劉 悅,代養(yǎng)勇*,曹 健,侯漢學(xué),王文濤,張 慧,丁秀臻,李 誠(chéng)

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 泰安 271018 2.山東省糧食加工技術(shù)工程技術(shù)研究中心, 山東 泰安 271018 3.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 河南 鄭州 450001

大豆分離蛋白(soybean protein isolate, SPI)作為一種優(yōu)質(zhì)廉價(jià)的植物蛋白質(zhì),可以提供人體生長(zhǎng)和修復(fù)所需的必需氨基酸。SPI作為多種蛋白的混合體,主要含有2S、7S、11S、15S 4類蛋白質(zhì)。其中,7S(β-伴大豆球蛋白)和11S(大豆球蛋白)占70%以上,其緊密的球狀結(jié)構(gòu)不利于蛋白溶解性、起泡性和成膜性等功能優(yōu)勢(shì)的發(fā)揮,限制了SPI的應(yīng)用范圍[1]。

目前,食品行業(yè)主要通過(guò)物理改性[2]、化學(xué)改性[3]、酶法改性[4]及其他新方法(主要是基因工程)來(lái)改變蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)而達(dá)到改善功能品質(zhì)的目的。物理改性是在不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的情況下,通過(guò)人為控制條件改變蛋白質(zhì)分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)和分子間的聚集狀態(tài)來(lái)改善它的功能特性[5],具有蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)損失少、操作過(guò)程簡(jiǎn)單、改性成本低、耗時(shí)短、無(wú)毒副作用等優(yōu)勢(shì)[6]。與物理改性相比,化學(xué)改性的蛋白含有較多的副產(chǎn)物,產(chǎn)品存在一定的安全隱患;酶法改性成本較高;而其他新方法改性的蛋白在短時(shí)間內(nèi)難以確保食品安全性問(wèn)題。Bi等[7]通過(guò)高剪切均質(zhì)處理SPI分散體后發(fā)現(xiàn)分散體的粒徑顯著減小,蛋白的多分散性能和凝膠性能得到改善。Sharafodin等[8]通過(guò)介電阻擋放電(DBD)等離子體技術(shù)處理SPI后,發(fā)現(xiàn)SPI的乳化性能、溶解性、持水性和發(fā)泡性能均得到增強(qiáng),且在18 kV等離子體處理15 min時(shí)效果最好。

干法研磨作為一種安全且環(huán)保的高效物理改性技術(shù),通過(guò)反復(fù)高能的沖擊和摩擦致使材料變性,不僅能夠增強(qiáng)表面性質(zhì),而且能夠改善食品的某些加工性能[9-10]。而關(guān)于干法研磨對(duì)蛋白物理改性方面的研究相對(duì)較少?；诖?作者以商品型SPI為原料,利用干法研磨技術(shù)對(duì)其進(jìn)行物理改性處理,研究不同研磨時(shí)間對(duì)SPI結(jié)構(gòu)、起泡性能和成膜性能的影響,以期尋求一種拓寬SPI在食品中的應(yīng)用范圍的物理改性新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆分離蛋白:山東禹王生態(tài)食品有限公司;大豆油:中國(guó)益海嘉里金龍魚(yú)糧油食品股份有限公司;所用化學(xué)試劑均為分析級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

ST-Q200型球磨機(jī):北京旭鑫儀器設(shè)備有限公司;Lumina型熒光-磷光分光光度計(jì)、Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀:美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;JC2000C1型接觸角測(cè)量?jī)x:上海中辰數(shù)字技術(shù)有限公司;T18 digital Ultra-T型高速分散均質(zhì)器:德國(guó)IKA公司;HWS-60型恒溫恒濕試驗(yàn)箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;CR-400型色度計(jì):日本Konica Minolta公司;W3/030型水蒸氣透過(guò)率測(cè)試儀、XLW(CP)型拉伸測(cè)試儀:濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司;Quanta FEG250型掃描電子顯微鏡:美國(guó)FEI公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆分離蛋白的改性

將160 g SPI與800 g研磨球放入研磨罐內(nèi),設(shè)定球磨機(jī)轉(zhuǎn)速為400 r/min,在25 ℃進(jìn)行不同時(shí)間(0、3、6、9、12、15 min)的研磨處理。為防止較長(zhǎng)時(shí)間的研磨使SPI的溫度升高,每研磨3 min暫停2 h以保證研磨罐冷卻至室溫條件。研磨結(jié)束后將蛋白粉末放入自封袋內(nèi),4 ℃保存,備用。

