楊蘭蘭，金衛(wèi)華*，王安奎，高月娥，李金存，劉美艷

（1.昆明市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明 650106；2.云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院，云南昆明 650212；3.尋甸縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明 655200）

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的感染牛、羊等偶蹄動(dòng)物的一種接觸性、急性和烈性傳染病，一旦發(fā)生疫情，將會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)將其規(guī)定為一類動(dòng)物疫病和強(qiáng)制免疫病種，世界衛(wèi)生組織也將其列為A 類傳染病之首。作為世界流行性的動(dòng)物疫病，目前已發(fā)現(xiàn)了80多個(gè)口蹄疫病毒亞型，我國(guó)以O(shè) 型為主，少見(jiàn)A型。我國(guó)在養(yǎng)殖生產(chǎn)中對(duì)口蹄疫防控主要以預(yù)防為主，實(shí)施春秋兩季集中強(qiáng)制免疫口蹄疫疫苗，這是預(yù)防該病重要措施。

本研究前期通過(guò)在昆明市范圍內(nèi)隨機(jī)選取42家規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）、采集854 份血清樣品進(jìn)行O型口蹄疫免疫抗體監(jiān)測(cè)，群體免疫抗體合格率僅為68.7%，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。一定程度上表明在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，因免疫間隔時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，僅靠春秋兩季集中免疫不能做到口蹄疫抗體保護(hù)水平常年維持在70%以上，可能存在發(fā)生口蹄疫疫情風(fēng)險(xiǎn)的隱患。因此，本研究通過(guò)在犢牛和能繁母牛中開(kāi)展O 型口蹄疫免疫效果試驗(yàn)，免疫前后定期采集牛只血清，采用ELISA 方法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)免疫抗體水平，準(zhǔn)確掌握口蹄疫疫苗免疫效果，摸清口蹄疫抗體消長(zhǎng)規(guī)律，進(jìn)而制定科學(xué)的口蹄疫免疫程序并進(jìn)行推廣應(yīng)用，有效提高口蹄疫綜合防控水平。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和時(shí)間

2021 年8 月—2022 年7 月，在昆明市某規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)開(kāi)展口蹄疫免疫程序優(yōu)化試驗(yàn)。該場(chǎng)嚴(yán)格落實(shí)生物安全措施，飼養(yǎng)管理規(guī)范，專人負(fù)責(zé)飼喂，實(shí)行定期消毒。每年3 月和9 月按國(guó)家要求實(shí)行口蹄疫強(qiáng)制免疫。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

選擇健康犢牛20 頭，90 日齡左右、未接種過(guò)口蹄疫疫苗、體重120kg 左右，隨機(jī)分成A 組和B 組2 個(gè)試驗(yàn)組，每組10 頭；隨機(jī)選取胎次為2～5 胎的健康能繁母牛30 頭，試驗(yàn)期間均正常采食和飲水，觀察并記錄試驗(yàn)動(dòng)物臨床表現(xiàn)。

1.3 試驗(yàn)疫苗

口蹄疫O 型、A 型二價(jià)滅活疫苗（OHM/02株+AKT-Ⅲ株，2021016）均購(gòu)自天康生物制藥有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 免疫時(shí)間的確定

《2021 年國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃》中指出“口蹄疫群體免疫密度應(yīng)常年保持在90%以上，其中應(yīng)免畜禽免疫密度應(yīng)達(dá)到100%，口蹄疫免疫抗體合格率應(yīng)常年保持在70%以上”。因此，為確保養(yǎng)殖場(chǎng)牲畜群體常年處于抗體保護(hù)狀態(tài)，本研究將群體免疫抗體合格率降低至70%時(shí)作為為最佳免疫時(shí)間。

1.4.2 犢牛免疫程序試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首次免疫。采集試驗(yàn)犢牛頸靜脈血進(jìn)行口蹄疫O 型母源抗體監(jiān)測(cè)，確定犢牛首免時(shí)間，免疫劑量分別為A 組1mL/頭、B 組2mL/頭。首免后第30、60、90 天采集頸靜脈血，進(jìn)行口蹄疫O型免疫抗體監(jiān)測(cè)。二次免疫。首免后根據(jù)免疫抗體水平消長(zhǎng)情況，在群體免疫抗體合格率降低至70%時(shí)作為二免時(shí)間。A、B 組二免劑量均為2.0mL/頭。二免后第30、60、90、120 天采集頸靜脈血，進(jìn)行口蹄疫O 型、A 型免疫抗體監(jiān)測(cè)。加強(qiáng)免疫。二免后群體免疫抗體合格率降低至70%時(shí)作為加強(qiáng)免疫時(shí)間。A、B 組加強(qiáng)免疫劑量均為2.0mL/頭。加強(qiáng)免疫后第30、60、90、120天采集頸靜脈血，進(jìn)行口蹄疫O 型、A 型免疫抗體監(jiān)測(cè)。

