鄧雙嬌，左冬梅，陳倩云，劉與進(jìn)，李華蓉，2

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科（湖北 武漢 430022）；2.華中科技大學(xué)協(xié)和京山醫(yī)院中醫(yī)科（湖北 荊門(mén) 431800）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種累及結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎癥性疾病，臨床主要表現(xiàn)為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急后重等［1］。我國(guó)UC 的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢(shì)［2］。UC復(fù)發(fā)率高，遷延難愈，且有一定的癌變率，被世界衛(wèi)生組織列為世界難治性疾病。因此積極探索UC 的發(fā)病機(jī)制和治療方法具有重要的臨床意義。

自噬對(duì)炎癥反應(yīng)有重要的調(diào)控作用，不僅影響感染性疾病的緩解和炎癥性疾病的病理過(guò)程，而且在無(wú)細(xì)菌感染的組織損傷誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中也能發(fā)揮抗炎效應(yīng)。自噬功能障礙是UC發(fā)病的重要因素［3-4］，因此調(diào)控自噬可能是控制UC腸道炎癥的切入點(diǎn)之一。

復(fù)方苦參湯治療UC臨床療效確切［5-7］，然相關(guān)的作用機(jī)制需要進(jìn)一步探究。本研究通過(guò)觀察UC 小鼠結(jié)腸組織自噬相關(guān)分子及炎癥因子表達(dá)情況，探討復(fù)方苦參湯治療UC 的可能機(jī)制，以期為本病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)7～8 周齡的雄性C57BL/6 小鼠20只，體質(zhì)量18～22 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（J）2019-0010。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2016-0057。采光晝夜交替，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：S2640）。

1.1.2 藥物與試劑 復(fù)方苦參湯由苦參15 g、地榆15 g、青黛3 g、白及10 g、三七3 g、甘草10 g 組成，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中藥房。上述中藥煎煮濃縮至100 mL含生藥量36.4 g水溶液，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

美沙拉嗪緩釋顆粒（0.5 g/粒），法國(guó)愛(ài)的發(fā)制藥集團(tuán)（批號(hào)：H20193164）。使用前采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液配成5 g/L混懸液。

葡聚糖硫酸鈉（DSS），美國(guó)MP Biomedicals 公司（批號(hào)：Q7418）；Bcl-2 同源結(jié)構(gòu)域蛋白1（Beclin1）、泛素結(jié)合蛋白 P62（P62）、微管相關(guān)蛋白1A/1B 輕鏈3（LC3）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、一抗及羊抗兔HRP 標(biāo)記二抗，武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司（批號(hào)分別為A7353、A7758、A19665、AC026、AS014）；小鼠白介素（IL）-1β、IL-4、IL-10、IL-18 試劑盒，蛋白裂解液、二奎啉甲酸法（BCA）定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL）、4%多聚甲醛固定液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為PI301、PI612、PI522、PI553、P0013B、P0012S、P0012A、P0018S、P0099）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司（批號(hào)分別為R212-01/02、Q411-02/03）；隱血試劑盒，南京建成生物工程研究所（批號(hào)：C027-1-1）。

1.1.3 主要儀器 蛋白電泳儀，北京市六一儀器廠（型號(hào)：DYY-6C）；轉(zhuǎn)膜儀，北京市六一儀器廠（型號(hào)：DYCZ-400D）；StepOne Plus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國(guó)ABI 公司（型號(hào)：7500）；核酸測(cè)定儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（型號(hào)：NanoDrop ONE）；化學(xué)發(fā)光儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（型號(hào)：iBright750）；研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司（型號(hào)：KZ-Ⅱ）；酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司（型號(hào)：CMax Plus）；臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司（型號(hào)：5424R）；數(shù)碼顯微鏡，日本Olympus 株式會(huì)社（型號(hào)：DP73）；電子天平，杭州萬(wàn)特衡器有限公司（型號(hào)：WT2002）。