1.3.2 三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

根據(jù)Jiang等[11]使用的測(cè)定方法并稍做修改。使用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制1 mg/mL蛋白溶液。在25 ℃下,以5 nm的狹縫寬度,295 nm的激發(fā)波長(zhǎng),10 nm/s的掃描速度測(cè)定300～450 nm處的熒光光譜。

1.3.3 親水性、親油性的測(cè)定

將2.00 g蛋白粉末壓成光滑的薄片,分別以去離子水、大豆油做潤(rùn)濕試驗(yàn)樣品。采用懸滴法測(cè)定液滴與SPI薄片表面的接觸角。

1.3.4 起泡性能的測(cè)定

將3%的SPI溶液用高速分散均質(zhì)器在10 000 r/min下均質(zhì)3 min后迅速倒入量筒內(nèi),并于均質(zhì)結(jié)束0 min、10 min時(shí)測(cè)定量筒內(nèi)泡沫的體積。起泡能力(foaming capacity, FC)和泡沫穩(wěn)定性(foam stability, FS)的計(jì)算公式如下。

FC=V0/V×100%,FS=V1/V×100%,

式中:FC為起泡能力,%;FS為泡沫穩(wěn)定性,%;V0為均質(zhì)結(jié)束0 min時(shí)泡沫的體積,mL;V1為均質(zhì)結(jié)束10 min時(shí)泡沫的體積,mL;V為均質(zhì)前溶液的體積,mL。

1.3.5 成膜性能的測(cè)定

1.3.5.1 大豆分離蛋白膜的制備

根據(jù)Cheng等[12]使用的制備方法并稍做修改。在磁力攪拌2 h的5% SPI懸浮液中加入4 g甘油(40% SPI)制備SPI的成膜液。攪拌脫氣1 h,向培養(yǎng)皿(直徑150 mm)中澆注40 g成膜液。在25 ℃、55%的恒溫恒濕條件下干燥24 h,剝離薄膜并放于自封袋中保存?zhèn)溆?。膜性能測(cè)定前,需將薄膜放在25 ℃、55%的恒溫恒濕條件下調(diào)節(jié)72 h。

1.3.5.2 膜的結(jié)構(gòu)性表征

使用帶衰減全反射采樣附件(iD5 ATR)的傅里葉變換紅外光譜儀,以4 cm-1的光譜分辨率在400～4 000 cm-1的范圍內(nèi)掃描32次。每掃描一個(gè)樣品前都需要收集一次背景[13]。

1.3.5.3 膜的顏色參數(shù)及透明度

以白色標(biāo)準(zhǔn)板為參照物,通過(guò)色度計(jì)在薄膜的任意5點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定,獲取顏色參數(shù)L*(明暗)、a*(紅綠)和b*(藍(lán)黃)和總色差(ΔE)[13]。薄膜的透明度則以600 nm處的吸光度與薄膜厚度的比值表示。

1.3.5.4 膜的水分含量、總可溶性物質(zhì)和水蒸氣滲透性

薄膜的水分含量(moisture content, MC)和總可溶性物質(zhì)(total soluble matter, TSM)根據(jù)Muoz等[14]使用的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。薄膜的水蒸氣滲透性(water vapor permeability, WVP)根據(jù)Zhai等[15]使用的測(cè)定方法通過(guò)水蒸氣透過(guò)率測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)量。在38 ℃、相對(duì)濕度90%條件下,在12 h內(nèi),每隔2 h將直徑80 mm的無(wú)磨損、無(wú)褶皺的圓形薄膜樣品稱重一次。

1.3.5.5 膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率

膜的拉伸強(qiáng)度(tensile strength, TS)和斷裂伸長(zhǎng)率(elongation at break, EAB)根據(jù)Zhai等[15]使用的測(cè)定方法(稍做修改后)通過(guò)XLW(CP)拉伸測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)量。測(cè)試過(guò)程中,兩個(gè)夾具之間的原始標(biāo)距設(shè)置為50 mm,并以100 mm/min的速度拉伸,直至破裂。

1.3.5.6 膜的微觀形貌

用雙面透明膠帶將SPI薄膜固定在支架上,并通過(guò)離子濺射儀為其表面鍍一層鉑金膜。通過(guò)調(diào)節(jié)電鏡選取最佳拍攝視野后觀察并拍攝照片。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Origin 8.0軟件繪制圖表,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA,P<0.05),數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 研磨時(shí)間對(duì)SPI結(jié)構(gòu)的影響

