張波濤 王雅蓉 張婷 李璐

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（銀川 750004）；2寧夏武警醫(yī)院（銀川 750004）

肺動脈高壓（PAH）是以肺動脈重構(gòu)為特征的難治性心肺血管惡性疾病，引起肺部血管阻力和肺動脈的壓升高，最終導(dǎo)致右心室肥大、右心室功能衰竭和死亡［1-3］。PAH 病理生理學(xué)特征主要是急性肺血管收縮和慢性肺血管器質(zhì)性重構(gòu)。目前，治療PAH 藥物最常用的是前列腺醇、西地那非及波生坦［4］。尋找新的阻斷或逆轉(zhuǎn)心肺血管重構(gòu)的藥物新靶點是目前臨床研究的熱點。野百合堿（MCT）是從野百合種子中提取，可誘導(dǎo)大鼠患上肺動脈高壓，通過給大鼠皮下注射MCT，3 周后即可產(chǎn)生與臨床PAH 患者相似的血流動力學(xué)以及病理學(xué)特征［5］。采用MCT 制造大鼠PAH 已成為研究PAH 的最常用動物模型，其有利于開展相關(guān)藥物對PAH 的藥效評價和作用機(jī)制研究。甜菜堿是一種季銨型生物堿，由寧夏中藥材枸杞中提取分離制得，其具有保護(hù)肝功能、緩解應(yīng)激反應(yīng)、抑制急性心臟損傷等諸多作用。SONG 等［5］在PAH動物模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，RhoA 蛋白在細(xì)胞遷移、黏附、凋亡和基因表達(dá)中具有重要作用，RhoA 通過與其下游的效應(yīng)物ROCK 相互作用，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+、肺部血管重構(gòu)、肺血管收縮和炎癥反應(yīng)等病理生理過程。甜菜堿可有效改善肺動脈高壓患者預(yù)后，可能與降低NF-κB、TNF-α 以及IL-1β 的蛋白表達(dá)水平有關(guān)［6］。本研究旨在探討甜菜堿對MCT 誘導(dǎo)的大鼠PAH 與RhoA/ROCK 通路蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物選取清潔級成年雄性SD 大鼠（8～10 周齡），由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物編號：SCXK（寧）2020-0001，倫理學(xué)批件（編號：2019-436）

1.1.2 主要實驗材料甜菜堿（分析純度> 98.0%）采購于Singm-Aldrich 公司，分別稱取400、800 和1 600 mg 甜菜堿，溶解在40 mL 0.9%氯化鈉注射液中，放置于4 ℃儲存?zhèn)溆?；MCT（純度> 99.0%）采購于Singm-Aldrich 公司，稱取MCT 0.2 g，放置在燒瓶中。加入1 mol/L HCl 溶液中，直到MCT 在溶液中溶解，然后逐滴添加在NaOH 溶液中，pH調(diào)節(jié)至約7.4，最終使用雙蒸餾水稀釋成10.0 mL備用。

RhoA、ROCK1、ROCK2 的一抗體采購于Abcam生物技術(shù)公司（美國加利福尼亞州）；β-actin 采購于Proteintech 公司（美國芝加哥）；全蛋白提取和蛋白定量試劑盒均采購于凱基生物科技有限公司；山羊抗兔二抗和β-actin 二抗采購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司。細(xì)胞超聲粉碎機(jī)（TY96-ⅡN 型）（寧波新芝生物科技有限公司）；PowerPac Basic電泳儀（BIO-RAD 公司）；Mutiskan Go 酶標(biāo)儀（Thermo Fisher 公司）；凝膠成像分析儀（培清JS-860B，上海培清科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理將72 只清潔級成年雄性SD 大鼠隨機(jī)分成為6 組（每組12 只）：空白對照組、MCT組、甜菜堿組（100、200和400 mg/kg）、西地那非（30 mg/kg）組。處理：在SD 大鼠腹部皮下注射MCT（50 mg/kg）連續(xù)21 d，待構(gòu)建大鼠PAH模型成功后，正常對照組和MCT 組給予相應(yīng)體積的生理鹽水灌胃，其他各實驗組分別繼續(xù)灌胃甜菜堿（100、200、400 mg/kg）或西地那非（30 mg/kg）20 d。實驗終點是第41 天，各組大鼠采用烏拉坦（100 mg/kg）麻醉后固定，進(jìn)行有創(chuàng)血流動力學(xué)、臟器指數(shù)檢測。