1.4.3 能繁母牛免疫程序試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首次免疫。通過(guò)監(jiān)測(cè)基礎(chǔ)抗體水平確定能繁母牛首免時(shí)間，首免免疫劑量為2mL/頭。首免后第30、60、70、80、90 天采集頸靜脈血，進(jìn)行口蹄疫O 型免疫抗體監(jiān)測(cè)。二次免疫。首免后根據(jù)免疫抗體水平消長(zhǎng)情況，群體免疫抗體合格率降至70%時(shí)作為二免時(shí)間，二免免疫劑量為2mL/頭。二免后第30、60、90、120 天采集頸靜脈血，進(jìn)行口蹄疫O 型免疫抗體監(jiān)測(cè)。加強(qiáng)免疫。二免后群體免疫抗體合格率降至70%時(shí)作為加強(qiáng)免疫時(shí)間，加強(qiáng)免疫劑量為2mL/頭。加強(qiáng)免疫后第30、60、90、120、150 天采集頸靜脈血，進(jìn)行口蹄疫O 型免疫抗體監(jiān)測(cè)。

1.5 檢測(cè)試劑

口蹄疫O 型抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)博百測(cè)生物科技有限公司聯(lián)合生產(chǎn)。

1.6 檢測(cè)方法及結(jié)果判定

應(yīng)用O 型口蹄疫抗體阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒對(duì)牛血清進(jìn)行O 型口蹄疫免疫抗體監(jiān)測(cè)，具體檢測(cè)方法及結(jié)果判定均按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 犢牛免疫抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果

由表1 可知，犢牛在3 月齡時(shí)母源抗體合格率僅為15%，抗體水平幾乎為零。為確定免疫劑量對(duì)抗體水平的影響程度，本試驗(yàn)設(shè)定A、B 兩組犢牛分別免疫口蹄疫疫苗1 和2mL。A、B 兩組犢牛首免后30d 群體抗體合格率分別為60%和70%，群體平均抗體合格率為65%，已低于70%的臨界抗體保護(hù)水平。B 組犢牛免疫抗體水平略高于A 組，在免疫時(shí)應(yīng)注射劑量應(yīng)選擇2mL為佳。首免后犢牛群體高抗體水平維護(hù)時(shí)間較短，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行第二次免疫。

表1 犢牛首免后口蹄疫O 型抗體檢測(cè)結(jié)果

選取犢牛首免后30d 作為二免時(shí)間。由表2可知，二免后犢牛的群體免疫抗體合格率迅速上升，在30d 時(shí)就達(dá)到很高水平，A、B 兩組分別為90%和100%，群體平均免疫抗體水平為95%；之后又逐漸升高，在60d 時(shí)達(dá)到頂峰，群體免疫抗體合格率均為100%，這種頂峰一直維持到90d；隨后又逐漸下降，A、B 兩組在120d 時(shí)群體抗體合格率分別降至70%和80%，群體免疫抗體合格率為75%，已接近70%的臨界保護(hù)水平，二免免疫期持續(xù)4 個(gè)月，這時(shí)應(yīng)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

表2 犢牛二免和加強(qiáng)免疫后口蹄疫O 型抗體檢測(cè)結(jié)果

選取犢牛二免后120d 作為加強(qiáng)免疫時(shí)間。由表2 可知，加強(qiáng)免疫后犢牛群體免疫抗體水平在30d 時(shí)就達(dá)到頂峰，一直維持到90d；之后逐漸下降，A、B 兩組在120d 時(shí)群體免疫抗體合格率分別降至80%和90%，群體平均抗體合格率為85%，免疫期持續(xù)了4 個(gè)月。

2.2 能繁母牛免疫抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果

由表3 可知，首次采樣時(shí)能繁母?？谔阋逴型免疫抗體水平僅為63.3%，已低于70%的抗體保護(hù)水平，需盡早盡快進(jìn)行免疫。在本試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)30 頭能繁母牛進(jìn)行口蹄疫首次免疫，在30d 時(shí)抗體合格率達(dá)到90%的高水平，之后在60d 降低至73.3%，70d 時(shí)降至66.7%，在第70d時(shí)進(jìn)行二次免疫，提高抗體水平。