當(dāng)SPI的分子構(gòu)象發(fā)生改變時(shí),其芳香族氨基酸與周圍基團(tuán)的相互作用也會(huì)發(fā)生改變,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度和最大發(fā)射波長(zhǎng)(λm)發(fā)生改變[16]。通常,擁有較高熒光強(qiáng)度和較短λm的SPI處于折疊狀態(tài),而擁有較低熒光強(qiáng)度和較長(zhǎng)λm的SPI處于部分或者完全未折疊狀態(tài)[17]。由圖1可知,研磨處理后,SPI的熒光強(qiáng)度降低,且λm發(fā)生了紅移。表明研磨處理改變了SPI的三級(jí)結(jié)構(gòu),使處于折疊狀態(tài)的SPI發(fā)生了去折疊,同時(shí)SPI內(nèi)部的發(fā)色團(tuán)(主要是疏水發(fā)色團(tuán)色氨酸(Trp)殘基和酪氨酸(Tyr)殘基,其次還有苯丙氨酸(Phe)殘基)更多地轉(zhuǎn)移至分子外部并暴露于溶劑中[18]。當(dāng)研磨處理15 min時(shí),熒光強(qiáng)度最低,λm紅移程度最大。然而,研磨6 min的SPI的熒光強(qiáng)度要高于3 min的,且λm發(fā)生了藍(lán)移。這是因?yàn)镾PI發(fā)生了聚集,導(dǎo)致發(fā)色基團(tuán)被重新掩埋。當(dāng)?shù)鞍兹フ郫B后,疏水基團(tuán)暴露程度增大,蛋白質(zhì)的親油性能得到一定程度的改善,這可能影響SPI的起泡特性、乳化特性、薄膜表面的疏水性能[19]。

圖1 不同研磨時(shí)間下的SPI的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectroscopy of SPI with different grinding time

2.2 研磨時(shí)間對(duì)SPI親水性、親油性的影響

SPI表面潤(rùn)濕性(親/疏水性)可以通過(guò)接觸角來(lái)評(píng)估,它對(duì)蛋白質(zhì)的應(yīng)用特性具有重要的參考意義[20]。由圖2可知,隨著研磨時(shí)間的延長(zhǎng),SPI的親水性能先增強(qiáng)后減弱。在研磨處理6 min時(shí),SPI的親水性能達(dá)到最強(qiáng)(71.55°)。這是因?yàn)槎虝r(shí)間的研磨處理使蛋白質(zhì)分子適度舒展,蛋白質(zhì)內(nèi)部的部分極性基團(tuán)暴露,使親水性能增加。但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間(9～15 min)的研磨處理后,蛋白分子的舒展程度過(guò)大導(dǎo)致大量的疏水基團(tuán)暴露,反而使其親水性能降低[21]。由圖3可知,隨著研磨時(shí)間的延長(zhǎng),SPI的親油性能較未經(jīng)處理的有所提升。這是因?yàn)檠心ヌ幚砗?蛋白質(zhì)緊密的球狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi),蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)充分暴露。但是,當(dāng)研磨6 min時(shí),蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的聚集導(dǎo)致疏水基團(tuán)被部分掩埋,使SPI的親油性能略有下降。

注:A—F分別為研磨0、3、6、9、12、15 min。圖3、圖6同。圖2 SPI表面的水接觸角光學(xué)照片F(xiàn)ig.2 Water contact angle of the surface of SPI with different grinding time

圖3 SPI表面的油接觸角光學(xué)照片F(xiàn)ig.3 Oil contact angle of the surface of SPI with different grinding time

2.3 研磨時(shí)間對(duì)SPI起泡性能的影響

起泡能力和泡沫穩(wěn)定性是衡量物質(zhì)是否適用于充氣食品的關(guān)鍵評(píng)估指標(biāo)[22]。由圖4可知,研磨處理后,SPI的FC和FS有所提升。當(dāng)研磨15 min時(shí),SPI的FC增加至156.21%,FS增加至82.33%。這是因?yàn)檠心ヌ幚砗?蛋白質(zhì)緊密的球狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi),具有了較為靈活的結(jié)構(gòu),有利于提升蛋白質(zhì)的界面吸附能力。但是,當(dāng)研磨6 min時(shí),蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的聚集阻止了蛋白分子的展開(kāi),這并不利于界面蛋白質(zhì)的吸附,使SPI的FC(131.24%)和FS(62.71%)略有下降。

