索志光,王琪璇,呂澤平,衛(wèi) 敏

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院, 河南 鄭州 450001

赭曲霉毒素是由赭曲霉、純綠青霉以及疣孢青霉等產(chǎn)生的真菌毒素[1-2],其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的污染范圍最廣、毒性最強(qiáng)。赭曲霉毒素A不僅可以污染小麥、高粱、玉米等多種糧食[3-4],還可以污染肉類、葡萄酒、啤酒等工業(yè)化的食品[5-6]。此外,赭曲霉毒素A具有較強(qiáng)的腎毒性、肝毒性、免疫毒性和致畸作用[7],被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2B類潛在致癌物[8],對人類和動物的健康存在嚴(yán)重威脅。

目前,用于檢測OTA的傳統(tǒng)方法,多需要復(fù)雜的大型設(shè)備和專業(yè)的檢測人員,只適用于實(shí)驗(yàn)室分析,不便于現(xiàn)場檢測。然而,在糧食和食品實(shí)際生產(chǎn)和儲存過程中的不同階段,可能都需要對其中的污染物進(jìn)行檢測。因此,需要開發(fā)更加簡單、便捷的方法來滿足實(shí)際需求。便攜式快速檢測裝置被認(rèn)為是解決這一問題的有效方法,它可以滿足就地實(shí)時檢測的要求,降低分析成本,具有較大的應(yīng)用潛力。紙張價格低廉、易于購買、易于保存、還具有良好的生物相容性和生物降解性,是便攜式傳感設(shè)備的最佳傳感基質(zhì)[9-11]。采用紙張作為基底的紙基分析方法,是一種很有前景的檢測方法。

核酸適配體是基于指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)從隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選獲得的對靶物質(zhì)具有高特異性和高親和力的寡核苷酸序列[12]。核酸適配體具有合成方便、重復(fù)性好、易于儲存等優(yōu)點(diǎn)[13],而且它的靶標(biāo)廣泛,包括蛋白質(zhì)、RNA、毒素、農(nóng)藥等多種物質(zhì)[14-15]。目前,可以特異性選擇OTA的適配體已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[16],研究人員開發(fā)了多種基于OTA適配體的生物傳感器。在各種傳感器中,熒光適配體傳感器因其響應(yīng)速度快、成本低、操作簡單、靈敏度高、選擇性好而備受關(guān)注[17]。因此,將紙基分析方法與熒光檢測技術(shù)結(jié)合,在實(shí)際應(yīng)用方面具有較大的潛力。

基于上述研究,本試驗(yàn)以紙張作為傳感器的基底,使用可以特異性識別OTA的核酸適配體,以及羧基熒光素(FAM)與黑洞猝滅基團(tuán)(BHQ1)之間的FRET作用,構(gòu)建了簡單、低成本的紙基熒光生物傳感器,實(shí)現(xiàn)對食品中OTA的現(xiàn)場檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核酸序列(表1):生工生物工程(上海)股份有限公司;赭曲霉毒素A:Sigma-Aldrich公司;Whatman 1級色譜紙:通用電氣英國醫(yī)療保健有限公司;米粉、綠豆餅:當(dāng)?shù)爻?三(羥甲基)氨基甲烷(Tirs):上海麥克林生化科技有限公司;氯化鈉(NaCl)和鹽酸(HCl):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA):洛陽化學(xué)試劑廠;鏈霉親和素(SA):Solarbio公司。本試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

表1 DNA序列Table 1 DNA sequences

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent Cary Eclipse EL06053220型熒光光譜儀:美國瓦里安公司;HC-2066型高速離心機(jī):安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;MX-S型渦旋振蕩器:北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ULUP-Ⅱ-10T超純水機(jī):西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司。NUPACK軟件(http://www.nupack.org/partition/new)。

1.3 試驗(yàn)方法

參考He等[18]的方法,對紙基傳感器的制備進(jìn)行了改進(jìn),具體制備過程如下。

1.3.1 檢測孔的制備

使用打孔器在Whatman 1級色譜紙上打出直徑為6 mm的圓形檢測孔,該檢測孔帶有長1.5 cm、寬2 mm的莖。莖與檢測孔連接處使用馬克筆將其雙面涂黑,放置于陰涼干燥處,等待油墨完全干透后,檢測孔制備完成。

1.3.2 紙基生物傳感器的制備

將5 μL 1 mg/mL的SA溶液滴入檢測孔,孵育30 min,使SA在紙基表面均勻包被。使用Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液洗滌后,將4 μL 10 μmol/L帶有生物素標(biāo)記的Apt-FAM滴加在檢測孔中,孵育30 min,Apt-FAM被固定在檢測孔上。用Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液洗滌后,傳感器制備完成。上述過程均在黑暗環(huán)境下進(jìn)行。

