熊 飛 曹經(jīng)江

(三峽大學附屬仁和醫(yī)院皮膚科,湖北省宜昌市 443000)

激素依賴性皮炎是長期不規(guī)范局部使用糖皮質激素制劑導致用藥期間皮膚疾病消失,而停藥后出現(xiàn)皮膚損傷的一類炎癥性皮膚疾病[1-2]。此類患者的臨床表現(xiàn)主要為丘疹、紅斑、痤瘡樣或酒糟鼻樣皮疹,常伴有脫屑、干燥、灼痛、瘙癢等表現(xiàn)[3]。目前,臨床上主要采用免疫抑制劑或激素類藥物遞減等方法進行治療,但效果并不顯著,部分患者短期內會出現(xiàn)反跳現(xiàn)象,且出現(xiàn)不同程度的副作用[4-6]。中醫(yī)具有整體觀和辨證論治兩大特點,中醫(yī)認為激素依賴性皮炎屬于“中藥毒”范疇,病機為風、熱、毒邪阻滯面部,治療應以清熱涼血、解毒、祛風止癢為主要原則,中醫(yī)藥內服、中藥外用、中西醫(yī)結合、針灸均可改善面部皮損[7]。我院院內制劑榆黃湯由黃柏、地榆、野菊花、蒲公英、黃芩組成,具有清熱利濕、解毒的功效。前期臨床研究已證實榆黃湯對面部變應性接觸性皮炎的療效顯著[8],但是關于其治療激素依賴性皮炎的臨床數(shù)據(jù)較少。因此,本研究使用豚鼠建立激素依賴性皮炎模型,基于體內研究探討榆黃湯治療激素依賴性皮炎的效果及可能機制,從而為臨床上治療激素依賴性皮炎提供相關依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康豚鼠40只,體重(300±20)g,雌雄各半,月齡3～5個月,購自湖北省實驗動物中心[SCXN(鄂)2010-0041]。于無菌、溫度為18 ℃～22 ℃、濕度為40%～70%的環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲食,每12 h光暗交替。

1.2 主要藥物和試劑 榆黃湯湯劑由三峽大學附屬仁和醫(yī)院制備,湯劑組成包括地榆30 g、 黃柏30 g、 黃芩20 g、 蒲公英20 g、 野菊花20 g, 加水10 L, 武火煎煮20 min后文火煎煮40 min,過濾后得中藥煎液5 L,低溫保存。鹵米松乳膏購自重慶華邦制藥有限公司(國藥準字:H20153118),他克莫司軟膏購自四川明欣藥業(yè)有限責任公司(國藥準字:H20123430),IgE ELISA試劑盒、白細胞介素(interleukin,IL)-6 ELISA試劑盒、IL-8 ELISA試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司(批號:042911、170924、092743),CD8+T淋巴細胞分選試劑盒購自北京匯智和源生物技術有限公司(批號:A001417)。

1.3 建模方法 采用隨機數(shù)字表法將40只豚鼠分為藥物對照組、實驗組、模型組和空白對照組,每組10只。于實驗前24 h給予各組豚鼠背部去毛,范圍約3 cm×3 cm?？瞻讓φ战M不做處理,將鹵米松乳膏涂于藥物對照組、實驗組和模型組豚鼠背部,2次/d,連續(xù)外用15 d,構建激素依賴性皮炎模型。停藥3 d后,涂藥區(qū)域出現(xiàn)紅斑、腫脹等炎癥反應則表明造模成功,本研究30只豚鼠均造模成功。

1.4 干預方法 造模成功后7 d,給予藥物對照組豚鼠皮損部位涂抹他克莫司軟膏,早晚各1次,連續(xù)干預21 d;給予實驗組豚鼠皮損部位冷敷榆黃湯紗條(浸透榆黃湯湯劑的醫(yī)用紗布,大小超過背部皮損)20 min,早晚各1次,連續(xù)干預21 d;給予模型組豚鼠皮損部位冷噴生理鹽水20 min,早晚各1次,連續(xù)干預21 d。空白對照組不做處理。

