楊智翔,殷海成,王金榮

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 河南 鄭州 450001

硒是谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶、甲酸脫氫酶、超氧化物歧化酶等多種抗氧化酶的輔因子,具有抗氧化、抗炎、免疫預(yù)防、抗病毒和抗癌等功能特性;同時糖尿病、癌癥、血管硬化癥等疾病也與缺硒有關(guān),因此硒是人和動物不可或缺的微量元素。自然界中,硒的2種存在形式是無機硒和有機硒。有機硒與無機硒相比因容易被消化吸收而具有更高的生物利用度[1]。硒化多糖是不同來源的多糖與硒進行合成的有機硒化合物,在增強免疫調(diào)節(jié)[2-3]、降血糖、降血脂[4]和抗菌[5]等方面優(yōu)于自然多糖。Malinowska等[6]的研究表明,硒元素與多糖通過化學(xué)合成的方式獲得硒多糖,既可保持多糖的基本構(gòu)型和生理功能,又能有效提高硒的生物利用度,發(fā)揮微量元素硒和多糖的復(fù)合功能。截至目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的有機硒多糖很少或含量極低。但也有報道微生物多糖的硒化修飾,例如乳酸菌肽聚糖和嗜酸乳桿菌肽聚糖。

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)是益生菌,具有抗感染、抗癌、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)等功能特性,常用作飼料添加劑或免疫增強劑。肽聚糖(PG)是枯草芽孢桿菌胞壁的主要成分,由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-1,4糖苷鍵連接而成。研究表明,PG具有多種生物活性,如抗感染、抗癌、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)等,還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子,如腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)和白細胞介素[7]。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的PG可保護由β-伴大豆球蛋白誘導(dǎo)引起的幼鯉腸道上皮細胞氧化損傷和炎癥反應(yīng),提高腸上皮細胞抗氧化能力和抗炎能力[8]。目前未見關(guān)于B.subtilisPG硒化修飾的報道。

在微生物胞壁多糖硒化改性中,二氯氧化硒(SeOCl2)法和硝酸-亞硒酸鈉(HNO3-Na2SeO3)法常用于多糖的硒化修飾。相關(guān)研究表明,使用HNO3-Na2SeO3法對多糖進行硒化修飾,對其分子主體和空間構(gòu)型影響較小[9],并且該方法具有反應(yīng)條件簡單、生產(chǎn)速度快、改性劑的硒含量較高等優(yōu)點。因此,在本研究中,采用HNO3-Na2SeO3法制備硒化肽聚糖(Se-PG),旨在表征Se-PG的結(jié)構(gòu)特征以及評價其體外抗氧化活性,以期為Se-PG作為食品或飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石油醚、無水乙醇、碳酸鈉、亞硒酸鈉、三氯乙酸、硝酸、鹽酸、溴化鉀、水楊酸、二甲亞砜(DMSO)和巰基乙醇均為分析純;1,1-二苯基-2-三硝基苯(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS):上海源葉生物科技有限公司。透析袋(1 000 Da):北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME-1004分析天平:梅特勒-托利多國際有限公司;ULTS1490恒溫水浴振蕩器:上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;213 pH計:上海精密儀器有限公司;ST16R高速冷凍離心機:賽默飛世爾科技有限公司;TGF-9073A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海喆圖科學(xué)儀器有限公司;TOPT-10D冷凍干燥機:西安特普訊儀器設(shè)備有限公司;L-8800全自動氨基酸分析儀:上海艾研生物科技有限公司;UV-3100PC紫外可見分光光度計:上海美普達儀器有限公司;FT-IR920紅外光譜分析儀:天津市拓普儀器有限公司;AVANCEⅢ HD 500 MHz核磁共振波譜儀:德國布魯克公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 硒化肽聚糖的制備