1.2 分組與造模 20 只C57BL/6 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組、模型組、復(fù)方苦參湯組及美沙拉嗪組，每組5 只。除正常組外，其余組別小鼠應(yīng)用3%DSS溶液誘導(dǎo)7 d，建立UC模型，小鼠出現(xiàn)腹瀉、體質(zhì)量減輕、黏液膿血便時(shí)說(shuō)明造模成功［8］。

1.3 干預(yù)方法 造模的同時(shí)開(kāi)始灌胃給藥，在造模第1 天起，按10 mL/kg 體質(zhì)量，正常組和模型組以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液灌胃，復(fù)方苦參湯組予復(fù)方苦參湯濃縮液7.28 g/kg 灌胃，美沙拉嗪組予美沙拉嗪混懸液0.52 g/kg 灌胃，每日1 次，連續(xù)給藥7 d。同時(shí)每日觀察并記錄各組小鼠體質(zhì)量變化、大便性狀及隱血情況，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 一般情況及DAI 評(píng)分 造模及灌胃期間，每日觀察并記錄小鼠的活動(dòng)度、體質(zhì)量及大便性狀、隱血等一般情況。根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［9］進(jìn)行評(píng)分。DAI 評(píng)分=（體質(zhì)量下降評(píng)分+大便性狀評(píng)分+大便隱血評(píng)分）/3。分?jǐn)?shù)越高，提示炎癥越重。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見(jiàn)表1。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 結(jié)腸長(zhǎng)度、形態(tài)變化情況 小鼠麻醉后解剖，取小鼠盲腸至肛門(mén)端并平鋪于白紙上，使用手機(jī)相機(jī)原像素拍照并記錄。

1.4.3 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評(píng)分及蘇木精-伊紅（HE）染色 分離結(jié)腸后，沿腸系膜縱軸剪開(kāi)，用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗后，用濾紙吸干，平放在白紙上進(jìn)行CMDI評(píng)分［8］評(píng)價(jià)（評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2）。使用4%多聚甲醛固定小鼠結(jié)腸，石蠟包埋切片后，HE 染色，通過(guò)顯微鏡觀察結(jié)腸組織病理變化情況。見(jiàn)表2。

1.4.4 結(jié)腸組織IL-1β、IL-4、IL-10、IL-18水平 小鼠結(jié)腸組織稱(chēng)重后，按1∶5 的質(zhì)量體積比，加入預(yù)冷的PBS，使用勻漿機(jī)充分勻漿，5 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-4、IL-10、IL-18的水平。

1.4.5 結(jié)腸組織中P62、Beclin1、LC3 蛋白表達(dá) 采用免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)結(jié)腸組織中P62、Beclin1、LC3 蛋白表達(dá)水平。取適量小鼠結(jié)腸組織，加入蛋白裂解液及3 顆勻漿珠，進(jìn)行低溫勻漿（60 Hz，180 s）；冰上裂解20 min 后，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液至新的EP 管。采用二奎啉甲酸法（BCA）測(cè)定蛋白濃度，配制10%的丙烯酰胺分離膠，5%的濃縮膠，上樣進(jìn)行電泳。用0.45 μm 的聚偏二氟乙烯膜（PVDF）轉(zhuǎn)膜，5%的牛奶封閉1 h，三乙醇胺緩沖鹽水溶液（TBST）清洗3 次，每次5 min；分別加入Beclin1、LC3、P62、β-actin 抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過(guò)夜；用TBST 洗膜后，二抗孵育1 h；洗膜，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液顯影，曝光儀中曝光。利用ImageJ 軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 結(jié)腸組織中P62、Beclin1、LC3mRNA 的表達(dá)采用RT-qPCR 法檢測(cè)結(jié)腸組織中P62、Beclin1、LC3mRNA的表達(dá)水平。TRIzol法提取結(jié)腸組織總RNA，測(cè)定濃度及純度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，體系為20 μL、42 ℃、15 min。以β-actin為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)高溫變性（95 ℃，10 s）、退火（60 ℃，60 s）、延伸（60 ℃，30 s）、循環(huán)（40次），每個(gè)樣品重復(fù)3次。擴(kuò)增結(jié)束，記錄Ct 值。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表3。

