王志成,王 琦,張長付,張聰聰,王澤濠,張 霞,王金水

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 河南 鄭州 450001

小麥粉的獨特性質(zhì)是形成黏彈性網(wǎng)絡(luò),主要歸因于面筋蛋白的功能[1-3]。面筋蛋白可分為麥谷蛋白和醇溶蛋白[4]。在這些蛋白質(zhì)中,麥谷蛋白高分子量亞基(HMW-GS)是面筋網(wǎng)絡(luò)發(fā)育的關(guān)鍵成分,對小麥粉的功能特性尤為重要[5-6]。HMW-GS由3個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,包括非重復(fù)的N-末端結(jié)構(gòu)域、非重復(fù)的C-末端結(jié)構(gòu)域和中心重復(fù)結(jié)構(gòu)域[7]。研究表明,HMW-GS在面粉加工方面對食品品質(zhì)有著重要作用[8-9]。HMW-GS影響60%面包的烘焙品質(zhì)[10-11]。

目前,關(guān)于HMW-GS缺失研究已有較多報道。由1D染色體組編碼的1Dx5+1Dy10亞基組合與小麥的最優(yōu)加工品質(zhì)密切相關(guān)[12]。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)HMW-GS缺失顯著降低了面團品質(zhì)。1Dx2的缺失會影響小麥面筋的質(zhì)量[14]。缺失1Dy12對面團性狀和面粉加工質(zhì)量產(chǎn)生負面影響[15]。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)與Glu-A1缺失型相比,Glu-D1缺失顯著降低了面團強度和延伸性。Suliman等[17]鑒定了MSD株系,發(fā)現(xiàn)Glu-D1位點(2.1 t+12 t和2t+12 t)兩個不同等位基因可提高面粉品質(zhì)。此外,1Dx5和1Bx7也是面團具有較高面筋強度和較好面包加工品質(zhì)的重要因素[18]。因此,HWM-GS對面筋強度和面粉加工品質(zhì)具有極其重要的作用。對HMW-GS亞基的研究,主要集中于基因沉默缺失方面,缺乏對面粉中回添HMW-GS的研究。

在此背景下,作者通過將1Dx5-N蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中組成型表達,純化得到1Dx5-N蛋白,并分別以IPTG和乳糖作為誘導(dǎo)劑對其進行誘導(dǎo)表達,為進一步提高其誘導(dǎo)表達效率,對誘導(dǎo)條件進行優(yōu)化。比較IPTG和乳糖兩種誘導(dǎo)劑對1Dx5-N蛋白的表達量,嘗試使用乳糖代替IPTG誘導(dǎo)表達蛋白,在降低成本的同時獲得較好的表達效果。本研究為1Dx5-N對面筋蛋白的形成及作用機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌BL21(DE3)、質(zhì)粒pET-30a:河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院實驗室保藏;制膠液試劑盒、IPTG、Kana抗生素:北京索萊寶科技有限公司;質(zhì)粒試劑盒:北京博邁德基因技術(shù)有限公司;SE無縫克隆試劑盒:北京莊盟國際生物基因科技有限公司;乳糖等為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

6345HQ118566 PCR儀:Eppendorf AG;NANODROP 2000超微量分光光度計:ThermoFisher scientific;BIORIDGE離心機:鄭州金友寧儀器有限公司;DYY-7C電泳儀:北京六一生物科技有限公司;Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng):美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 1Dx5-N基因序列引物設(shè)計及目的基因的擴增

通過植物基因組網(wǎng)站phytozome(https://jgi.doe.gov/data-and-tools/data-systems/phytozome/)搜索1Dx5基因序列,以小麥基因組為模板,其中編碼前89個氨基酸序列的基因序列為1Dx5-N,利用Oligo7.0軟件設(shè)計引物,上游引物為TAATACGACTCACTATAGGG(0082),下游引物為TGCTAGTTATTGCTCAGCGG(0083);采用PCR方法擴增。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 回收目的基因及連接載體