用優(yōu)化后的三氯乙酸法提取B.subtilis細胞壁PG(蛋白質(zhì)含量50.10%,總糖含量32.45%,分子質(zhì)量70 kDa),冷凍干燥備用。稱取100 mg酶解后的PG,加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%硝酸溶液中,充分混勻后,逐滴加入2.5 mL 0.05 g/mL的Na2SeO3溶液,然后在80 ℃下反應(yīng)8 h后冷卻至室溫,用1 mol/L無水碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值為中性后離心。采用流水透析,透析過程中取透析液檢測,當(dāng)透析液中不含Na2SeO3時停止透析。將透析液濃縮,加入8倍體積的95%乙醇,靜置過夜,離心后,沉淀用無水乙醇洗滌兩次后復(fù)溶,冷凍干燥得Se-PG[10]。依據(jù)GB 5009.93—2010的方法,采用氫化物發(fā)生原子熒光光譜法分析Se-PG的硒含量,負電壓為 300 V,燈電流為 80 mA,霧化溫度為200 ℃,霧化氣體高度為8 mm,載氣流量為400 mL/min,屏蔽氣流量為1 000 mL/min。

1.3.2 肽聚糖和硒化肽聚糖的結(jié)構(gòu)表征

1.3.2．1 紫外光譜分析

分別將1.0 mg PG和Se-PG溶解于100 mL純水中,混勻后用紫外分光光度計在波長190～400 nm下進行光譜掃描,掃描間距2 nm。

1.3.2．2 傅里葉紅外光譜(FT-IR)分析

分別取1.0 mg在烘箱中烘2 h的PG和Se-PG樣品,與干燥的溴化鉀粉末以質(zhì)量比1∶100混合,研磨均勻后壓片,然后由傅里葉變換紅外光譜儀檢測,掃描波數(shù)3 500～500 cm-1。

1.3.2．3 核磁共振(NMR)分析

分別取50.0 mg PG和Se-PG樣品,用DMSO溶解后凍干(重復(fù)3次),溶于1.0 mL DMSO,加入核磁管中。采用核磁共振儀在室溫下分析1H NMR和13C NMR譜。

1.3.2．4 氨基酸組成測定

根據(jù)GB/T 5009.124—2016的方法,將PG和Se-PG樣品烘干后粉碎,然后分別準(zhǔn)確稱取40 mg的樣品放入2支水解管中,分別加入10 mL 6 mol/L的HCl和100 μL巰基乙醇,充氮氣后密封水解管,于恒溫干燥箱中110 ℃水解24 h后冷卻,加入超純水并定容至100 mL。取1.5 mL過濾到離心管,吸取200 μL重蒸苯酚于離心管,旋轉(zhuǎn)蒸干,最后加入1 mL 0.02 mol/L的HCl,混勻。用全自動氨基酸分析儀進行分析測定。

1.3．3 體外抗氧化活性試驗

1.3.3．1 DPPH自由基清除率的測定

根據(jù)李曉嬌等[11]使用的方法,并稍加改動。試驗分為空白對照組、硒化試劑組(Na2SeO3)和試驗組(PG、Se-PG)。分別取2 mL梯度稀釋(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的Na2SeO3、PG、Se-PG溶液于15支試管中,向各組加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液(無水乙醇配制),振蕩混勻后,避光放置30 min,用無水乙醇調(diào)零,用紫外分光光度計測定517 nm波長下的吸光度,每組試驗重復(fù)3次。

DPPH清除率= [1-(A1-A2)/A0]×100%,

式中:A0為2 mL超純水 + 2 mL DPPH溶液的吸光度;A1為2 mL Na2SeO3、PG、Se-PG + 2 mL DPPH溶液的吸光度;A2為2 mL Na2SeO3、PG、Se-PG + 2 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.3．2 ABTS自由基清除率的測定

根據(jù)Ma等[12]使用的方法,并稍加改動。試驗分為空白對照組、硒化試劑組(Na2SeO3)和試驗組(PG、Se-PG)。將等量7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L過硫酸鉀充分混合,室溫避光反應(yīng)16 h,制備ABTS自由基。使用前,先將ABTS自由基溶液用無水乙醇稀釋至在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。分別取1 mL梯度稀釋(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的Na2SeO3、PG、Se-PG溶液于15支試管中,然后加入9 mL ABTS自由基溶液,室溫下反應(yīng)6 min,用蒸餾水調(diào)零,用紫外分光光度計測定734 nm波長處的吸光度,每組試驗重復(fù)3次。