表3 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)一般情況及DAI評(píng)分的影響 造模前各組小鼠反應(yīng)靈活，精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量基本相當(dāng)，大便正常，隱血試驗(yàn)均為陰性。造模后，小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，體質(zhì)量下降，出現(xiàn)肉眼黏液膿血便和稀水樣黃便、黑便。復(fù)方苦參湯組部分小鼠出現(xiàn)黏性、較為成形的大便，血便明顯減少，體質(zhì)量緩慢恢復(fù)；美沙拉嗪組血便減少，但是部分仍腹瀉，體質(zhì)量逐漸恢復(fù)。正常組小鼠實(shí)驗(yàn)期間DAI評(píng)分為0分。與正常組比較，模型組小鼠DAI 評(píng)分明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，復(fù)方苦參湯組及美沙拉嗪組DAI評(píng)分明顯降低（P<0.05）；與美沙拉嗪組比較，復(fù)方苦參湯組DAI 評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠DAI評(píng)分比較

2.2 對(duì)結(jié)腸長(zhǎng)度及CMDI評(píng)分的影響 與正常組比較，模型組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短（P<0.05），而結(jié)腸黏膜CMDI 評(píng)分顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，復(fù)方苦參湯組及美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加（P<0.05），而結(jié)腸黏膜CMDI評(píng)分均明顯降低（P<0.05）。與美沙拉嗪組比較，復(fù)方苦參湯組CMDI評(píng)分升高（P<0.05），而結(jié)腸長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及CMDI評(píng)分比較

2.3 對(duì)結(jié)腸組織形態(tài)的影響 正常組結(jié)腸黏膜表面光滑，形態(tài)完整，細(xì)胞排列整齊，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組結(jié)腸組織黏膜層可見(jiàn)灶性糜爛壞死，壞死區(qū)域黏膜內(nèi)腸腺結(jié)構(gòu)消失，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（如紅色箭頭所示）。復(fù)方苦參湯組腸道黏膜層可見(jiàn)小灶性糜爛，部分腸腺結(jié)構(gòu)損傷，伴有少量炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)（如紅色箭頭所示）。美沙拉嗪組腸黏膜層腸腺結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)則，黏膜層局部有炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)（如紅色箭頭所示）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織病理情況（HE染色，×100）

2.4 對(duì)結(jié)腸組織炎癥因子IL-1β、IL-4、IL-10、IL-18 的影響 與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18含量顯著升高（P<0.05），IL-4、IL-10含量顯著下降（P<0.05）。與模型組比較，復(fù)方苦參湯組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18 含量顯著下降（P<0.05），而IL-4、IL-10含量顯著增加（P<0.05）。與美沙拉嗪組比較，復(fù)方苦參湯組結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18 含量升高（P<0.05），而IL-4、IL-10 含量下降（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠結(jié)腸IL-1β、IL-18、IL-4、IL-10表達(dá)水平比較

2.5 對(duì)結(jié)腸組織自噬相關(guān)分子Beclin1、LC3、P62 蛋白和mRNA表達(dá)水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中P62 蛋白和其mRNA 的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），Beclin1、LC3 蛋白和其mRNA 的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，復(fù)方苦參湯組及美沙拉嗪組P62 蛋白和其mRNA 的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），而B(niǎo)eclin1、LC3 蛋白和其mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。與美沙拉嗪組比較，復(fù)方苦參湯組P62蛋白和其mRNA 的表達(dá)水平升高（P<0.05），而B(niǎo)eclin1、LC3蛋白和其mRNA表達(dá)水平下降（P<0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織自噬相關(guān)分子P62、Beclin1、LC3蛋白和其mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

臨床上UC 常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便或里急后重等癥狀，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“腹痛”“泄瀉”“痢疾”“休息痢”等范疇［10-11］。復(fù)方苦參湯由苦參、地榆、白及、甘草、青黛、三七組成，具有清熱解毒化濕、固澀止瀉、消腫生肌、調(diào)氣行血、止血等功效［12］。復(fù)方苦參湯治療UC 具有明顯的臨床效果，且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明復(fù)方苦參湯對(duì)結(jié)腸炎大鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制結(jié)腸的炎癥反應(yīng)，減輕腸上皮屏障的損傷，緩解臨床癥狀［12-14］。

