芯片富集217個布魯菌病致病基因的外顯子及其臨近的內(nèi)含子區(qū)域的DNA,行 PCR 擴增,最后應(yīng)用 IlluminaHiseq 測序平臺對擴增產(chǎn)物進行 NGS,以檢測上述目標(biāo)基因是否存在潛在突變。靶向區(qū)域平均基因覆蓋度98.46%,平均測序深度為436.75×,90.14%的靶向區(qū)域覆蓋度>30×,60.29%的靶向區(qū)域覆蓋度>200×。將測序結(jié)果與dbSNP 數(shù)據(jù)庫、HGMD 數(shù)據(jù)庫及千人基因組數(shù)據(jù)庫進行比對。

        3 討論

        布魯菌病(Brucellosis)又稱波浪熱,由布氏桿菌感染引起,以長期發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、肝脾大和慢性化為特征的傳染病,屬國家法乙類傳染病。布氏桿菌屬球狀G-菌,可分為羊、牛、豬、犬、綿羊附睪及沙林鼠種菌。其中羊種菌致病力最強,豬種菌次之,布氏桿菌傳染源為病畜,通過皮膚黏膜接觸、消化道及呼吸道等多種途徑進行傳播[5]。我國主要以內(nèi)蒙古、黑龍江、新疆、西藏等以畜牧業(yè)發(fā)達的地區(qū)發(fā)病多見,年新發(fā)患者為25 000~30 000人[6]。布魯菌病急性期與慢性期癥狀各異,前者可表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)疼痛、神經(jīng)痛和肝脾/淋巴結(jié)腫大等;后者多表現(xiàn)為神經(jīng)、精神癥狀,并伴有骨、關(guān)節(jié)系統(tǒng)損害。

        由于目前布氏桿菌感染的情況相對少見,關(guān)于此菌感染的診斷有時比較困難,尤其是病原菌的培養(yǎng)陽性率低,可能對治療造成一定的干擾和延誤。目前協(xié)助診斷的主要為結(jié)合臨床表現(xiàn)、初篩試驗,其中臨床表現(xiàn)和初篩試驗主要用于發(fā)現(xiàn)疑似病例,而實驗室檢查多依賴于布氏桿菌血清凝集試驗滴度升高、血液和組織培養(yǎng)陽性、血清中布氏桿菌抗體陽性,其中血清學(xué)試驗是基礎(chǔ)性檢驗,而細菌培養(yǎng)是布氏桿菌感染的金標(biāo)準,但細菌培養(yǎng)存在一定假陰性,且耗時較長,不利于疾病治療[7]。本院近日接收1例無故反復(fù)發(fā)熱患者,入院后完善了一系列感染、腫瘤及風(fēng)濕免疫相關(guān)檢查,尿常規(guī)、大便常規(guī)、PCT、血沉、抗核抗體17項、狼瘡二項及狼瘡抗凝物質(zhì)等未見異常,自身免疫及腫瘤相關(guān)化驗均無明顯陽性提示,僅胸部CT提示雙肺上葉炎性肉芽腫,那么,患者持續(xù)3d的高熱,真是由于輕微的肺炎所致?所幸患者入院應(yīng)用抗生素治療前,先一步留取了外周靜脈血送檢行靶向病原精簡版90種病原體(DNA+RNA+耐藥基因),后經(jīng)我院微生物室回報,NGS檢測出菌屬:布魯菌屬(214) 。至此,元兇終于揭開神秘面紗——布氏桿菌病。筆者采用血液靶向NGS輔助早期診斷布氏桿菌感染,提高了布氏桿菌的檢出率,達到早診斷、早治療、早痊愈的臨床目的。靶向病原微生物檢測,覆蓋臨床常見的90種病原體和90個耐藥基因,其具有精確、靈敏度高、簡單易行、經(jīng)濟實惠等優(yōu)勢,可自行設(shè)定興趣基因譜的廣度以及覆蓋深度,用于臨床診斷不明感染查因具備很大優(yōu)勢,可為臨床使用抗菌藥物做參考[8]。而本例患者在本地經(jīng)營一家羊肉店,平素以販賣羊肉為主業(yè),并親自對生羊肉進行清洗加工,由此感染,這也提示臨床對于不明原因的高熱感染需詳細了解患者的個人史,有無牛羊牲畜接觸史等,結(jié)合臨床表現(xiàn)判定。

        總之,靶向NGS具有檢測速度快、起始樣本量低、檢測病原微生物種類多、不受血制品輸注的影響,不受病毒感染、再障危象等并發(fā)癥的影響等特點。因布氏桿菌感染相對少見,臨床缺乏特異性表現(xiàn),易發(fā)生誤診漏診,靶向NGS技術(shù)為布氏桿菌感染的診斷提供了一種新的思路,可以取患者血液進行檢測,提高診出效率,盡快使用敏感抗生素,減輕患者的痛苦,起到早診斷、早治療、早治愈以及早康復(fù)的作用。將來隨著靶向NGS的panel不斷優(yōu)化以及更多致病基因的詳細研究,靶向NGS在疑診罕見菌群感染的診斷中會越來越廣泛應(yīng)用。

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