表3 能繁母牛首免后口蹄疫O 型抗體檢測(cè)結(jié)果

選取能繁母牛首免后60d 作為二免時(shí)間。由表4 可知，能繁母牛二免后30d 群體免疫抗體水平為83.3%，在60d 時(shí)快速升高至96.7%，隨后逐漸下降，在90d 時(shí)降至80%，120d 時(shí)達(dá)到70%的臨界保護(hù)水平，這時(shí)應(yīng)及時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。二免免疫期持續(xù)了4 個(gè)月。

表4 能繁母牛二免后口蹄疫O 型抗體檢測(cè)結(jié)果

選取能繁母牛二免后120d 作為加強(qiáng)免疫時(shí)間。由表5 可知，能繁母牛在加強(qiáng)免疫后第30d、60d 群體免疫抗體水平逐漸上升，抗體合格率分別為83.3%和93.3%；在90d 時(shí)抗體水平達(dá)到最高峰，群體抗體合格率達(dá)為100%；隨后在120d和150d 逐漸下降，群體抗體合格率分別降至86.7%和73.3%，免疫期持續(xù)了4 個(gè)月。

表5 能繁母牛加強(qiáng)免疫后口蹄疫O 型抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論

口蹄疫免疫抗體監(jiān)測(cè)是科學(xué)評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗免疫質(zhì)量的有效手段，也是科學(xué)制定口蹄疫免疫程序的重要依據(jù)。若體內(nèi)抗體沒(méi)有達(dá)到保護(hù)水平也就是處于免疫空白期時(shí)，容易受到口蹄疫病毒的感染。犢牛出生后隨著母乳的持續(xù)攝入，體內(nèi)會(huì)在一定時(shí)間內(nèi)維持一定量的母源抗體，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，母源抗體水平會(huì)逐漸下降，甚至低于保護(hù)水平。為保障畜牧業(yè)生產(chǎn)安全、動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全、公共衛(wèi)生安全、生態(tài)安全“四個(gè)安全”，結(jié)合當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫實(shí)際，根據(jù)實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)犢牛和能繁母?？谔阋呖贵w水平，對(duì)現(xiàn)執(zhí)行的口蹄疫免疫程序進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，提高規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)牛群群體免疫保護(hù)力。

本研究表明，犢牛90 日齡母源抗體水平僅為15%，幾乎為零，存在較大的疫病感染風(fēng)險(xiǎn)，犢牛需盡快進(jìn)行首免[1]。首免后30d A 組和B 組免疫抗體水平分別為60%和70%，說(shuō)明首免后抗體在體內(nèi)存在時(shí)間較短，這與王雪偉等[2]人研究結(jié)果基本一致，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行第二次免疫，且免疫劑量以B 組的2mL 為最佳，后續(xù)A 組和B 組的免疫劑量均為2mL。二免后抗體水平迅速上升并在第60天時(shí)達(dá)到高峰100%，這與仇普斌等研究一致[3]，隨后逐漸下降，第120 天平均群體免疫抗體合格率降至75%，接近抗體臨近保護(hù)水平，這時(shí)可以進(jìn)行加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后高抗體水平維持時(shí)間較長(zhǎng)，在第120 天時(shí)群體平均抗體合格率依然達(dá)85%。

該場(chǎng)按照國(guó)家要求執(zhí)行春秋兩季集中強(qiáng)制免疫，首次采樣時(shí)能繁母牛群體免疫抗體合格率已低于臨界保護(hù)水平，首免后30d 群體抗體合格率為90%，在第70 天降至66.7%，這時(shí)進(jìn)行第二次免疫，與王忠山等[4]研究存在一定差別，這可能與有些能繁母牛在生產(chǎn)后未能及時(shí)免疫，在這次免疫后免疫抗體水平維持時(shí)間短造成。二免和加強(qiáng)免疫后高抗體水平均能維持較長(zhǎng)時(shí)間，一直到第120 天抗體水平才接近臨界保護(hù)值。

4 結(jié)論

從上述分析可以看出，規(guī)模場(chǎng)內(nèi)90 日齡犢牛在首次免疫30d 后需進(jìn)行第二次免疫，以后每隔4 個(gè)月免疫1 次。能繁母牛實(shí)施每年3 次的口蹄疫疫苗免疫，也就是每年3 月、7 月、11 月分別進(jìn)行免疫，確保場(chǎng)內(nèi)牛群可以常年處于高免狀態(tài)。