1.5 觀察指標 (1)干預21 d后,完成其他指標檢測后處死豚鼠,取背部皮損組織(空白對照組取去毛處皮膚組織),置于多聚甲醛固定液進行固定,然后依次進行沖洗、酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色,在顯微鏡(OLYMPUS公司,型號:BH-2)下觀察皮膚各層細胞變化情況,并采用VISIA?皮膚檢測系統(tǒng)(Canfield Scientific,Inc.)測量表皮層、真皮層厚度(單位為μm)。(2)造模成功后,于干預前及干預21 d后采用生理鹽水清洗豚鼠皮損處皮膚(清洗空白對照組豚鼠去毛處皮膚)并擦干,用適當力度將皮脂測試分析儀(Courega+Khazaka electronic GmbH,型號:Sebumeter?SM 815)的探頭垂直于皮膚表面測量油脂含量,連續(xù)測量3次取平均值。(3)造模成功后,于干預前及干預21 d后,抽取豚鼠尾部靜脈血0.5 mL(共2管)。其中,一管血標本于4℃下以3 000 r/min離心10 min后獲得血清,采用ELISA檢測血清IgE、IL-6、IL-8水平。另一管血標本經(jīng)肝素抗凝后,取100 μL全血加入檢測管中,并加入CD8+單標單克隆抗體(10 μg/mL),避光孵育20 min后,用PBS洗滌1次,再用0.5mL PBS重懸,采用流式細胞儀(Becton,Dickinson and Company,型號:FACSCantoⅡ)檢測CD8+T淋巴細胞比例。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗,組內比較采用配對樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結 果

2.1 4組豚鼠皮損組織HE染色結果的比較 HE染色結果顯示,空白對照組豚鼠去毛處皮膚組織的表皮層細胞排列整齊,真皮層膠原纖維排列整齊、均一;模型組豚鼠皮損組織過度角化,表皮棘層增厚,且棘層細胞水腫,真皮層存在大量炎癥細胞;藥物對照組和實驗組豚鼠皮損組織的角質層增厚,棘層細胞水腫情況有所減輕,真皮層炎性細胞浸潤減少,兩組HE染色結果無明顯差異。見圖1。

圖1 HE染色結果(×400)

2.2 4組豚鼠表皮厚度及真皮厚度的比較 相較于空白對照組,模型組、藥物對照組及實驗組豚鼠的表皮厚度和真皮厚度更薄(均P<0.05);相較于模型組,藥物對照組及實驗組豚鼠的表皮厚度和真皮厚度更厚(均P<0.05);藥物對照組和實驗組豚鼠的表皮厚度和真皮厚度差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 4組豚鼠表皮厚度及真皮厚度的比較(x±s,μm)

2.3 干預前后4組豚鼠皮膚油脂含量的比較 干預前,相較于空白對照組,藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠皮膚油脂含量均更低(均P<0.05),而藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠皮膚的油脂含量差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。干預21 d后,藥物對照組及實驗組豚鼠皮膚油脂含量均較干預前增加(均P<0.05);相較于空白對照組,藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠皮膚油脂含量均更低(均P<0.05);相較于模型組,藥物對照組及實驗組豚鼠皮膚油脂含量均更高(均P<0.05);而藥物對照組與實驗組豚鼠皮膚油脂含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 干預前后4組豚鼠皮膚油脂含量的比較(x±s,μg/cm2)

2.4 干預前后4組豚鼠血清IgE水平的比較 干預前,相較于空白對照組,藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠血清IgE水平均更高(均P<0.05),而藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠血清IgE水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。干預21 d后,藥物對照組及實驗組豚鼠血清IgE水平均較干預前下降(均P<0.05);相較于空白對照組,藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠血清IgE水平均更高(均P<0.05);相較于模型組,藥物對照組及實驗組豚鼠血清IgE水平均更低(均P<0.05);而藥物對照組與實驗組豚鼠血清IgE水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 干預前后4組豚鼠血清IgE水平的比較(x±s,mg/L)

2.5 干預前后4組豚鼠外周血CD8+T淋巴細胞比例的比較 干預前,相較于空白對照組,藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠外周血CD8+T淋巴細胞比例均更低(均P<0.05),而藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠外周血CD8+T淋巴細胞比例差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。干預21 d后,藥物對照組及實驗組豚鼠外周血CD8+T淋巴細胞比例均較干預前上升(均P<0.05);相較于空白對照組,藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠外周血CD8+T淋巴細胞比例均更低(均P<0.05);相較于模型組,藥物對照組及實驗組豚鼠外周血CD8+T淋巴細胞比例均更高(均P<0.05);而藥物對照組與實驗組豚鼠外周血CD8+T淋巴細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 干預前后4組豚鼠外周血CD8+T淋巴細胞比例的比較(x±s,%)