參照Gel Extraction Kit(OMEGA)試劑盒說明書回收DNA片段,使用SE無縫克隆試劑盒進行重組反應(yīng),重組完成后,PCR 37 ℃保溫30 min,冰浴5 min備用。

1.3.3 制備及轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞

挑取大腸桿菌BL21(DE3)接種至LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 h。劃線至LB平板,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜。冰浴5 min,6 000 r/min離心5 min,收集菌體。0.1 mol/L CaCl2溶液(預(yù)冷)洗滌沉淀,6 000 r/min離心5 min,收集菌體。去離子水(預(yù)冷)洗滌沉淀,6 000 r/min離心5 min,收集菌體。加入預(yù)冷的0.05 mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液,即為感受態(tài)細胞。加入1 μL重組質(zhì)粒,冰浴30 min,42 ℃水浴熱激90 s,冰浴3 min;加入LB-Kana液體培養(yǎng)基,37 ℃、170 r/min培養(yǎng)1 h,涂板,37 ℃倒置培養(yǎng)至出現(xiàn)單克隆菌落。

1.3.4 陽性克隆鑒定分析

隨機挑取8個單菌落分別接種至800 μL LB-Kana液體培養(yǎng)基,編號1—8,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 h。以菌液為模板進行PCR檢驗。上述鑒定結(jié)果為陽性的菌液,按照質(zhì)粒試劑盒說明書提取質(zhì)粒。獲得質(zhì)粒后,以質(zhì)粒為模板進行PCR檢驗。

1.3.5 1Dx5-N蛋白原核表達

將篩選出含有目的基因的大腸桿菌BL21(DE3)菌株,在5 mL LB-Kana液體培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 h,加入乳糖(終質(zhì)量濃度為9 g/L),30 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h,將菌液10 000 r/min離心1 min,棄上清液,用100 μL Tris-HCl緩沖液重懸菌體,冰上超聲破碎菌體。10 000 r/min離心1 min分離上清液和沉淀,分別進行SDS-PAGE檢測。

1.3.6 誘導(dǎo)蛋白表達條件優(yōu)化

參照李攀峰等[19]、師聰?shù)萚20]、王建洲等[21]的方法并稍加改進。以IPTG濃度0.6 mmol/L、乳糖質(zhì)量濃度9 g/L、誘導(dǎo)溫度30 ℃和誘導(dǎo)時間16 h為初始誘導(dǎo)條件,單因素試驗分別考察IPTG濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L)、乳糖質(zhì)量濃度(0、0.5、1、2.5、5、7、9、12、15 g/L)、IPTG誘導(dǎo)溫度(15、20、25、30、35 ℃)、乳糖誘導(dǎo)溫度(15、20、25、30、35 ℃)、IPTG誘導(dǎo)時間(0、2、4、6、8、10、12、16 h)和乳糖誘導(dǎo)時間(0、2、4、6、8、10、12、16 h)對1Dx5-N蛋白表達量的影響。

1.3.7 正交試驗設(shè)計

根據(jù)以上6個單因素試驗結(jié)果,設(shè)計L9(34)正交試驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 26進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴增及轉(zhuǎn)化結(jié)果檢測

HMW-GS的1Dx5-N序列全長2 540 bp,共編碼833個氨基酸。其中1Dx5-N序列基因占有267 bp,共編碼89個氨基酸,相對分子質(zhì)量為16.211 kDa。圖1(a)中泳道1、2為目的基因,大小為269 pb。擴增效果良好,條帶明亮,充分表明引物的穩(wěn)定性。膠回收DNA,測得DNA質(zhì)量濃度為173 ng/μL。采用相同方法對pET-30a線性載體進行膠回收,測得pET-30a線性載體質(zhì)量濃度為51.9 ng/μL,二者回收濃度較高,回收效果符合預(yù)期。圖1(b)表明,使用通用引物擴增獲得基因片段的大小在500 bp附近,與陽性對照基因片段大小(589 bp)一致。通過測序表明載體連接成功,PCR擴增獲得大小和序列正確的1Dx5-N基因。圖1(c)表明,重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到大小在250 bp附近的條帶,片段大小與目的基因片段(269 bp)相吻合。證明重組質(zhì)粒pET-30a-1Dx5-N構(gòu)建成功。