1.3.3 OTA的檢測

2.1 術(shù)后病理結(jié)果 手術(shù)病理結(jié)果顯示，176例甲狀腺結(jié)節(jié)中，惡性結(jié)節(jié)48例，其中：甲狀腺乳頭狀癌43例，髓樣癌2例，未分化癌1例，甲狀腺濾泡狀腺癌2例。良性結(jié)節(jié)128例，其中：結(jié)節(jié)性甲狀腺腫83例，甲狀腺腺瘤41例，甲狀腺炎4例。

在已制備的傳感器上滴加2 μL不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)液,并孵育30 min,然后將4 μL 6 μmol/L的cDNA-BHQ1滴在檢測孔上,繼續(xù)孵育30 min,孵育完成后,用Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液沖洗。上述過程均在黑暗環(huán)境下進(jìn)行。通過熒光分光光度計(jì)測定傳感器的熒光光譜,設(shè)置激發(fā)光波長為480 nm,使用特制檢測裝置,測試傳感器的熒光強(qiáng)度。檢測孔用帶有中空圓形檢測位置的長方形卡片固定,將檢測孔粘貼在中空部分,之后將卡片沿對角線插入熒光池中。當(dāng)激發(fā)光射入時,與檢測孔表面成45°夾角,激發(fā)光與發(fā)射光的夾角為90°,熒光分光光度計(jì)可以成功檢測到傳感器的熒光光譜。

1.3.4 實(shí)際樣品處理

對加標(biāo)米粉和加標(biāo)綠豆餅進(jìn)行檢測。兩種樣品的處理:將購買的市售米粉樣品和綠豆餅樣品研磨成粉,各取0.5 g,分別加入0.5 mL不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)液,室溫干燥后,加入5 mL的萃取溶劑(甲醇-水,體積比7∶3),振蕩30 min后,以12 000 r/min離心10 min,用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾獲得上清液。之后,使用Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)將濾液稀釋。根據(jù)上述方法,分別制備出含有0、10、100、1 000 ng/mL的加標(biāo)米粉樣品和加標(biāo)綠豆餅樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)使用OriginPro 2021軟件處理數(shù)據(jù),使用Adobe Illustrator 2022軟件繪制原理圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)原理

圖1為檢測過程示意圖,圖2為紙基生物傳感器的檢測原理圖。由圖2可知,標(biāo)記有生物素的Apt-FAM,通過生物素和SA的強(qiáng)相互作用接在檢測孔表面。當(dāng)OTA存在時,OTA先與其適配體鏈Apt-FAM結(jié)合,形成特殊的OTA-G-四鏈體單鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)合物(OTA-induced G quadruplex),該復(fù)合物具有較高的穩(wěn)定性。再加入cDNA-BHQ1,結(jié)合有OTA的Apt-FAM無法與cDNA-BHQ1結(jié)合。因此,cDNA-BHQ1不能連接到紙基表面,FAM的熒光信號不會被猝滅。當(dāng)OTA不存在時,將cDNA-BHQ1加入檢測孔中,cDNA-BHQ1與Apt-FAM通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu),并成功連接到紙基上。此時,猝滅基團(tuán)BHQ1靠近熒光基團(tuán)FAM,通過FRET作用猝滅FAM,FAM的熒光信號減弱。通過測定兩種不同情況的熒光差值,OTA可以成功被檢測到。

圖1 熒光分光光度計(jì)檢測紙基生物傳感器的示意圖Fig.1 Schematic diagram of detecting paper-based biosensor by fluorescence spectrophotometer

圖2 紙基生物傳感器檢測OTA的原理圖Fig.2 Schematic diagram of paper-based biosensor for OTA detection

2.2 紙基生物傳感器用于OTA檢測

使用紙基生物傳感器對500 ng/mL的OTA進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖3所示。當(dāng)OTA不存在時,測得的熒光信號較弱(曲線a),為468.50,這說明DNA雙鏈結(jié)構(gòu)形成,FAM的熒光信號成功被BHQ1猝滅。當(dāng)OTA存在時,測得的熒光信號較強(qiáng)(曲線b),為637.59。這表明OTA-適配體復(fù)合物可以有效阻止cDNA-BHQ1與適配體結(jié)合,避免FAM的熒光被BHQ1猝滅。以上結(jié)果表明,OTA是引起熒光信號變化的關(guān)鍵因素,該紙基生物傳感器被成功制備。

圖3 紙基生物傳感器的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of paper-based biosensor

