巴宗韜，高外毛，熱愛拉·阿合力江，徐 穎，王 健

1.上海中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院（上海 201203）；2.上海中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院（上海 201203）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種神經退行性疾病，其特征是有β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成老年斑和tau 蛋白過度磷酸化導致神經纖維纏結［1］。AD 病因迄今不明，一般被認為是起因復雜的異質性疾病，可能是由多種因素同時參與致病，如遺傳因素、氧化應激與炎癥反應、神經遞質功能紊亂和環(huán)境因素等。AD 多發(fā)于老年人，由于全球人口老齡化的加劇，AD 患者與日俱增。但目前，臨床上尚無有效阻止AD 發(fā)生或能逆轉其進展的治療藥物，急需尋找實質性改變AD 患者臨床進程的靶標。

比較公認的AD 發(fā)病機制指出，Aβ 生成和清除的穩(wěn)態(tài)被打破是神經元變性和癡呆發(fā)生的原始誘因，其可誘導tau 蛋白過度磷酸化、炎癥反應、神經元凋亡等一系列病理過程。早老素1和2條件性雙基因敲除（PS cDKO）的成年小鼠前腦中出現了神經元和突觸丟失、星形膠質細胞增生和tau 的過度磷酸化，這與AD 的神經病理學很相似，因此被選用為研究AD 病理和藥理學機制的動物模型［2］。

葛根素（puerarin，Pue）是從葛根中提取的主要生物活性成分，已廣泛用于心腦血管疾病、糖尿病及糖尿病并發(fā)癥、骨壞死、帕金森病、AD、子宮內膜異位癥、癌癥的治療。Pue 擁有廣泛的藥理特性，如血管舒張、心臟保護、神經保護、抗氧化、抗癌、抗炎、減輕疼痛、促進骨骼形成、抑制酒精攝入和減弱胰島素抵抗等，因此具有廣泛的藥用價值。

課題組的前期研究［3］表明，Pue 能夠通過調控PS cDKO 小鼠的突觸功能來改善AD 樣的病理表現，但是并沒有深入開展進一步的機制研究。網絡藥理學一直被用作中醫(yī)藥藥理基礎與作用機制研究的熱門工具，并廣泛應用于中藥活性成分篩選、藥物重定位、中藥配伍機制探索及中醫(yī)藥多成分、多靶點、多通路的作用機制闡釋等。為此，本研究基于網絡藥理學和分子對接篩選了Pue 治療AD 的關鍵分子、核心靶點和所涉及的重點信號通路，同時采用動物實驗驗證，以期對已有的成果進行補充，并為Pue 的臨床應用和開發(fā)提供新的思路。

1 研究思路

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、集成藥效團匹配平臺（PharmMapper，http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）等獲取Pue 的作用靶點，利用人類基因綜合數據庫（GeneCards，https：//www.genecards.org）獲取AD 相關靶點；藥物與疾病靶點映射后獲取交集靶點，應用蛋白互作網絡分析數據庫（String，https：//cn.string-db.org）構建蛋白質相互作用網絡圖，并篩選出核心靶點進行分子對接；通過生物信息數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov）對核心靶點進行基因本體論（GO）功能富集分析，在京都基因和基因組百科全書數據庫（KEGG，https：//www.genome.jp/kegg/）進行信號通路分析，最后進行動物實驗驗證結果。見圖1。

圖1 葛根素治療阿爾茨海默病的網絡藥理學研究思路

2 方法

2.1 Pue 靶點預測 采用TCMSP 以及PharmMapper 等數據庫以“puerarin”為檢索詞，通過TCMSP 數據庫下載Pue 的2D 結構及靶點；并在PharmMapper 數據庫中使用上述mol2 格式文件導出該數據庫收錄的Pue 潛在的靶點。將上述靶點在整合蛋白質數據庫（Uniprot，https：//www.uniprot.org）中轉換為對應的基因靶點并去重，對獲得的靶基因進行規(guī)范和驗證。

2.2 AD相關疾病靶點獲取 在GeneCards數據庫中以“Alzheimer's disease”為關鍵詞檢索與AD 相關的疾病靶點，然后利用Uniprot 數據庫對靶基因進行驗證和補充。根據相關性分數（Relevance score）值篩選后，將上述藥物-疾病靶基因上傳至Venny 2.1.0 平臺進行映射，得到交集靶點。