圖中M為BM 2 000 DNA Marker;圖(a)中泳道1、2均為目的基因;圖(b)中泳道1—11為菌液、泳道12為陽性對照、泳道13為陰性對照;圖(c)泳道1為pET-30a-1Dx5-N質(zhì)粒雙酶切。圖1 1Dx5-N原核表達載體構(gòu)建Fig.1 Construction of 1Dx5-N prokaryotic expression vector

2.2 1Dx5-N蛋白原核表達可溶性分析

圖2表明,誘導(dǎo)后重組菌表達的蛋白條帶中有條約為16.211 kDa的蛋白,與不帶His標(biāo)簽的1Dx5-N基因?qū)?yīng)的蛋白大小一致。未誘導(dǎo)的菌體在16.211 kDa處無明顯條帶,誘導(dǎo)后的菌體在16.211 kDa處有明顯條帶。表明重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后成功表達1Dx5-N蛋白。菌體破碎上清液中幾乎沒有1Dx5-N蛋白,大部分目的蛋白存在于沉淀中。表明重組蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在。

圖2 原核表達的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of prokaryotic expression

2.3 誘導(dǎo)濃度對誘導(dǎo)蛋白表達量影響

分別對IPTG誘導(dǎo)和乳糖誘導(dǎo)重組菌胞進行SDS-PAGE電泳分析。通過蛋白電泳,在15 kDa左右出現(xiàn)目的條帶(圖3)。乳糖本身也可以作為菌體的碳源供其生長代謝[22]。所以乳糖作為誘導(dǎo)劑時,目的蛋白表達量比IPTG誘導(dǎo)高(圖3)。圖3 (a)表明,隨著IPTG濃度增加,蛋白表達量逐漸上升,目的條帶顏色逐漸加深。IPTG濃度達到0.6 mmol/L時,Image 分析OD為448.59,目的條帶顏色最深,蛋白表達量達到最大。當(dāng)IPTG濃度超過0.6 mmol/L,目的條帶顏色減弱,蛋白表達量開始逐漸降低。由于IPTG具有一定的毒性,抑制菌體生長進而抑制目標(biāo)蛋白表達[23]。圖3(b)表明,隨著乳糖質(zhì)量濃度增加,目的條帶顏色逐漸加深,蛋白表達量逐漸地上升。乳糖質(zhì)量濃度達到9 g/L時,Image分析OD為868.18,目的條帶顏色最深,蛋白表達量最高。當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度超過9 g/L,目的條帶顏色不再增加。綜上所述,IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.6 mmol/L,乳糖最佳誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為9 g/L。

圖3 不同誘導(dǎo)劑濃度對1Dx5-N蛋白表達影響的SDS-PAGE分析Fig.3 Effects of different inducer concentrations on 1Dx5-N protein expression by SDS-PAGE analysis

2.4 溫度對誘導(dǎo)蛋白表達量影響

圖4表明,當(dāng)誘導(dǎo)溫度為35 ℃時,溫度較高,明顯適合菌體生長,菌體生長過快,因此IPTG和乳糖誘導(dǎo)蛋白表達量均很低。圖4 (a)表明,隨著溫度的降低,IPTG誘導(dǎo)蛋白表達量先升高后降低;當(dāng)溫度為30 ℃時,Image分析OD為229.39,目的條帶顏色最深,蛋白表達量最高。圖4(b)表明,乳糖誘導(dǎo)受溫度的影響較小,蛋白表達量基本沒有變化。乳糖的誘導(dǎo)效果比IPTG更加穩(wěn)定。當(dāng)溫度為30 ℃時,Image分析OD為369.86,目的條帶顏色最深,蛋白表達量最高。綜上所述,IPTG和乳糖誘導(dǎo)蛋白表達最佳溫度均為30 ℃。