ABTS清除率=(1-A1/A0)×100%,

式中:A0為1 mL蒸餾水 + 9 mL ABTS溶液的吸光度;A1為1 mL Na2SeO3、PG、Se-PG + 9 mL ABTS溶液的吸光度。

1.3.3．3 ·OH自由基清除率的測定

根據(jù)羅敏等[13]使用的方法,并稍加改動。試驗分為空白對照組、硒化試劑組(Na2SeO3)和試驗組(PG、Se-PG)。分別取2 mL梯度稀釋(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的Na2SeO3、PG、Se-PG溶液于15支試管中,向每支試管中依次加入2 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液,2 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,2 mL 9 mmol/L的H2O2溶液,然后于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min,冷卻至室溫,用蒸餾水調(diào)零,用紫外分光光度計測定510 nm波長處的吸光度,每組試驗重復(fù)3次。

羥基清除率=(A0-A1+A2)/A0×100%,

式中:A0為2 mL蒸餾水+2 mL H2O2+2 mL FeSO4+2 mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度;A1為2 mL Na2SeO3、PG、Se-PG溶液+2 mL H2O2+2 mL FeSO4+2 mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度;A2為2 mL Na2SeO3、PG、Se-PG溶液+2 mL蒸餾水+2 mL FeSO4+2 mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用3個獨立試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析,差異顯著水平為P<0.05。采用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肽聚糖和硒化肽聚糖的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 肽聚糖和硒化肽聚糖紫外光譜分析

Se-PG的紫外光譜掃描如圖1所示,由圖1可知,在260 nm和280 nm處沒有出現(xiàn)吸收峰,表明B.subtilisPG核酸和蛋白質(zhì)都被完全消除,修飾前后的紫外全波長掃描圖譜有顯著的不同,PG本身無明顯吸收峰,但PG經(jīng)過修飾后出現(xiàn)了一個強的吸收峰,表明硒化修飾后,硒通過酯鍵的形式與PG結(jié)合,在209 nm處出現(xiàn)較強的吸收峰,歸因于結(jié)構(gòu)中存在亞硒酸酯。

圖1 肽聚糖和硒化肽聚糖紫外光譜Fig.1 UV spectra of PG and Se-PG

圖2 肽聚糖和硒化肽聚糖傅里葉紅外光譜Fig.2 FT-IR spectra of PG and Se-PG

2.1.3 肽聚糖和硒化肽聚糖核磁共振分析

在硒化修飾過程中,Na2SeO3優(yōu)先與半縮醛羥基反應(yīng)。在13C-NMR譜中,化學(xué)位移(δ)60.65～84.07 ppm的信號歸因于殘基的C-2到C-6。在1H-NMR譜中,δ5.0～5.4 ppm的化學(xué)位移與α-糖苷構(gòu)型有關(guān),δ3.20～4.20 ppm之間的信號可分配給糖苷環(huán)的H-2到H-5。由圖3(a)與3(b)可知,在δ1.34 ppm位置的信號峰在硒化修飾后消失,由此推斷與—CH2相連的—OH被硒基取代,且δ1.79 ppm位置的氫信號出現(xiàn)新的信號峰,推測為硒基取代乙酰氨基(CH3—CO—NH—)的特征峰。由圖3(c)和3(d)可知,Se-PG在δ87.80 ppm處出現(xiàn)的新峰可以歸屬于硒化后硒元素取代的碳原子共振現(xiàn)象。

注:(a)PG 1H-NMR譜,(b)Se-PG 1H-NMR譜,(c)PG 13C-NMR譜,(d)Se-PG 13C-NMR譜。圖3 肽聚糖和硒化肽聚糖核磁共振圖譜Fig.3 13C-NMR and 1H-NMR spectra of PG and Se-PG