2.3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI）的構建 將Pue 的預測靶點與AD 相關靶點的交集導入String 數據庫，物種限定為人（Homo sapiens），設置置信度>0.5，隱藏離散蛋白節(jié)點，構建Pue-AD 疾病靶點PPI 并導出。使用Cytoscape 3.9.1軟件對PPI網絡進行分析和優(yōu)化處理，利用Network Analyzer 分析其Degree 等網絡拓撲特征值。以超過度中心性的中位數作為篩選標準，選取核心靶點。

2.4 GO 富集分析和KEGG 信號通路分析 將Pue 干預AD 的核心靶點通過進一步的基因注釋和通路分析，確定其代表的功能。將核心靶點導入DAVID數據庫與KEGG數據庫，限定物種為人，設定閾值P<0.05，然后進行基因功能和通路富集分析，并依據P-vaule 值排序，對分析結果進行可視化處理。

2.5 分子對接驗證 選取PPI 網絡圖中Degree 值排名前6 的靶點與Pue 進行分子對接。從SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）數據庫中獲取PPI 網絡中度值前6 的靶標蛋白的PDB ID，依次輸入PDB 蛋白質結構數據庫（RCSB PDB，https：//www.rcsb.org），在數據庫獲取對應蛋白結構的PDB 格式文件。在Pymol 軟件中對Pue 的mol2 格式文件進行預處理并轉換為PDB格式，再將Pue PDB 格式文件與所有蛋白PDB 格式文件在AutoDockTools 1.5.7 軟件中進行去水、加氫和電荷平衡等預處理，并獲取Pue與所有蛋白結構的口袋位置參數，然后導出為PDBQT 格式文件。應用Vina 軟件進行分子對接得到分子結合效能（affinity）。應用Pymol軟件對結果進行可視化處理。

2.6 動物實驗驗證

2.6.1 動物 SPF 小鼠40 只，體質量為（25±3）g，雌雄各半，由華東師范大學腦功能基因組學研究所贈送。對于PS cDKO小鼠的繁殖和鑒定方法同前期研究［4］，其中攜帶轉基因Cre，PS1和PS2的基因型為fPS1/fPS1、PS2-/-的小鼠作為PS cDKO 小鼠，不攜帶Cre基因且PS1和PS2的基因型為PS1+/+、PS2+/+的小鼠作為WT 小鼠。所有小鼠均飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房，飼養(yǎng)溫度為（22±2）℃，明暗交替周期為12 h，自由飲水與攝食。動物生產合格證號：SCXK（滬）2017-0011。動物使用許可證號：SYXK（滬）2020-0009。與實驗動物相關的實驗操作遵守倫理規(guī)定，經過上海中醫(yī)藥大學實驗動物管理和使用委員會批準（倫理批準號：PZSHUTCM221017015）。

2.6.2 藥物 Pue，上海同田生物技術股份有限公司（批號：1601262）；二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma-Aldrich 公司（批號：D2650）；兔抗裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3），美國CST 公司（批號：9661S）；兔抗細胞外調節(jié)蛋白激酶［p44/42 MAPK（Erk1/2）］，美國CST 公司（批號：4695S）；兔抗磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶［p-p44/42 MAPK（Erk1/2）］，美國CST 公司（批號：4370S）。

2.6.3 主要儀器及軟件 多功能酶標儀，美國BioTek公司（型號：Synergy2）；電泳儀，美國Bio-Rad 公司（型號：PowerPacTMHC）；全自動凝膠成像儀，上海天能公司（型號：Tanon-4200SF）；VisuTrack 嚙齒類動物行為分析軟件，上海欣軟公司（型號：XR-VT）；ImageJ 軟件，美國National Institutes of Health 公司。

2.6.4 分組與干預 將5 月齡的PS cDKO 小鼠隨機分為模型組（PS cDKO）和模型+Pue 組（cDKO+Pue）；將同窩野生型小鼠隨機分為野生型組（WT）和野生型+Pue組（WT+Pue）。每組10 只。WT+Pue 組和cDKO+Pue 組的小鼠給予Pue（100 mg/kg）的腹腔注射治療，WT 組和cDKO 組的小鼠給予相同溶媒0.02%DMSO 注射，共治療30 d，然后進行行為學測試，測試結束后取材進行分子生物學檢測。第31 天進行行為學測試，行為學測試期間繼續(xù)如前給予Pue治療。