圖4 不同研磨時(shí)間下的SPI的起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig.4 Foaming capacity and stability of SPI with different grinding time

2.4 研磨時(shí)間對(duì)SPI成膜性能的影響

2.4.1 薄膜的結(jié)構(gòu)

所有SPI薄膜的紅外光譜都顯示出了與SPI骨架結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的特征譜帶。在3 274 cm-1附近主要與O—H和N—H的拉伸振動(dòng)(酰胺A峰)有關(guān)[23],在1 537 cm-1附近主要與C—N拉伸振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)(酰胺Ⅱ峰)有關(guān)。由圖5可知,隨著研磨時(shí)間的延長(zhǎng),SPI膜的酰胺A峰和酰胺Ⅱ峰轉(zhuǎn)移到低波數(shù)方向。當(dāng)研磨15 min時(shí),這兩個(gè)峰的位置分別轉(zhuǎn)移至3 271 cm-1和1 531 cm-1。這說(shuō)明研磨處理后的SPI在制備薄膜的過(guò)程中,會(huì)形成更多的氫鍵,有助于制備具有更均勻表面、更好機(jī)械性能、更具凝聚力的SPI薄膜[24]。當(dāng)研磨6 min時(shí),酰胺A峰和酰胺Ⅱ峰略微轉(zhuǎn)移到高波數(shù)方向。這說(shuō)明蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的聚集會(huì)阻止蛋白分子的展開(kāi),并不利于薄膜中氫鍵的形成。

圖5 不同研磨時(shí)間下的SPI制備的薄膜的FT-IR光譜Fig.5 FT-IR spectroscopy of the films prepared by SPI with different grinding time

2.4.2 薄膜的光學(xué)特性

薄膜的顏色參數(shù)(L*、a*、b*和ΔE)是影響消費(fèi)者接受度的重要因素。由表1可知,研磨處理使L*增加,a*和b*減小。說(shuō)明與未經(jīng)處理的SPI制備的薄膜相比,研磨處理能夠使薄膜具有更強(qiáng)的白色和減弱的黑色、綠色和黃色。在研磨15 min時(shí),ΔE達(dá)到了2.74。Saricaoglu等[23]研究發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)處理使蛋白粒徑降低,薄膜顏色發(fā)生了相同改變。這表明研磨處理可以達(dá)到和高壓均質(zhì)處理相同的效果。

表1 不同研磨時(shí)間下的SPI制備的薄膜的光學(xué)特性Table 1 Optical properties of films prepared by SPI with different grinding time

透明度數(shù)值越高,薄膜越不透明或渾濁[25]。由表1可知,未經(jīng)研磨處理的SPI膜的透明度為0.88,研磨處理后薄膜的透明度顯著降低。當(dāng)研磨15 min時(shí)透明度下降至0.52。這是因?yàn)檠心ヌ幚砗?SPI能夠更加均勻地分散在成膜液中,膜具有更加均勻、致密的微觀結(jié)構(gòu)。研磨處理6 min時(shí),薄膜的透明度略增。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中出現(xiàn)的聚集導(dǎo)致成膜液的均勻性較差,使制備的膜輕微變暗,并使光線難以穿過(guò)基質(zhì),膜較不透明[26]。

2.4.3 薄膜的物理化學(xué)性質(zhì)

由表2可知,研磨使SPI薄膜的MC顯著降低。當(dāng)研磨15 min時(shí),MC顯著降低至21.62%。這是因?yàn)檠心ヌ幚硎筍PI的結(jié)構(gòu)展開(kāi),有助于創(chuàng)造更多的蛋白質(zhì)空間,使增塑劑(甘油)能夠更多地滲透到蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中,增強(qiáng)了甘油和SPI的羥基和酰胺基之間的氫鍵,從而降低了SPI和水分子之間的相互作用,因而在干燥過(guò)程中會(huì)損失更多的水分。由表2可知,研磨處理后,SPI薄膜的TSM與未處理的TSM沒(méi)有顯著性差異。這與高強(qiáng)度超聲制備豌豆分離蛋白膜中TSM結(jié)果相同[26]。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是在SPI薄膜的制備過(guò)程中,表面疏水性的增加對(duì)薄膜TSM的影響與溶解度的增加對(duì)TSM的影響可能相互抵消,從而導(dǎo)致薄膜的TSM沒(méi)有出現(xiàn)顯著性差異。