2.1.4 肽聚糖和硒化肽聚糖氨基酸分析

氨基酸組分分析是研究PG結(jié)構(gòu)和組成的重要手段,用以確定PG肽鏈的連接方式,分析其免疫活性及抗氧化活性。氨基酸自動分析結(jié)果見表1,B.subtilisPG共含有17種氨基酸,硒化修飾前后其總氨基酸含量分別為47.74%和28.20%;其中含量較高的5種分別是丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和亮氨酸,這5種氨基酸組成了連接在N-乙酰胞壁酸3號碳原子上的短肽或肽橋(一條糖鏈肽尾3號位氨基酸氨基與另一條鏈4號位氨基酸羧基通過肽橋脫水縮合),而PG免疫效應(yīng)的產(chǎn)生與四肽尾(L-Ala→D-Glu→L-Lys→D-Ala)和肽橋的交聯(lián)結(jié)構(gòu)存在聯(lián)系;硒化修飾后,PG氨基酸種類并未發(fā)生改變,四肽尾結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化,保留了PG的生物學(xué)特性。

表1 PG和Se-PG氨基酸分析Table 1 Amino acid analysis of PG and Se-PG

2.2 硒化肽聚糖的抗氧化活性

通過氫化物發(fā)生原子熒光光譜法測得Se-PG中硒含量為369.32 μg/g。在抗氧化劑存在的情況下,DPPH自由基可以通過接受電子或氫被還原,常用于評估多糖等抗氧化劑的自由基清除能力,DPPH自由基清除率越高,抗氧化活性越高。由圖4(a)可知,當(dāng)Se-PG質(zhì)量濃度增加時,DPPH自由基清除率隨之增加,且在相同質(zhì)量濃度下Se-PG自由基清除率顯著高于PG (P<0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,PG和Se-PG的DPPH自由基清除活性分別為26.07%±0.82%和39.51%±0.26%。

注:曲線上不同字母表示樣本之間存在顯著差異(P<0.05)。圖4 肽聚糖和硒化肽聚糖對DPPH、ABTS、羥基自由基清除作用Fig.4 DPPH, ABTS, and hydroxyl free radical scavenging ability of PG and Se-PG

由圖4(b)可知,當(dāng)Se-PG質(zhì)量濃度增加時,ABTS自由基清除率隨之增加,Se-PG自由基清除率顯著高于PG(P< 0.05);在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,PG和Se-PG的ABTS自由基清除活性分別為33.90%±0.45%和39.47%±0.98%。

·OH自由基被認為是最具活性的氧自由基,活性氧很容易穿過細胞膜與碳水化合物、脂質(zhì)、氨基酸和DNA反應(yīng),導(dǎo)致細胞損傷甚至死亡。由圖4(c)可知,PG和Se-PG對·OH自由基的清除有重要作用,當(dāng)其質(zhì)量濃度增加時,自由基清除率隨之增加,當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,PG和Se-PG的·OH自由基清除活性分別為40.24%±1.12%和48.38%±1.42%。

3 討論

改性方法及多糖性質(zhì)均會影響多糖硒化修飾的效果。顏炳祥等[14]采用二氯氧硒法對乳酸菌胞外多糖進行硒化修飾,得到的硒多糖的硒含量為169.228 μg/g;經(jīng)HNO3-Na2SeO3法對嗜酸乳桿菌胞壁PG進行硒化修飾,得到的Se-PG硒含量為381.93 μg/g[15];李曉嬌等[11]通過HNO3-Na2SeO3法制備得到的硒化鐵皮石斛多糖硒含量為2.35 mg/g。本研究制備得到Se-PG的硒含量為369.32 μg/g。相關(guān)研究表明,HNO3-Na2SeO3法對多糖分子結(jié)構(gòu)的影響較小[9],但不同來源的多糖由于基團及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的不同,進行硒化修飾后,其復(fù)合物的硒含量出現(xiàn)相應(yīng)的差異。