2.6.5 檢測指標與方法

2.6.5.1 Y迷宮實驗 Y迷宮實驗是利用嚙齒動物對新異環(huán)境的探索天性，測定動物的空間識別記憶能力。Y迷宮實驗具體操作參照前期研究［3］，Y 迷宮用于測試動物的辨別記憶、參考記憶、工作記憶，由3個完全相同的臂（30 cm×6 cm×15 cm）組成，各個臂之間夾角是120°。小鼠始終從同一臂出發(fā)，將另一臂定義為新異臂后將其封閉，使小鼠自由探索8 min。1 h 后將新異臂打開，使小鼠探索整個迷宮8 min。計算得到小鼠在新異臂停留的時間比和進入新異臂的次數。兩次實驗之間清理迷宮，使用75%乙醇驅除小鼠殘留氣味。

2.6.5.2 Western blot 實驗 小鼠麻醉后在冰上取海馬放于液氮中冷凍，實驗時用預冷的組織裂解緩沖液以及1 mmol/L 苯甲烷磺酰氟、蛋白酶和磷酸酶抑制劑裂解所需組織。在4 ℃、15 000 r/min的條件下離心30 min獲得裂解液，提取核蛋白并定量。每樣取40 μg 用10%和12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）作用，然后轉移到硝化纖維素膜上。將在4 ℃與一抗Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、兔抗p44/42 MAPK（Erk1/2）（1∶1 000）、兔抗p-p44/42 MAPK（Erk1/2）（1∶2 000）孵育一夜的硝化纖維素膜與酶標二抗（1∶3 000）在室溫下孵育1 h，并使用發(fā)光底物進行孵育。用全自動凝膠成像儀掃描條帶，用ImageJ 軟件對蛋白條帶強度進行定量。相對蛋白水平歸一化為β-肌動蛋白水平。

2.7 統計學方法 用SPSS Statistics 24.0 軟件進行數據分析，組間數據比較采用單因素方差分析（單因素ANOVA）。計量資料采用±s表示，以P<0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 預測Pue靶點 通過TCMSP、PharmMapper數據庫檢索以及查閱文獻補充，最終共得到預測靶點340個。

3.2 AD相關靶點篩選 從相關數據庫獲得AD相關靶點11 120 個。根據經驗設定相關性分數大于中位數的相關靶點為AD 的潛在靶點，則通過GeneCards 所得AD靶點相關性分數最大值為158.657 44，最小值為0.105 21，中位數為2.502 06，得到靶點5 560 個；再取中位數篩選兩次后得到最大值為158.657 44，最小值為5.885 89，中位數為12.110 79。故設定相關性分數>12.110 79 的靶點為AD 的潛在靶點。最終得到1 130 個靶點。在Venny 2.1.0 平臺將預測的藥物成分靶點與AD 靶點取交集，得到交集靶點118 個，并繪制韋恩（Venn）圖。見圖2。

圖2 葛根素治療阿爾茨海默病靶點的韋恩圖

3.3 構建PPI 將“3.2”中所獲得的118 個靶點利用String 數據庫分析，構建PPI 模型。見圖3。將String 數據庫結果導入Cytoscape 3.9.1軟件中對PPI網絡進行分析和可視化處理，節(jié)點顏色及大小的變化與度中心性呈正相關，因此可直觀獲得Pue 治療AD 的核心靶點。PPI網絡具有比預期更多的邊緣，表明這些蛋白質至少部分地作為一個群體進行生物學連接，整個網絡高度互動。結果顯示，Pue 治療AD 的效應機制可能與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、半胱氨酸蛋白酶（CASP3）、白蛋白（ALB）、表皮生長因子受體（EGFR）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內皮生長因子A（VEGFA）等蛋白相關。

圖3 葛根素治療阿爾茨海默病的靶點

3.4 GO 富集分析和KEGG 信號通路分析 對Pue 干預AD 的核心靶點通過DAVID 數據庫進行GO 富集分析，共得到GO 條目148 個（P<0.05）。其中生物過程（BP）條目100 個，細胞組成（CC）條目23 個，分子功能（MF）條目25個，見圖4。其中BP條目主要涉及Erk1和Erk2 級聯的正調節(jié)（positive regulation of Erk1 and Erk2 cascade）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯的正調節(jié)（positive regulation of MAPK cascade）、蛋白質磷酸化的正調節(jié)（positive regulation of protein phosphorylation）、蛋白質自磷酸化（protein autophosphorylation）等；CC 條目主要涉及谷氨酸能突觸（glutamatergic synapse）、突觸后膜（postsynapse）、神經元細胞體（neuronal cell body）等；MF 條目主要涉及相同蛋白結合（identical protein binding）、酶結合（enzyme binding）、蛋白激酶結合（protein kinase binding）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）等。

