李珍珍 張 瑞 劉 霜 伍 磊 朱廳廳 李 兵

貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,貴州省貴陽市 550025

microRNA (miRNA) 是一類高度保守的非編碼小分子RNA,越來越多的證據(jù)表明,miRNA參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[1]。miRNA可以通過轉(zhuǎn)錄后降解或翻譯抑制來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),主要通過RNA誘導(dǎo)直接降解靶miRNA分子來調(diào)控靶基因miRNA的轉(zhuǎn)錄,或通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶基因miRNA的3’末端非翻譯區(qū)(3’-untranslatedregion,3’-UTR) 結(jié)合來抑制其翻譯表達(dá)等方式起調(diào)控作用[2]。hsa-miR-146a-5p位于第5號(hào)染色體的LOC28628基因中的第二個(gè)外顯子區(qū)。既往研究表明,在多種腫瘤與炎癥的發(fā)病機(jī)制過程中,hsa-miR-146a-5p可能發(fā)揮著重要作用[3-4]。本研究擬通過運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)hsa-miR-146a-5p的相關(guān)靶基因,獲取其關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)靶基因,探索hsa-miR-146a-5p在腫瘤及炎癥中發(fā)揮的作用,以期為探索hsa-miR-146a-5p在腫瘤和炎癥中相關(guān)分子功能及作為臨床診斷提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 hsa-miR-146a-5p的保守性分析 利用UCSC (http://genome.ucsc.edu/)、miRBase (http://www.mirbase.org) 等在線數(shù)據(jù)庫獲取hsa-miR-146a-5p的染色體定位、堿基序列、物種保守性等基礎(chǔ)信息。使用在線數(shù)據(jù)庫miR-Gator (http://mirgator.kobic.re.kr) 獲取hsa-miR-146a-5p在不同人類疾病中的表達(dá)豐度。

1.2 hsa-miR-146a-5p的靶基因預(yù)測(cè) 通過mirDIP (http://ophid.utoronto.ca/)、TargetScan (http://www.targetscan.org)和miRDB (http://mirdb.org) 三種在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)hsa-miR-146a-5p的潛在靶基因。利用Venny在線軟件取交集。再利用miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) 數(shù)據(jù)庫獲取已經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的hsa-miR-146a-5p的靶基因,將預(yù)測(cè)得到的潛在靶基因和實(shí)驗(yàn)證實(shí)的靶基因進(jìn)行合并,最終得到hsa-miR-146a-5p的潛在靶基因用于進(jìn)行后續(xù)的分析研究。

1.3 hsa-miR-146a-5p的靶基因蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析 利用在線數(shù)據(jù)庫String(https://string-db.org)得到所預(yù)測(cè)靶基因集合編碼蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù),然后將所得數(shù)據(jù)整理格式后導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件進(jìn)行PPI分析。

1.4 hsa-miR-146a-5p的靶基因KEGG信號(hào)通路分析及GO功能注釋 將前期預(yù)測(cè)得到的靶基因及其分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入在線數(shù)據(jù)庫DAVID (https://david.ncifcrf.gov) 對(duì)靶基因數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析和GO分析,以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn),獲取有差異的GO生物學(xué)過程及KEGG信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 各物種成熟miR-146a-5p序列保守性及染色體定位分析 UCSC數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果顯示,hsa-miR-146a-5p的基因序列號(hào)為MIMAT0000449,位于5q33.3染色體區(qū)域內(nèi) (見圖1),利用miRBase數(shù)據(jù)庫獲取人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、家犬(Canis familiaris)等十個(gè)物種的miR-146a-5p成熟序列。通過對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p成熟堿基序列中“UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU”22個(gè)堿基在各物種間高度保守,結(jié)果見表1。

表1 miR-146a-5p在不同物種中的成熟序列

圖1 hsa-miR-146a-5p在人類基因組中的位置

2.2 hsa-miR-146a-5p在人類不同疾病中的表達(dá)分析 利用miR-Gator在線數(shù)據(jù)庫查詢獲得hsa-miR-146a-5p的表達(dá)情況:hsa-miR-146a-5p在乳腺侵襲性導(dǎo)管瘤、子宮頸腺鱗癌、急性早幼粒細(xì)胞白血病及皮膚腫瘤等疾病中呈現(xiàn)高表達(dá) (見圖2)。

圖2 hsa-miR-146a-5p在人類各組織的表達(dá)分析

2.3 hsa-miR-146a-5p靶基因預(yù)測(cè) 利用mirDIP、miRDB和TargetScan三個(gè)在線數(shù)據(jù)庫得到靶基因個(gè)數(shù)分別為1 108、488、242個(gè),利用Venny在線軟件取交集得到77個(gè)靶基因(見圖3a)。此外,在miRTarBase數(shù)據(jù)庫中獲取已經(jīng)過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、Western blotting以及RT-qPCR等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證的靶基因共80個(gè),其中有7個(gè)靶基因與上述交集重合 (圖3b),由此最終得到150個(gè)潛在靶基因集合,用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