表2 不同研磨時(shí)間下的SPI制備的薄膜的物理化學(xué)性質(zhì)和機(jī)械性能Table 2 Physicochemical properties and mechanical properties of films prepared by SPI with different grinding time

同時(shí),研磨處理后,SPI薄膜的WVP顯著下降,這是因?yàn)檠心ヌ幚砗?由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變,內(nèi)部的疏水基團(tuán)大量暴露,降低了水分子通過(guò)薄膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)的吸附和擴(kuò)散速率[27]。同時(shí)因?yàn)檠心ズ蟮腟PI薄膜更均勻致密,孔隙或裂縫更少,所以WVP也會(huì)下降。

2.4.4 薄膜的機(jī)械性能

薄膜的實(shí)用性在很大程度上受到TS和EAB的影響。由表2可知,當(dāng)研磨15 min時(shí),SPI薄膜的TS和EAB均增大(2.24 MPa、178.70%),這是因?yàn)檠心ヌ幚砗?SPI的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,增加了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與甘油之間的相互作用,這有助于薄膜三維網(wǎng)絡(luò)的形成。在薄膜干燥階段,分子間會(huì)形成更多的二硫鍵、疏水鍵和氫鍵,使薄膜的機(jī)械性能得到改善[28]。在研磨處理6 min時(shí),SPI薄膜的TS和EAB略微減小,這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)發(fā)生的輕微團(tuán)聚并不利于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與甘油之間的相互作用。在薄膜干燥階段,形成的二硫鍵、疏水鍵和氫鍵較少,從而影響了薄膜的機(jī)械性能。

2.4.5 薄膜的微觀結(jié)構(gòu)

掃描電子顯微鏡可以用來(lái)觀察SPI薄膜的微觀結(jié)構(gòu)。由圖6可知,未經(jīng)研磨處理的薄膜表面較為平坦,但呈現(xiàn)出了較多的非連續(xù)裂紋,這會(huì)降低薄膜的機(jī)械性能(表2)。當(dāng)研磨處理3～6 min時(shí),薄膜表面較為粗糙,表面出現(xiàn)凸起,但薄膜表面的裂紋變少,結(jié)構(gòu)變得更加致密、均勻。其中,研磨處理6 min時(shí)的薄膜表面會(huì)有較多的未溶解顆粒沉積,可見(jiàn),此時(shí)蛋白質(zhì)確實(shí)發(fā)生了輕微團(tuán)聚。隨著研磨時(shí)間的延長(zhǎng)(9～15 min),薄膜表面未見(jiàn)明顯裂紋,結(jié)構(gòu)更加致密、均勻,同時(shí)機(jī)械性能顯著提高(表2)。可見(jiàn),研磨處理能夠改善薄膜的微觀結(jié)構(gòu),使薄膜結(jié)構(gòu)更加致密、均勻。

圖6 不同研磨時(shí)間下的SPI制備的薄膜的掃描電鏡圖Fig.6 SEM characterization of the films prepared by SPI with different grinding time

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)SPI進(jìn)行研磨處理,得到不同處理時(shí)間的蛋白樣品,并對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和成膜性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明,研磨處理后,SPI緊密的球狀結(jié)構(gòu)發(fā)生了去折疊,蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)充分暴露,蛋白質(zhì)具有了更高的疏水性能。由于蛋白結(jié)構(gòu)的改變,提升了蛋白質(zhì)的界面吸附能力,SPI的起泡性能得到改善。通過(guò)對(duì)薄膜相關(guān)性能進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn),研磨處理能夠顯著改善SPI薄膜的成膜性,薄膜表面的裂紋變少,結(jié)構(gòu)變得更加致密、均勻,薄膜的光學(xué)性能、物理化學(xué)性能和機(jī)械性能得到提升。作者制備了一種高起泡和較強(qiáng)成膜性能的大豆分離蛋白,可為今后研究植物蛋白綠色改性技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。此外,由于功能性質(zhì)之間存在關(guān)聯(lián)性,研磨處理對(duì)大豆分離蛋白其他功能性質(zhì)(乳化特性、凝膠特性等)的影響及其作用機(jī)理尚不明確,有待于進(jìn)一步研究。