圖4 基因本體論數據庫（GO）富集結果

再對核心靶點進行KEGG 通路富集分析，得到11條信號通路（P<0.05），分別為白介素-17（IL-17）信號通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路、AD 信號通路、核因子-κB（NF-κB）信號通路、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號通路、激酶Janus 和轉錄因子STAT（JAK-STAT）信號通路等，見圖5。將上述靶點輸入KEGG 數據庫做通路圖富集，選擇代表性的通路圖進行展示，見圖5。上述表明Pue 通過調控多條信號通路來干預AD的發(fā)展。

圖5 京都基因和基因組百科全書數據庫（KEGG）通路篩選

3.5 分子對接分析 本研究分子對接結果顯示見表1。結果進行可視化展示，見圖6。表明Pue 可通過與其相應的靶點受體結合而影響其功能，在AD 治療中發(fā)揮重要作用。

表1 分子對接結果

圖6 分子對接結果可視化展示

3.6 Y 迷宮實驗結果 結果表明，與WT 小鼠比較，PS cDKO 小鼠在新臂的停留時間和探索新臂的次數均降低（P<0.05），表明PS cDKO 小鼠的空間識別記憶能力受損；經過Pue治療后，這些情況發(fā)生了逆轉（P<0.05），表明Pue可以改善PS cDKO小鼠的空間識別記憶障礙。見圖7。

圖7 Pue對小鼠的空間識別記憶障礙的影響

3.7 Western blot實驗結果 與WT 組比較，cDKO 組小鼠前額皮質p-Erk1/2 蛋白水平升高（P<0.05）；與cDKO組比較，cDKO+Pue 組小鼠前額皮質p-Erk1/2 蛋白水平降低（P<0.05）。與WT 組比較，cDKO 組小鼠前額皮質Cleaved Caspase-3 蛋白水平升高（P<0.05）；與cDKO 組比較，cDKO+Pue 組小鼠前額皮質Cleaved Caspase-3 蛋白水平降低（P<0.05）。見圖8。

圖8 各組前額皮質p-Erk1/2、Erk1/2、Cleaved Caspase-3蛋白表達情況

4 討論

近年來研究［5］顯示天然化合物尤其是中藥及其產物可以通過作用于多種機制來抑制AD 的發(fā)生和發(fā)展，在藥物開發(fā)困境尚未突破的今天，中藥因為其多靶點治療效應，已經成為AD 藥物開發(fā)的潛在對象。葛根為豆科植物葛的塊根，于春、秋兩季采挖，洗凈后去除外皮，切片干燥后使用?！渡褶r本草經》言其能平消渴，除大熱，止嘔吐，通諸痹，起陰氣，解諸毒。Pue 是從葛根中分離的異黃酮類衍生物。藥物代謝動力學顯示，作用于體內后Pue 主要分布于心臟、肺、脾、胃、乳房、肝、腎及血漿、睪丸、肌肉、脛骨和股骨，并可透過血腦屏障進入腦內［6］。Pue 可以減輕蛛網膜下腔出血小鼠的神經功能缺損，有效減輕腦水腫，保護血腦屏障；并可能是通過B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）/Bcl-2相關蛋白質（Bax）/Cleaved Caspase-3 和去乙?；?（Sirt3）/超氧化物歧化酶2（SOD2）凋亡途徑減輕蛛網膜下腔出血小鼠的神經功能缺損。［7］Pue 還在一定程度上恢復了AD 模型小鼠海馬和大腦皮質內腦源性神經營養(yǎng)因子、tau 蛋白磷酸化、丙二醛、乙酰膽堿酯酶、糖原合成酶激酶-3β 的水平，以及SOD 的活性，表明Pue 可能對Aβ 誘導的認知損傷具有保護作用［8］。Pue 為葛根的特有異黃酮，研究［9］顯示口服高劑量Pue 在大鼠體內吸收較好，且安全性良好。Pue在AD中發(fā)揮神經保護作用的研究［10］主要涉及PI3K/AKT、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、Caspase-3、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等信號通路，可通過抑制氧化應激、凋亡、Aβ 產生和沉積，降低tau 蛋白過度磷酸化，調控鐵代謝、抑制脂質過氧化、抗炎和改善突觸可塑性，以及可能抑制鐵死亡等機制，在AD 中具有獨特的藥理作用。我們所做的網絡藥理學研究與上述眾多實驗性結果高度重合，并提供了更多尚未被驗證的可能通路與機制。