圖3 has-miR-146a-5p預(yù)測(cè)靶基因個(gè)數(shù)

2.4 hsa-miR-146a-5p靶基因編碼蛋白質(zhì)間的PPI預(yù)測(cè) 將前述150個(gè)潛在靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入到String在線數(shù)據(jù)庫分析靶基因編碼蛋白質(zhì)間的相互關(guān)系,將分析結(jié)果整理格式后導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件繪制PPI圖。結(jié)果顯示,hsa-miR-146a-5p的靶基因編碼蛋白質(zhì)之間蛋白質(zhì)互作關(guān)系密切,尤其是TLR4、TRAF6、IL6、NFKB1和EGFR等在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置 (見圖4)。

圖4 hsa-miR-146a-5p預(yù)測(cè)靶基因所編碼蛋白質(zhì)間的互相作用分析

2.5 hsa-miR-146a-5p的靶基因KEGG分析 對(duì)前述150個(gè)潛在靶基因進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),hsa-miR-146a-5p的靶基因顯著富集在Toll樣受體信號(hào)通路、乙型肝炎、腫瘤通路、恰加斯病、NF-κB等信號(hào)通路、致病性大腸桿菌感染、EB病毒感染、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、利什曼病、耶爾森菌感染、麻疹、酒精性肝病、弓形蟲病、人巨細(xì)胞病毒感染、沙門氏菌感染、人類免疫缺陷病毒1型感染、百日咳、胰腺癌癥、肺結(jié)核和TNF信號(hào)通路上 (見圖5)。

圖5 hsa-miR-146a-5p預(yù)測(cè)靶基因KEGG分析結(jié)果

2.6 hsa-miR-146a-5p的靶基因GO分析 對(duì)前述150個(gè)潛在靶基因從生物過程(Biological process,BP)、細(xì)胞組分(Cellular component,CC)、分子功能 (Molecular function,MF) 3個(gè)方面進(jìn)行GO分析。結(jié)果顯示,這些靶基因主要富集的生物過程包括平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、MyD88依賴性Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞介素介導(dǎo)的信號(hào)通路、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、DNA模板化的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、I-κB激酶/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)等(見圖6)。主要富集的細(xì)胞組分為內(nèi)體膜、細(xì)胞核、細(xì)胞溶膠、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞表面、核質(zhì)、高分子復(fù)合物、CD95死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物和染色質(zhì)等(見圖7)。主要富集的分子功能為蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、同一蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔壓子活性、NAD+核苷酸酶,環(huán)狀A(yù)DP核糖生成、NAD(P)+核苷酶活性、鋅離子結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、酶結(jié)合和染色質(zhì)結(jié)合等(見圖8)。

圖6 hsa-miR-146a-5p靶基因的生物過程富集分析

圖7 hsa-miR-146a-5p靶基因的細(xì)胞組分富集分析

圖8 hsa-miR-146a-5p靶基因的分子功能富集分析

3 討論

近年來大量研究發(fā)現(xiàn),miRNA在各種疾病的發(fā)生發(fā)展中均起著重要的調(diào)控作用,在多種疾病的診斷、治療和預(yù)后中發(fā)揮了潛在的價(jià)值[5]。hsa-miR-146a-5p作為近年來的研究熱點(diǎn),大量研究表明其與腫瘤及炎癥存在密切關(guān)聯(lián)[6-8]。目前針對(duì)hsa-miR-146a-5p的研究中,涉及的生物學(xué)過程、分析功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等尚不完全清楚。生物信息學(xué)方法能通過針對(duì)各種網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫的獲取,達(dá)到快速預(yù)測(cè)miRNA的潛在靶基因及潛在生物學(xué)功能的目的,目前已廣泛運(yùn)用于基因功能預(yù)測(cè)研究[9]。本研究通過利用生物信息學(xué)的研究方法,對(duì)hsa-miR-146a-5p的潛在作用靶點(diǎn)及其相關(guān)功能和信號(hào)通路進(jìn)行全面分析。

本次研究首先通過對(duì)不同物種hsa-miR-146a-5p的序列對(duì)比發(fā)現(xiàn),miR-146a-5p在多個(gè)物種中保持高度保守性,該結(jié)果表明hsa-miR-146a-5p可能在調(diào)控腫瘤和炎癥生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用。接下來,利用目前國(guó)內(nèi)外各種研究中常用的miRNA靶基因預(yù)測(cè)工具對(duì)hsa-miR-146a-5p潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。因miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫較多,為了提高預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,使用最常用的TargetScan、miRDB、mirDIP數(shù)據(jù)庫分析hsa-miR-146a-5p的潛在靶基因,并通過取交集的方式獲取在三大數(shù)據(jù)庫中均存在的潛在靶基因。同時(shí),也獲取了miRTarBase數(shù)據(jù)庫已經(jīng)過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、Western blotting以及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過的hsa-miR-146a-5p靶基因,二者取并集后,便獲得了無重復(fù)的150個(gè)潛在靶基因。