1.2.2 血流動力學(xué)指標(biāo)的測定各組大鼠末次用藥后均禁食不禁水24 h，稱體重后使用20%烏拉坦（6 mL/kg，ip）麻醉固定，暴露大鼠右側(cè)頸部，局部備皮后切開皮膚，分離其右側(cè)頸外靜脈周圍的肌肉、神經(jīng)，剝離出血管，埋線結(jié)扎血管的遠(yuǎn)心端，用顯微剪剪一“v”字型切口。使用聚乙烯導(dǎo)管（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，中國北京）插入SD大鼠右頸外靜脈中，依次通過右心房和右心室，導(dǎo)管遠(yuǎn)端與壓力傳感器（Alcott Biotech，中國上海）相連接，用于測量右心室收縮壓（RVSP），測量時間為2 min。最終將導(dǎo)管置于肺動脈中，監(jiān)測記錄平均肺動脈壓（mPAP）。血流動力學(xué)評估結(jié)束，使用頸椎脫位法處死大鼠。然后將其腹腔剖開，切開膈肌暴露其胸腔，切斷肋骨后可見肺和心臟，切除其整個肺和心臟組織。摘取SD 大鼠心臟、肺和肝臟，首先使用生理鹽水清洗余血，再用濾紙吸干多余的液體吸，遂即進(jìn)行稱重后與大鼠的體重進(jìn)行對比得到臟器指數(shù)。為進(jìn)一步觀察右心室肥厚情況，首先需沿心耳下緣將整個心室從心臟上剪下，然后再沿心室間隔的邊緣剪下右心室，依次稱取右心室（right ventricle，RV）重量和左心室加室間隔［LV （left ventricle） + S （septum）］重量，計算得出右室肥厚指數(shù)RVHI=RV/（LV+S）。最后將右心室和肺組織冷凍在液氮中保存進(jìn)行Western blot 分析。

1.2.3 Western blot 檢測取約50 mg 經(jīng)液氮研磨的右心室或肺組織，將其加入至冷裂解緩沖液0.3 mL 中，在冰浴下使用超聲破碎細(xì)胞。然后在4 ℃，10 000 r/min 離心20 min，分別取右心室、肺組織上清液用BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒進(jìn)行蛋白定量，剩余的上清液加入上樣緩沖液后在100 ℃水浴10 min，置于-20 ℃保存。取蛋白樣本60 μg 上樣，12% SDS-PAGE 凝膠電泳（80 V/120 V 電壓），200 mA 恒定電流轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），在室溫下用封閉PBST（PBS含有0.1%吐溫-20）緩沖液封閉膜2 h，然后需在4 ℃下培養(yǎng)過夜。首先分別使用抗Rho A（1 μg/mL）、抗ROCK1（1∶2 000）、抗ROCK2（1 μg/mL）及抗β-actin抗體（內(nèi)參，1∶1 000）在4 ℃孵育過夜。然后分別加入山羊抗兔IgG二抗（偶聯(lián)有HRP，1∶3 000）常溫孵育2 h，加入超級化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液后曝光膠片。采用Quantity-one軟件分析膠片掃描結(jié)果，將得到的目的條帶的光密度值與其相對應(yīng)的內(nèi)參β-actin 的光密度值相對比以校正誤差，所得出的比值則代表該目的蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗結(jié)果以SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件包進(jìn)行分析，以（±s）表示計量數(shù)據(jù)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甜菜堿抑制MCT 誘導(dǎo)大鼠PAH 和右心室肥大通過檢測大鼠mPAP、RVSP 和RVHI 評估甜菜堿對MCT 誘導(dǎo)大鼠的肺和心臟損傷。與對照組相比，MCT 組大鼠在21 d 內(nèi)持續(xù)出現(xiàn)顯著PAH（P<0.01）。甜菜堿（400 mg/kg）組大鼠的mPAP 顯著低于MCT 組（P< 0.05）。MCT 組大鼠由于肺動脈壓升高，故RVSP 明顯升高。甜菜堿（400 mg/kg）組與西地那非組均可降低PAH 大鼠RVSP（P< 0.05和P< 0.01）。甜菜堿（400 mg/kg）組降低了PAH 大鼠RVHI（P< 0.05），與西地那非降低了PAH 大鼠RVHI 相仿（P< 0.01）。上述結(jié)果表明甜菜堿可以保護(hù)MCT 誘導(dǎo)的PAH 大鼠的肺和心臟，見表1。