本研究采用DSS 建立UC 小鼠模型。該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)，動(dòng)物的病理表現(xiàn)與人類(lèi)UC 臨床表現(xiàn)相似，成為研究UC 發(fā)病機(jī)制及評(píng)估治療藥物療效的主要模型［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后小鼠精神萎靡，體質(zhì)量下降，出現(xiàn)肉眼黏液膿血便和稀水樣黃便、黑便，DAI及CMDI 評(píng)分較高。結(jié)腸長(zhǎng)度的變化在一定程度上能反映結(jié)腸炎癥的水平［16］。通過(guò)解剖發(fā)現(xiàn)，模型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，結(jié)腸黏膜局部充血、水腫，潰瘍明顯。HE 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型小鼠結(jié)腸組織的完整結(jié)構(gòu)被破壞，黏膜層有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞減少，腺體結(jié)構(gòu)破壞，有大量的異常增生組織。復(fù)方苦參湯組及美沙拉嗪組小鼠大便性狀、血便等一般癥狀顯著改善，體質(zhì)量下降，DAI 評(píng)分降低；結(jié)腸黏膜充血水腫和結(jié)腸攣縮改善，CMDI 評(píng)分降低；在病理組織變化中發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸的病理?yè)p傷程度改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，說(shuō)明復(fù)方苦參湯對(duì)慢性UC小鼠結(jié)腸黏膜有一定的改善作用。

自噬是一種常見(jiàn)的細(xì)胞程序性死亡機(jī)制，是細(xì)胞內(nèi)降解過(guò)量、受損或老化的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器以維持細(xì)胞內(nèi)平衡的過(guò)程［17］。自噬功能障礙在破壞腸道穩(wěn)態(tài)、影響腸道微生物組成和加劇腸道炎癥方面具有關(guān)鍵作用［3］。Beclinl、LC3 和P62 是參與自噬過(guò)程的3 個(gè)主要分子，也是檢測(cè)自噬水平的關(guān)鍵指標(biāo)。Beclin1 能促進(jìn)自噬啟動(dòng)，LC3 作為自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，存在于自噬溶酶體的降解過(guò)程中，二者表達(dá)水平和自噬水平呈正相關(guān)；而自噬底物蛋白P62通過(guò)在C端與泛素化蛋白結(jié)合以及N 端與LC3-Ⅱ結(jié)合參與自噬的降解，其表達(dá)水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)［18］。相關(guān)研究［19］證實(shí)，自噬可以通過(guò)維持正常腸道菌群和黏液來(lái)改善UC 的進(jìn)展。在自噬過(guò)程中，LC3-Ⅱ是反映自噬活性的蛋白，通過(guò)阻斷mTOR 信號(hào)通路，可以上調(diào)LC3-Ⅱ，增強(qiáng)自噬水平，進(jìn)而減輕腸道炎癥程度［20-21］。本研究中，模型組的Beclinl、LC3 表達(dá)較正常組減少，P62 增多，說(shuō)明UC 小鼠結(jié)腸組織自噬為低水平表達(dá)狀態(tài)，而在復(fù)方苦參湯及美沙拉嗪干預(yù)后，Beclin1、LC3 的表達(dá)水平明顯升高，P62 的表達(dá)水平下降，這說(shuō)明復(fù)方苦參湯的部分效應(yīng)與美沙拉嗪相同，即復(fù)方苦參湯和美沙拉嗪能夠促進(jìn)自噬。自噬缺陷與炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，促進(jìn)自噬可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥水平、增強(qiáng)腸道病原體的清除而對(duì)炎癥性腸病發(fā)揮治療作用［22］。綜上所述，復(fù)方苦參湯可調(diào)節(jié)UC 小鼠炎癥因子的表達(dá)，改善結(jié)腸損傷等癥狀，這可能與其抑制自噬相關(guān)分子Beclinl、LC3和P62 的表達(dá)有關(guān)，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。