圖5B 中紅色橢圓形區(qū)域內為Pue 治療AD 的核心靶點，選取其中一條Ca2+-Erk1/2-CASP3-cell death 通路進行驗證，而CASP3 已在分子對接中得到驗證。Western blot 結果顯示，Pue 抑制了PS cDKO 小鼠Erk1/2的磷酸化水平和Cleaved Caspase-3 的表達水平。研究［11］表明，細胞間Ca2+水平升高會誘導內質網應激，并構成顯著的促凋亡信號。此外，Ca2+也是細胞凋亡和自噬的刺激因子［12-13］。Rosen 等［14］發(fā)現，Ca2+的內流或存儲釋放激活了PC12細胞和初級皮質神經元中的Ras蛋白。接下來Ca2+/鈣調蛋白依賴的Ras 蛋白特異性鳥嘌呤核苷酸釋放因子 1（Ras-GRF1）的發(fā)現直接證實了Ca2+調節(jié)Ras 活性［15］，而在Erk 通路中，Ras 作為上游激活蛋白，Raf 作為MAPK 之一，MAPK/Erk 激酶（MEK）作為絲裂原活化蛋白激酶-激酶（MAPKK），形成Ras-Raf-MEK-Erk通路［16］。Erk1/2屬于MAPK家族，在信號級聯中發(fā)揮作用，并將細胞外信號傳遞到細胞內靶點。Erk級聯是高度調控的級聯，負責基本的細胞過程，包括細胞增殖和分化。這些調節(jié)因素影響雙特異性磷酸酶［17］、支架蛋白［18］、信號持續(xù)時間和強度［19］以及級聯成分的動態(tài)亞細胞定位［20］。Erk 通路上游蛋白和激酶的過度激活已被證明可誘導各種疾病，包括癌癥、炎癥、發(fā)育障礙和神經障礙［21］。正常情況下，磷酸化的Erk1/2在腦內主要分布于神經纖維，可能參與調節(jié)神經元突起的發(fā)生，延長和穩(wěn)定突觸的形成［22］。在病理情況下，Erk1/2信號通路廣泛參與腦血管病、腦損傷、AD等多種神經系統疾病的發(fā)生及發(fā)展過程。Erk1/2 信號通路的持續(xù)性激活會啟動凋亡級聯反應，激活下游的Caspase-3，最終導致神經元凋亡。Caspase-3是一切細胞凋亡信號傳導的共同通路，能夠接受上游信號，自身被激活后作用于特異性底物使細胞凋亡，在凋亡級聯反應中起關鍵作用。據估計，神經系統發(fā)育過程中產生的原始細胞群有一半通過細胞凋亡的方式被清除，如此便可以優(yōu)化突觸連接［23］。在發(fā)育中的神經系統中，凋亡在神經管形成的早期被觀察到，并在涉及神經元、膠質細胞和神經祖細胞的神經網絡的最終分化過程中持續(xù)存在。Kuida 等［24］通過基因工程的方法生成了Caspase-3缺陷小鼠，該小鼠Caspase-3 的缺陷導致了其神經系統凋亡的重要缺陷，在胚胎發(fā)育期間或在1 至3 周齡期間就因為腦細胞數量增多引起的腦畸變而死亡。此實驗證明了Caspase-3依賴性細胞凋亡在神經系統發(fā)育中起重要作用。研究［25］表明，早老素（PS1 和PS2 與早發(fā)性家族性AD 有關）在細胞凋亡過程中被Caspase-3 裂解，Caspase-3 也能在體外裂解純化的PS。Louneva 等［26］發(fā)現在對照組和AD病例中，Caspase-3在突觸后選擇性富集。此外，與同年齡的對照組相比，AD 患者突觸內pro Caspase-3 和激活的Caspase-3 表達水平顯著增加，表明活躍的Caspase-3可能導致進行性突觸變性并最終導致突觸喪失，這是AD認知能力下降的最佳病理關聯［27］。

本研究顯示，運用網絡藥理學的手段對Pue 治療AD 的潛在靶點與分子機制進行預測，能夠讓實驗者在實驗設計中把握主要方向，縮小研究目標，其重要作用不言而喻，在整個實驗研究中的優(yōu)先級更在預實驗之前。同時本研究也提示Pue 治療AD 具有多通路、多靶點同時作用的特點，預測到的分子機制也為后續(xù)開展Pue的基礎藥理學研究提供了方向。