張存金,潘 龍,2*,韓金洋,宋登科,劉瑩瑩,蔡 婷,廖愛美,侯銀臣,宇光海,惠 明,黃繼紅,4,5*

1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 小麥生物加工與營養(yǎng)功能河南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 鄭州 450001

2.河南金丹乳酸科技股份有限公司 , 河南 周口 477150

3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院, 河南 鄭州 450046

4.河南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 河南 開封 475001

5.許昌學(xué)院 食品與藥學(xué)院, 河南 許昌 461000

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一種由L-賴氨酸單體在合成酶催化作用下通過 α-COOH 和 ε-NH2脫水縮合連接而成的同型氨基酸聚合物,分子質(zhì)量為 3 200～4 500 Da[1],結(jié)構(gòu)式如圖1所示。這種具有25～35個(gè)單體的聚合物是在小白鏈霉菌Streptomycesalbulus346發(fā)酵液中分離得到的[2]。ε-PL主鏈上的游離氨基使其在酸性和弱堿性環(huán)境中表現(xiàn)出陽離子特性,因此能夠與細(xì)胞膜表面的陰離子結(jié)合從而破壞微生物的細(xì)胞膜[3-4]。這一特性使ε-PL在抑制革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌、真菌以及酵母的生長方面表現(xiàn)出特有的優(yōu)勢(shì)[5-7]。因此,2014年,繼日本、韓國和美國之后,我國正式批準(zhǔn)ε-PL用于淀粉制品、烘焙食品、肉制品、調(diào)味品和飲料等的防腐與保鮮,成為我國批準(zhǔn)的第3種微生物來源天然食品防腐劑[8-9]。

圖1 ε-聚賴氨酸的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of ε-PL

目前國內(nèi)對(duì)ε-PL的研究無論是在誘變育種還是發(fā)酵工藝優(yōu)化方面都有大量的報(bào)道[10-11],但有關(guān)發(fā)酵液中ε-PL定量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道較少?，F(xiàn)有的發(fā)酵液中ε-PL含量的檢測(cè)方法有HPLC法[12-13]、擴(kuò)散圈法[14]、熒光淬滅法[15]以及Itzhaki[16]使用的方法等。其中,HPLC法對(duì)ε-PL純度要求較高,若將未經(jīng)處理的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC法檢測(cè)將極大地降低色譜柱的使用壽命;擴(kuò)散圈法誤差較大,測(cè)量不準(zhǔn)確;熒光淬滅法中用到的指示劑異硫氰酸酯具有強(qiáng)烈刺激性,不適用于在常規(guī)環(huán)境下檢測(cè);目前通用的是Itzhaki[16]使用的方法,雖然在很大程度上縮短了ε-PL的檢測(cè)時(shí)間,但操作依然復(fù)雜,因此還需要探索新的ε-PL檢測(cè)方法。

據(jù)報(bào)道,ε-PL的側(cè)鏈含有大量的氨基陽離子[17-18],而臺(tái)盼藍(lán)含有磺酸基陰離子[19],根據(jù)ε-PL與甲基橙的沉淀原理,發(fā)現(xiàn)ε-PL與臺(tái)盼藍(lán)在pH值4～10的范圍內(nèi)同樣能夠形成復(fù)合物而沉淀,離心后上清液在600 nm處其吸光度與ε-PL濃度存在良好的線性關(guān)系;培養(yǎng)基中的成分不干擾ε-PL的測(cè)定。根據(jù)這個(gè)原理作者建立了一種準(zhǔn)確、簡便、靈敏的發(fā)酵液中ε-PL的酶標(biāo)儀檢測(cè)方法,為進(jìn)一步研究ε-PL奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與菌種

ε-PL標(biāo)品(純度99%):鄭州拜納佛生物工程股份有限公司;葡萄糖、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、磷酸氫二鉀:均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;磷酸二氫鉀:洛陽市化工試劑廠;蛋白胨、酵母提取物:生化試劑,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;(NH4)2SO4:天津市大茂化學(xué)試劑廠;Na2HPO4·12 H2O、NaH2PO4·2 H2O:洛陽市化學(xué)試劑有限公司;水為去離子水;臺(tái)盼藍(lán):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

菌種:白色鏈霉菌IFO 14147(CICC ?11022),中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器

T2S紫外-可見光分光光度計(jì):上海精科實(shí)業(yè)有限公司;EPOCH多功能酶標(biāo)儀:美國Biotek有限公司;HTS-W50搖床:常州英德生物科技有限公司;FE20KpH計(jì):特勒托利多(中國)有限公司;5910 Ri離心機(jī):德國艾本德股份公司;MANDELA多功能誘變儀:北京韋恩斯技術(shù)有限公司;GZX光照培養(yǎng)箱:上海比朗儀器制造有限公司;ME104E/02電子天平:上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