圖4 兩種誘導(dǎo)劑在不同溫度對1Dx5-N蛋白表達影響的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the effect of two inducers on 1Dx5-N protein expression at different temperatures

2.5 時間對誘導(dǎo)蛋白表達量影響

圖5(a)表明,IPTG誘導(dǎo)蛋白表達量隨著誘導(dǎo)時間增加并無明顯增加。圖5(b)表明,乳糖誘導(dǎo)蛋白表達量隨著誘導(dǎo)時間增加而增加,并在16 h時達到最大表達量,目的條帶顏色最深。當(dāng)時間為16 h時,Image分析OD為1 369.56,目的條帶顏色最深,蛋白表達量最高。綜上所述,IPTG和乳糖誘導(dǎo)表達時間均選擇16 h。

圖5 兩種誘導(dǎo)劑在不同時間對1Dx5-N蛋白表達影響的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the effects of two inducers on 1Dx5-N protein expression at different time periods

2.6 正交試驗

通過分析影響1Dx5-N蛋白表達量的單因素試驗,設(shè)計L9(33)正交試驗,因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

由表2、表3可知,各因素對IPTG誘導(dǎo)表達蛋白影響次序依次為IPTG誘導(dǎo)劑濃度>IPTG誘導(dǎo)時間>IPTG誘導(dǎo)溫度。故可知IPTG誘導(dǎo)表達蛋白最優(yōu)條件為A2B2C3(IPTG濃度0.6 mmol/L、溫度30 ℃、時間16 h),此時,總蛋白質(zhì)量濃度為1.04 mg/mL。由表4、表5可知,各因素對乳糖誘導(dǎo)表達蛋白影響次序依次為乳糖誘導(dǎo)劑濃度>乳糖誘導(dǎo)溫度>乳糖誘導(dǎo)時間。故可知乳糖誘導(dǎo)表達蛋白最優(yōu)條件為D2E2F3(乳糖質(zhì)量濃度9 g/L、溫度30 ℃、時間16 h),此時總蛋白質(zhì)量濃度為1.62 mg/mL。

表2 IPTG誘導(dǎo)表達正交試驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test of IPTG-induced expression

表3 IPTG誘導(dǎo)表達方差分析Table 3 Variance analysis of IPTG induced expression

表4 乳糖誘導(dǎo)表達正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of lactose-induced expression

表5 乳糖誘導(dǎo)表達方差分析Table 5 Analysis of variance of lactose induced expression

3 結(jié)論

本研究成功實現(xiàn)1Dx5-N蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達,對構(gòu)建質(zhì)粒后的細胞進行克隆鑒定確保能夠穩(wěn)定地進行蛋白表達,并對誘導(dǎo)條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明1Dx5-N能在大腸桿菌BL21(DE3)中穩(wěn)定遺傳并大量表達,IPTG誘導(dǎo)最佳條件:IPTG濃度0.6 mmol/L、溫度30 ℃、時間16 h。乳糖誘導(dǎo)最佳條件:乳糖質(zhì)量濃度9 g/L、溫度30 ℃、時間16 h。乳糖作為誘導(dǎo)劑,表現(xiàn)出比IPTG更優(yōu)越的特性,乳糖誘導(dǎo)表達總蛋白濃度為1.62 mg/mL,IPTG誘導(dǎo)表達總蛋白濃度為1.04 mg/mL,因此,采用乳糖代替IPTG進行大量誘導(dǎo)表達,是一種經(jīng)濟、安全和高效的選擇。既可降低試驗成本,又可減少IPTG作為有毒物質(zhì)帶來的不利影響。研究結(jié)果為后續(xù)獲得具有足量的并具有生物活性的1Dx5-N蛋白及添粉試驗奠定基礎(chǔ),為后期研究1Dx5-N對面筋蛋白特性的影響提供了依據(jù)。