表1 MCT 對PAH 大鼠mPAP、RVSP 和RVHI 的影響Tab.1 Effects of MCT on mPAP，RVSP and RVHI in PAH rats ±s

表1 MCT 對PAH 大鼠mPAP、RVSP 和RVHI 的影響Tab.1 Effects of MCT on mPAP，RVSP and RVHI in PAH rats ±s

注：與空白組比較，##P < 0.01；與MCT組比較，*P<0.05，**P < 0.01

組別空白組MCT組西地那非組甜菜堿組（100 mg/kg）甜菜堿組（200 mg/kg）甜菜堿組（400 mg/kg）HR（次/min）353.67±14.32 404.5±14.56 357.75±13.57 399.67±12.57 396.42±13.58 369.58±18.99 mPAP(mmHg)20.53±0.79 52.72±2.06##31.82±1.72**50.96±4.15 50.42±1.56 41.25±2.43*RVSP(mmHg)32.43±2.35 96.79±2.15##71.54±2.67**97.90±1.73 95.25±1.61 71.78±1.68**RVHI 0.31±0.02 0.72±0.03##0.50±0.03**0.71±0.03 0.70±0.04 0.53±0.03**

2.2 甜菜堿抑制MCT 誘導(dǎo)PAH 大鼠肺和右心室組織RhoA/ROCK的表達(dá)通過Western blot分析，進(jìn)一步檢測了甜菜堿對MCT 誘導(dǎo)PAH 大鼠的肺組織和右心室組織RhoA、ROCK1 和ROCK2 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，MCT 組中肺組織和右心室組織RhoA、ROCK1 和ROCK2 蛋白表達(dá)上調(diào)，但西地那非（50 mg/kg）組和甜菜堿（400 mg/kg）組顯著降低了RhoA、ROCK1 和ROCK2 蛋白表達(dá)（P< 0.05）。見表2、圖1 和表3、圖2。

圖1 MCT 誘導(dǎo)PAH 大鼠的肺組織RhoA/ROCK 表達(dá)（n=8）Fig.1 MCT-induced RhoA/ROCK expression in lung tissue of PAH rats（n=8）

圖2 MCT 誘導(dǎo)PAH 大鼠心臟組織RhoA/ROCK 表達(dá)（n=8）Fig.2 Effect of RhoA/ROCK in MCT-induced PAH rat heart tissue（n=8）

表2 MCT 誘導(dǎo)PAH 大鼠肺組織RhoA/ROCK 的影響Tab.2 Effect of RhoA/ROCK in lung tissue of MCT-induced PAH rats ±s

表2 MCT 誘導(dǎo)PAH 大鼠肺組織RhoA/ROCK 的影響Tab.2 Effect of RhoA/ROCK in lung tissue of MCT-induced PAH rats ±s

注：與空白組比較，##P<0.01；與MCT組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白組MCT組西地那非組甜菜堿組（400 mg/kg）RoCK2 0.79±0.05 1.29±0.05##0.80±0.02**0.82±0.03*RhoA 0.61±0.06 1.42±0.05##0.76±0.05**0.88±0.06**RoCK1 0.72±0.05 1.05±0.07##0.8±0.02*0.81±0.05*

表3 MCT 誘導(dǎo)PAH 大鼠心臟組織RhoA/ROCK 的影響Tab.3 Effect of RhoA/ROCK in MCT-induced PAH rat heart tissue ±s

表3 MCT 誘導(dǎo)PAH 大鼠心臟組織RhoA/ROCK 的影響Tab.3 Effect of RhoA/ROCK in MCT-induced PAH rat heart tissue ±s

注：與空白組比較，##P < 0.01；與MCT組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

組別空白組MCT組西地那非組甜菜堿組（400 mg/kg）RoCK2 0.71±0.04 1.12±0.03##0.83±0.03**0.87±0.05*RhoA 0.65±0.03 1.16±0.11##0.71±0.02**0.70±0.02**RoCK1 0.67±0.05 0.94±0.07##0.69±0.02**0.79±0.02*