ε-PL溶液:配制2 g/L的ε-PL母液,分別用蒸餾水稀釋成10、20、40、60、80、100 mg/L的ε-PL系列質(zhì)量濃度溶液。

臺(tái)盼藍(lán)試劑:分別稱取臺(tái)盼藍(lán)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g,溶于50 mL去離子水中,加去離子水定容至100 mL,配制成1、2、3、4、5 g/L臺(tái)盼藍(lán)試劑,完全溶解后于棕色試劑瓶中密封保存。

PBS溶液:用1.0 mmol/L磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀溶液分別配制不同pH值(4、6、8、10)的緩沖液。

1.3.2 臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)定ε-PL產(chǎn)量

標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法:分別量取ε-PL系列濃度溶液0.25 mL置于1.5 mL離心管中,加入PBS緩沖液0.7 mL,再加入臺(tái)盼藍(lán)試劑0.03 mL,置于50 ℃,200 r/min 搖床中反應(yīng)30 min,12 000 r/min 離心3 min后,吸取200 μL于96孔板中。以PBS溶液為空白參比,測(cè)定樣品在600 nm處的吸光度(A600)。

發(fā)酵液中ε-PL含量的測(cè)定:取發(fā)酵液2 mL,12 000 r/min離心3 min。取上清液0.5 mL用蒸餾水稀釋20倍,取稀釋液0.25 mL置于1.5 mL離心管中,按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。以未接種發(fā)酵液為空白參照,于600 nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中ε-PL的含量。

1.3.3 檢測(cè)方法的優(yōu)化

考察顯色劑濃度、pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,其中臺(tái)盼藍(lán)試劑質(zhì)量濃度設(shè)置為1、2、3、4、5 g/L,反應(yīng)pH 4、6、8、10,反應(yīng)溫度30、40、50、60、70 ℃,反應(yīng)時(shí)間20、30、40、50、60 min。

1.3.4 甲基橙法測(cè)定ε-PL產(chǎn)量

參照Itzhaki等[16]的測(cè)定方法。用PBS緩沖液將發(fā)酵上清液適當(dāng)稀釋后與甲基橙溶液進(jìn)行反應(yīng),30 ℃條件下振蕩反應(yīng)30 min,然后200 r/min離心15 min。上清液經(jīng)PBS緩沖溶液稀釋20倍后,在465 nm處測(cè)定其吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用 Excel 2010 整理數(shù)據(jù),采用SPSS 20分析顯著性(P<0. 05),采用 Origin 2018制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件確定

2.1.1 檢測(cè)波長

以去離子水為對(duì)照,掃描100 mg/L ε-PL與臺(tái)盼藍(lán)反應(yīng)液在400～700 nm處的吸收光譜,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,反應(yīng)液在600 nm波長處有最大吸收峰。

圖2 反應(yīng)液吸收光譜Fig.2 Absorption spectrum of reaction solution

2.1.2 顯色劑質(zhì)量濃度

以PBS溶液為空白參比,測(cè)定樣品吸光度A600,結(jié)果見表1。由表1可知,當(dāng)臺(tái)盼藍(lán)試劑質(zhì)量濃度高于3 g/L時(shí),10～20 mg/L ε-PL樣品池中讀數(shù)超出酶標(biāo)儀檢測(cè)限,當(dāng)質(zhì)量濃度低于3 g/L時(shí),R2較低,最終選擇3 g/L為顯色劑的最適質(zhì)量濃度。

表1 不同顯色劑質(zhì)量濃度下的吸光度Table 1 Absorbance at different chromogenic concentrations

2.1.3 pH值

測(cè)定不同緩沖液pH值(4、6、8、10)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,以PBS溶液為空白對(duì)照,測(cè)定樣品在600 nm處的吸光度,結(jié)果見表2。由表2可知,當(dāng)緩沖液pH值為6時(shí),R2最高。因此,選擇緩沖液pH值為6。

表2 不同pH值條件下的吸光度Table 2 Absorbance under different pH conditions

2.1.4 反應(yīng)溫度和加熱時(shí)間

以PBS溶液為空白參比,測(cè)定樣品的吸光度,由圖3(a)可知,當(dāng)溫度超過50 ℃后,吸光度幾乎不再發(fā)生變化。因此,選用反應(yīng)溫度為50 ℃。由圖3(b)可知,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,吸光度在40 min后趨于穩(wěn)定。因此,選擇加熱時(shí)間為40 min。

圖3 溫度與時(shí)間對(duì)反應(yīng)液吸光度的影響Fig.3 Effects of different temperature and time on the absorbance of the reaction solution

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

在優(yōu)化的條件下進(jìn)行ε-PL標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定,按1.3.1中的方法,以PBS溶液為空白參比,測(cè)定樣品的吸光度。制作ε-PL的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示,回歸方程為Y=-0.012 8X+3.148 8,R2=0.999 8。由圖4可知,ε-PL在10～100 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖4 臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)法測(cè)定ε-PL標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 ε -PL standard curve determined by trypan blue detection