PG是B.subtilis細胞壁主要成分,占50%～80%,每個PG單體都由糖鏈、四肽尾和肽橋等組成,其中糖鏈?zhǔn)怯蒒-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-1,4糖苷鍵連接而成[23],PG免疫效應(yīng)的發(fā)揮與其四肽尾和肽橋的交聯(lián)程度相關(guān)[24]。本研究制備得到的硒化B.subtilisPG的氨基酸含量與修飾前比較,雖然每種氨基酸的含量都有所變化,但是主氨基酸組成并沒有變化,仍為丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和亮氨酸。研究表明,谷氨酸、天冬氨酸、組氨酸、絲氨酸等氨基酸與金屬離子螯合特性關(guān)系密切[25],機體內(nèi)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時,亞鐵離子會被氧化成高價態(tài),同時生成羥基自由基或超氧陰離子,而金屬離子螯合物會阻斷反應(yīng)鏈,通過減少羥基自由基與超氧陰離子的生成,進而發(fā)揮抗氧化作用[26]。PG硒化修飾前后氨基酸構(gòu)成沒有發(fā)生明顯變化就意味著PG仍然具有抗氧化效應(yīng),且增加了硒的抗氧化功能。

自由基是機體新陳代謝的中間產(chǎn)物,當(dāng)機體應(yīng)激時,機體內(nèi)自由基的代謝量會超過正常免疫應(yīng)答范圍,引起自由基的連鎖反應(yīng),活性氧(O2-、·OH、H2O2)的數(shù)量便會增加,促使蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)等細胞基本組成物質(zhì)遭受氧化反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為新的自由基,進一步損傷機體器官,導(dǎo)致機體功能失調(diào)紊亂。PG的分子結(jié)構(gòu)與其抗氧化活性相關(guān),而亞硒酸鈉本身對DPPH自由基具有較強的清除能力[27],硒化修飾后,硒化PG水解作用加強,支鏈結(jié)構(gòu)增多,且側(cè)鏈基團增多,也增加一定的親水基,有助于活性提高;本研究結(jié)果顯示,PG經(jīng)硒化修飾后,引入的硒基團能夠進一步增強PG對ABTS與·OH自由基的清除能力;因此Se-PG相較于PG,表現(xiàn)出更好的體外抗氧化活性。張釗瑞[28]提出,4 mg/mL乳酸菌PG清除DPPH、ABTS和羥基自由基的能力隨水解時間延長逐漸增強。同樣地,Xiao等[29]研究表明,與修飾前相比,硒化馬尾藻多糖具有更強的亞鐵離子螯合活性,具有更高的DPPH、ABTS自由基清除能力。另外,隨著PG不斷水解,糖苷鍵斷裂,羥基、羧基、酰胺等能夠提供電子基團的數(shù)量增多,不穩(wěn)定的自由基能夠捕獲的電子隨之增多,進而轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的產(chǎn)物,因此,促進了水解PG抗氧化能力的提升。新基團的形成可能會導(dǎo)致其供氫能力增強,因此,較高的硒含量通常會增強硒多糖的生物活性和其自由基的清除能力。PG硒化修飾后對ABTS、DPPH和·OH自由基清除率顯著增加,且隨質(zhì)量濃度的增加,其抗氧化能力增強;Se-PG中的硒是以硒基團或硒酸酯形式存在的,硒基團或硒酸酯可以激活異構(gòu)體碳的氫原子,并具有給予氫原子的能力,能夠?qū)⒏嗟淖杂苫D(zhuǎn)化為穩(wěn)定的產(chǎn)物,提高PG的抗氧化能力。

4 結(jié)論

對制備得到的Se-PG進行結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性測定,結(jié)果表明,硒化修飾后,氨基酸含量略有下降,但氨基酸種類整體沒有變化,仍保留了主要氨基酸組成。通過紫外光譜、傅里葉紅外光譜和核磁共振分析,均出現(xiàn)相應(yīng)的特征吸收峰,表明Se-PG中硒主要以酯鍵的形式與PG結(jié)合。在體外抗氧化活性方面,Se-PG對ABTS、DPPH和·OH自由基有較強的清除作用。這些結(jié)果表明,Se-PG可以作為功能性抗氧化添加劑,提高機體的抗氧化能力。