2.3 核酸適配體互補(bǔ)DNA序列的優(yōu)化

為了使紙基生物傳感器達(dá)到最佳的檢測性能,對互補(bǔ)鏈cDNA-BHQ1與Apt-FAM互補(bǔ)的堿基序列進(jìn)行了選擇。依據(jù)NUPACK軟件模擬結(jié)果(圖4),分別選取了3條不同長度的互補(bǔ)序列cDNA12-BHQ1、cDNA18-BHQ1、cDNA24-BHQ1。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,F0為傳感器與空白溶液孵育后的熒光強(qiáng)度,F為加入500 ng/mL OTA時傳感器的熒光強(qiáng)度,F-F0表示為相對熒光強(qiáng)度(ΔF)。可以看出,當(dāng)cDNA-BHQ1與適配體互補(bǔ)18個堿基時,有無目標(biāo)物存在時的ΔF最大。這說明cDNA-BHQ1與適配體互補(bǔ)的堿基序列過多或過少時,都會影響傳感器的檢測性能,不利于傳感器的構(gòu)造。因此,選擇cDNA18-BHQ1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 Apt與不同cDNA的形成的二級結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Diagram of secondary structure formed by Apt and different cDNA

圖5 不同cDNA對傳感器熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of different cDNA on the fluorescence intensity of the sensor

2.4 紙基生物傳感器的檢測性能分析

表2 用于檢測OTA的紙基傳感器的比較Table 2 Comparison of paper-based sensors for OTA detection

2.5 紙基生物傳感器的特異性分析

為了驗(yàn)證本試驗(yàn)所制備的紙基生物傳感器對OTA的選擇性,在相同的試驗(yàn)條件下對其他毒素(伏馬菌素B1(FB1)、T-2毒素、嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1))進(jìn)行了測試。由圖7可知,當(dāng)加入其他毒素孵育后,傳感器的熒光信號沒有明顯增強(qiáng);其他毒素與OTA混合孵育后,仍能實(shí)現(xiàn)對OTA的檢測,表明所制備的紙基生物傳感器具有良好的特異性。

注:所用OTA的質(zhì)量濃度為500 ng/mL,其他干擾毒素的質(zhì)量濃度均為10 000 ng/mL,Mix為6種物質(zhì)的混合物。圖7 不同毒素對傳感器特異性的影響Fig.7 Effects of different toxins on sensor specificity

2.6 紙基生物傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性分析

在相同檢測條件下,測定6個獨(dú)立相同的傳感器對500 ng/mL OTA的熒光響應(yīng)值,來評估傳感器的重現(xiàn)性。如圖8 (A)所示,檢測結(jié)果的RSD較低,為4.1%,表明該紙基生物傳感器具有良好的重現(xiàn)性。傳感器在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行儲存,其檢測能力的穩(wěn)定性也是影響傳感器性能的重要因素。因此,對紙基生物傳感器的儲存穩(wěn)定性進(jìn)行了測試。如圖8 (B)所示,將傳感器在4 ℃條件下儲存7 d后,傳感器的熒光強(qiáng)度保持在90%以上;在4 ℃條件下儲存28 d后,傳感器的熒光強(qiáng)度仍保持在60%以上。以上結(jié)果表明,該紙基生物傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

注:(A)紙基生物傳感器的重現(xiàn)性; (B)紙基生物傳感器的穩(wěn)定性(OTA的質(zhì)量濃度為500 ng/mL)。圖8 傳感器的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性Fig.8 Reproducibility and stability of different sensors

2.7 實(shí)際樣品檢測

為了驗(yàn)證本試驗(yàn)所制備的傳感器在實(shí)際樣品中的檢測效果,對米粉、綠豆餅樣品進(jìn)行了加標(biāo)檢測,結(jié)果如表3所示。米粉樣品和綠豆餅樣品的平均回收率分別為89.2%～111.0%和89.0%～103.0%,RSD均低于10%,表明該傳感器能夠成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測,且檢測結(jié)果準(zhǔn)確性較高。然后,通過檢測經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)測定的玉米粉樣品,進(jìn)一步驗(yàn)證了該傳感器的適用性,結(jié)果如表4所示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,測定玉米粉中OTA的t均小于4.303,即均小于t(0.95 ,n=3),說明本試驗(yàn)制備的傳感器與國標(biāo)HPLC法無顯著性差異?？梢钥闯?所制備的紙基生物傳感器具有一定的準(zhǔn)確性,置信度為95%。表明該傳感器具有實(shí)際應(yīng)用的潛力。

表3 米粉和綠豆餅中OTA的加標(biāo)檢測 (n=3)Table 3 OTA spiked detection in rice flour and mung bean cake (n=3)

表4 玉米粉對照樣品中OTA的檢測 (n=3)Table 4 Detection of OTA in control samples of corn flour (n=3)

3 結(jié)論

本研究采用簡單、低成本的紙基分析方法和快速響應(yīng)的熒光分析方法,成功構(gòu)建了基于FRET作用的紙基熒光生物傳感器,用于食品中OTA的快速檢測。該傳感器采用適配體特異性識別OTA,具有良好的選擇性,可以在多種真菌毒素存在的情況下進(jìn)行檢測。此外,該傳感器還具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測,為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測真菌毒素提供了技術(shù)支持。