2.3 不同因素對(duì)檢測(cè)方法的影響

2.3.1 顯色穩(wěn)定性研究

取不同濃度的ε-PL溶液,與顯色劑進(jìn)行反應(yīng)后在不同時(shí)間內(nèi)測(cè)定600 nm處的吸光度,發(fā)現(xiàn)溶液在顯色完成后12 h內(nèi)的吸光度基本不變,表明此方法有良好的顯色穩(wěn)定性。

2.3.2 培養(yǎng)基成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

取未接種的培養(yǎng)基,12 000 r/min離心 3 min。按1.3.2中的方法,以水為空白對(duì)照測(cè)定吸光度,培養(yǎng)基的A600為0,表明培養(yǎng)基中的底物和雜質(zhì)不影響該方法的測(cè)定。

2.4 靈敏度試驗(yàn)

通過11次空白測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立,分別獲得響應(yīng)值偏差(δ)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(S),計(jì)算試驗(yàn)最低檢測(cè)限(LOD)和最低定量限(LOQ):

LOD=3.3δ/S, LOQ=10δ/S。

計(jì)算得到LOD為2.03 mg/L,LOQ為6.14 mg/L。

2.5 精密度試驗(yàn)

將ε-PL標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至10、50、100 mg/L后,按1.3.2中方法測(cè)定。連續(xù)6次測(cè)定結(jié)果顯示,該方法的測(cè)量結(jié)果相對(duì)變異系數(shù)(CV)分別為1.65%、1.94%、1.91%,說明該方法的精密度較高。

2.6 回收率試驗(yàn)

取發(fā)酵液按不同質(zhì)量濃度的量精確加入ε-PL,按1.3.2中方法對(duì)加標(biāo)后樣品進(jìn)行檢測(cè)(n=6),由表3可知,ε-PL的回收率分別為101.53%、99.55%和98.96%。表明應(yīng)用此方法測(cè)定發(fā)酵液中ε-PL產(chǎn)量準(zhǔn)確度較高。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of recovery rate

2.7 與甲基橙法測(cè)定結(jié)果比較

為了研究臺(tái)盼藍(lán)法和甲基橙法測(cè)定ε-PL產(chǎn)量的相關(guān)性,隨機(jī)選取96個(gè)發(fā)酵樣品分別用臺(tái)盼藍(lán)法和甲基橙法測(cè)定ε-PL產(chǎn)量。由圖5可知,兩種方法檢測(cè)結(jié)果R為0.934 59,呈高度相關(guān)性。此外,相較于甲基橙法,臺(tái)盼藍(lán)法所需檢測(cè)時(shí)間更短。通過試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),甲基橙法檢測(cè)96個(gè)樣品所需時(shí)間約為90 min,而臺(tái)盼藍(lán)法的檢測(cè)時(shí)間為55 min,縮短了38.9%。表明臺(tái)盼藍(lán)法不僅能夠保障檢測(cè)的準(zhǔn)確性,還可以有效縮短檢測(cè)時(shí)間,可替代甲基橙法快速測(cè)定ε-PL的產(chǎn)量。

圖5 臺(tái)盼藍(lán)法和甲基橙法測(cè)定ε-PL產(chǎn)量的相關(guān)性Fig.5 Relevance between ε-PL yield by trypan blue and methyl orange

2.8 在ε-PL高產(chǎn)菌株篩選中的應(yīng)用

將建立的臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)法應(yīng)用到ε-PL高產(chǎn)菌株的篩選工作中,對(duì)出發(fā)菌株白色鏈霉菌孢子進(jìn)行ARTP誘變后,選擇了365株菌進(jìn)行多孔板發(fā)酵,結(jié)果見圖6。相比于出發(fā)菌株1.2 g/L的ε-PL產(chǎn)量,正突變菌株達(dá)到121株,正突變率為33.15%,其中最高產(chǎn)量達(dá)1.884 g/L,相比于出發(fā)菌株提高了57.0%。結(jié)果表明,建立的臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)法結(jié)合高通量篩選技術(shù)可以有效提高高產(chǎn)菌株誘變篩選的工作效率。

圖6 ε-PL高產(chǎn)菌株篩選Fig.6 Screening for ε-PL high-yielding strain

3 結(jié)論

本研究建立了以臺(tái)盼藍(lán)為顯色劑的高通量檢測(cè)方法測(cè)定發(fā)酵液中ε-PL的產(chǎn)量。研究結(jié)果表明,當(dāng)發(fā)酵液中ε-PL質(zhì)量濃度稀釋至10～100 mg/L范圍時(shí),具有良好的線性關(guān)系,R2=0.999 8。在與甲基橙法測(cè)定對(duì)比后,檢測(cè)時(shí)間減少38.9%,而且本方法不受發(fā)酵液中其他培養(yǎng)基成分的影響。將此方法應(yīng)用到高產(chǎn)ε-PL的菌種篩選中,實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵液中ε-PL的高通量快速測(cè)定,對(duì)未來ε-PL高產(chǎn)菌株的選育和研究具有重要的意義。