3 討論

本實驗提示甜菜堿對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓產(chǎn)生治療效果。結(jié)果表明，西地那非組和甜菜堿（400 mg/kg）組治療前后大鼠mPAP、RVSP和RVHI 均明顯減低，提示甜菜堿可減緩PAH 大鼠的肺動脈高壓以及其右心室擴(kuò)大的進(jìn)展。同時，Western blot 檢測結(jié)果表明給藥甜菜堿抑制了PAH 大鼠心肺組織中RhoA，ROCK1和ROCK2的表達(dá)。綜上所述，甜菜堿可能通過下調(diào)RhoA、ROCK1和ROCK2 蛋白表達(dá)，對MCT 所致PAH 大鼠起到顯著療效。

PAH 作為一種進(jìn)行性疾病，其病理生理學(xué)特征包括肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖、凋亡抵抗和肺血管重構(gòu)，最終導(dǎo)致右心衰竭［7-9］。西地那非作為治療PAH 的常用藥物，已被美國食品藥物管理局及臨床廣泛認(rèn)可，故本研究選擇西地那非為陽性藥物。YADAV 等［10］研究表明，西地那非可有效減緩PAH 大鼠肺動脈高壓，與本研究中結(jié)果一致，常用與構(gòu)建動物PAH 模型主要以下幾種方式：野百合堿誘導(dǎo)模型、肺栓塞型、低氧誘導(dǎo)模型、遺傳修飾模型和手術(shù)分流模型等［11］。野百合堿作為一種雙吡咯類生物堿，其在動物肝臟內(nèi)的氧化代謝產(chǎn)物，可選擇性地?fù)p傷肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞，使細(xì)胞間隙增大，引起血小板源性生長因子等大量釋放，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，進(jìn)而引起肺中小動脈重構(gòu)、狹窄、甚至閉塞，最終導(dǎo)致PAH。給SD大鼠注射野百合堿構(gòu)建PAH模型最為常見［12-14］。在本實驗中MCT 組的大鼠出現(xiàn)了血流動力學(xué)和右心功能的異常：血流動力學(xué)參數(shù)mPAP 和RVSP顯著升高，RVHI 顯著升高［15-16］，這與HUMBERT等［17-18］的報道一致，表明構(gòu)建PAH 大鼠模型成功。大量研究示人類PAH 的特征在于肺血流動力學(xué)異常，包括mPAP，RVHI 和RVSP 的異常升高。同樣在動物PAH 模型中，mPAP、RVHI 和RVSP 的類似變化通常被認(rèn)為是PAH 發(fā)生發(fā)展的證據(jù)。因此，本研究通過檢驗用藥前后血流動力學(xué)指標(biāo)和RVHI 的變化得出甜菜堿（400 mg/kg）對PAH 大鼠的治療作用。

MONTAGNOLI 等［19-20］研究RhoA/ROCK 信號傳導(dǎo)通路作為人體細(xì)胞常見的信號傳導(dǎo)通路，過度激活對PAH 的形成產(chǎn)生重要作用。RhoA 是一類具有GTP 酶活性的小分子，在心、腦、肺、平滑肌等組織中均廣泛的存在，其作用機(jī)制包括炎性因子產(chǎn)生，細(xì)胞遷移和凋亡，平滑肌細(xì)胞增殖等［21-22］。KIM 等［23］研究表明，RhoA 之所以可以發(fā)揮上述生物效應(yīng)，主要通過調(diào)節(jié)其下游靶蛋白ROCK。ROCK 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分為ROCK1和ROCK2 兩種同種型，兩者具有高度同源性，常通過caspase-3 介導(dǎo)途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡。越來越多的研究［24-25］表明ROCK 抑制劑、西地那非和辛伐他汀都對PAH 有治療作用，可以使ROCK 的表達(dá)恢復(fù)到正常水平。在本實驗中，與空白組相比，MCT 組RhoA，ROCK1 和ROCK2 的表達(dá)水平顯著升高，提示RhoA/ROCK 信號通路的異常激活在PAH 模型中起到了至關(guān)重要的作用，與文獻(xiàn)［26］報道一致，因此抑制 RhoA/ROCK 信號通路的活化對于治療PAH 具有重要作用。西地那非組和甜菜堿組均抑制了PAH大鼠RhoA，ROCK1和ROCK2的表達(dá)。

因此，本研究推測甜菜堿對MCT 所致PAH 大鼠保護(hù)作用可能與RhoA/ROCK 信號通路有關(guān)，未來將進(jìn)一步行相關(guān)實驗研究明確其分子機(jī)制。