本研究通過預(yù)測(cè)hsa-miR-146a-5p的潛在靶基因得到其靶基因蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)為TLR4、TRAF6、EGFR、NFKBI、IL6,由此推測(cè)在hsa-miR-146a-5p調(diào)控的生物學(xué)效應(yīng)中上述五個(gè)中心節(jié)點(diǎn)基因發(fā)揮重要作用。其中,對(duì)于TLR4、TRAF6和EGFR,目前研究已經(jīng)通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、Western blotting以及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其為hsa-miR-146a-5p直接結(jié)合的靶基因。在大鼠腰椎間盤突出癥模型中過表達(dá)miR-146a-5p可以降低TLR4信號(hào)通路的活性和促炎因子的釋放,這可能是治療腰椎間盤突出癥的潛在策略[10]。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究中發(fā)現(xiàn),hsa-miR-146a-5p下調(diào)后TRAF6的表達(dá)增高,促進(jìn)狼瘡性腎炎的發(fā)生[11]。還有研究表明,隱丹參酮可以通過has-miR-146a-5p/EGFR軸,從而抑制非小細(xì)胞癌的增殖[12]。這些研究均表明,hsa-miR-146a-5p很可能通過多靶點(diǎn)的方式在腫瘤和炎癥中發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)。對(duì)于NFKB1和IL6,目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏相應(yīng)的研究直接明確證實(shí)其為has-miR-146a-5p的直接靶向調(diào)控基因,需要后期通過細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

據(jù)本次對(duì)hsa-miR-146a-5p靶基因的KEGG分析發(fā)現(xiàn),hsa-miR-146a-5p下游靶基因富集的前20條KEGG通路均與腫瘤及炎癥相關(guān)。其中,腫瘤相關(guān)通路有2條,即腫瘤通路、胰腺癌;炎癥中尤以感染類炎癥最為顯著,感染類炎癥相關(guān)通路有14條,即乙型肝炎、EB病毒感染、致病性大腸桿菌感染、利什曼病、鼠疫感染、人巨細(xì)胞病毒感染、人類免疫缺陷病毒1型感染、沙門氏菌感染、恰加斯病、麻疹、酒精性肝病、肺結(jié)核、百日咳、弓形體病信號(hào)通路;其余炎癥相關(guān)通路有4條,即Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化。

在對(duì)hsa-miR-146a-5p靶基因的GO富集分析的結(jié)果中,前20條生物過程里面有13條與炎癥反應(yīng)相關(guān),分別是MyD88依賴性Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞介素介導(dǎo)的信號(hào)通路、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、I-κB激酶/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)、JNK級(jí)聯(lián)、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、白細(xì)胞介素-6產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)、白細(xì)胞介素-8產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)、白細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞的正調(diào)節(jié)、NF-κB誘導(dǎo)激酶活性的激活等。

既往發(fā)現(xiàn)hsa-miR-146a-5p在多種腫瘤及炎癥中發(fā)揮作用[13]。在腫瘤方面,hsa-miR-146a-5p可以通過靶向TRAF6的3’-UTR抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞增殖并使其對(duì)吉西他濱化療敏感[14]。hsa-miR-146a-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞遷移,降低p-ERK表達(dá)[15]。在炎癥方面,有研究表明源自人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中的hsa-miR-146a-5p可以減輕小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[16]。同時(shí)研究證實(shí),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體中的miR-146a-5p可通過下調(diào)NFAT1和IRAK1的表達(dá),進(jìn)而減少神經(jīng)元凋亡以及與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化相關(guān)的炎癥,從而在腦出血后提供神經(jīng)保護(hù)和功能改善[17]。hsa-miR-146a-5p還可通過調(diào)節(jié)TXNIP的表達(dá),抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷中的細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[18]。研究還表明hsa-miR-146a-5p可能通過抑制TRAF6/NF-κB信號(hào)通路影響子癇前期母胎界面的炎癥反應(yīng)[19]。這些研究和本文結(jié)果共同表明,hsa-miR-146a-5p很可能在腫瘤及炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

綜上所述,本文通過綜合運(yùn)用生物信息學(xué)的方法,預(yù)測(cè)和分析hsa-miR-146a-5p的物種保守性、hsa-miR-146a-5p的潛在靶基因、靶基因的蛋白質(zhì)互作分析、靶基因的KEGG通路富集分析以及GO注釋分析等方面,從而進(jìn)一步探索hsa-miR-146a-5p在腫瘤、炎癥等中的潛在作用靶點(diǎn)及通路。本研究為將來探索hsa-miR-146a-5p與腫瘤和炎癥發(fā)展進(jìn)程關(guān)系提供了初步的理論依據(jù),但本研究所得的結(jié)果還需進(jìn)行體外及體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)一步證明。