2.6 干預前后4組豚鼠血清IL-6、IL-8水平的比較 干預前,相較于空白對照組,藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠血清IL-6、IL-8水平均更高(均P<0.05),而藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠血清IL-6、IL-8水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。干預21 d后,藥物對照組及實驗組豚鼠血清IL-6、IL-8水平均較干預前下降(均P<0.05);與空白對照組比較,藥物對照組、實驗組及模型組豚鼠血清IL-6、IL-8水平均更高(均P<0.05);相較于模型組,藥物對照組及實驗組豚鼠血清IL-6、IL-8水平均更低(均P<0.05);而藥物對照組與實驗組豚鼠血清IL-6、IL-8水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表5。

表5 干預前后4組豚鼠血清IL-6、IL-8水平的比較(x±s,ng/L)

3 討 論

激素依賴性皮炎是停用長期外用的糖皮質激素制劑后導致原有皮膚病復發(fā)或加重,迫使患者再次使用糖皮質激素制劑治療的疾病[9-11]。激素依賴性皮炎患者的病情反復且難以痊愈,特別是面部激素依賴性皮炎可能導致毀容,不僅給患者帶來巨大的經(jīng)濟負擔,而且嚴重影響患者的心理健康[9,12]。

中醫(yī)將激素依賴性皮炎歸于“中藥毒”范疇,風邪侵襲為本病的病機之一[13]。激素依賴性皮炎的皮損常見于面部,并可使得面部皮膚敏感性增加,患者表現(xiàn)為怕風、不耐寒熱,這也進一步佐證風邪侵襲為該病病機之一。但風邪多不單獨致病,常與濕熱相結合。此外,激素類藥物屬辛燥、甘溫之品,長期使用可助陽生熱、傷津傷陰,以致毒熱之邪侵襲[5,14]。榆黃湯為我院院內制劑,主要成分為地榆、黃柏、黃芩、野菊花、蒲公英。地榆可解毒斂瘡、止血涼血,具有抗氧化、抗菌、抗炎、調節(jié)免疫功能等作用,可作為燒傷、燙傷等外傷常用藥[15]。黃柏和黃芩均具有瀉火解毒、清熱燥濕之功效?，F(xiàn)代藥理學表明,黃柏具有局部抗炎、抗感染、清除自由基等作用,并可抑制致病菌的增殖和定植;黃芩的主要作用成分為黃芩素,具有抗氧化、增強或抑制免疫功能雙向調節(jié)作用[8]。黃柏與黃芩合用可增強清熱解毒的功效[16]。野菊花和蒲公英均為治療疔瘡癰腫的中藥。野菊花的主要活性成分為萜類、揮發(fā)油和黃酮類化合物,具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤、清除氧自由基等作用[8]。蒲公英的主要成分為揮發(fā)油、黃酮類,同樣具有抗腫瘤、抗炎等功效[17]。諸藥合用,共奏清熱解毒、祛風止癢之功。本研究結果表明,激素依賴性皮炎豚鼠的皮損組織炎癥浸潤明顯,皮損處油脂含量減少,表皮及真皮變薄,而經(jīng)榆黃湯干預后,激素依賴性皮炎豚鼠的皮損組織炎癥及棘層細胞水腫、毛細血管擴張等情況明顯減輕,皮損處油脂含量、表皮厚度及真皮厚度增加,且作用效果與西藥他克莫司相似。這說明榆黃湯對激素依賴性皮炎具有較好的干預作用。

長期使用激素類藥物可抑制表皮細胞的增殖、分化等,進而影響皮膚屏障功能,再加上外界因素的刺激,可導致皮炎復發(fā),此時機體炎癥介質過度表達,血清IgE水平顯著上升[18]。此外,激素類藥物還可抑制巨噬細胞功能,導致外周血CD8+T淋巴細胞比例降低,CD4+/CD8+值失衡[18]。而CD8+T淋巴細胞比例下降可誘發(fā)大量炎癥因子如IL-6、IL-8等的釋放,進而破壞血管內皮細胞結構、功能,促進皮炎的發(fā)生[19]。本研究結果顯示,激素依賴性皮炎豚鼠的血清IgE、IL-6、IL-8水平上升,而外周血CD8+T淋巴細胞比例有所下降;經(jīng)他克莫司或榆黃湯干預后,激素依賴性皮炎豚鼠的血清IgE、IL-6、IL-8水平均有所下降,而外周血CD8+T淋巴細胞比例有所上升,且兩種藥物效果相似。這說明榆黃湯可減輕激素依賴性豚鼠的炎癥反應,并可改善其免疫功能。

綜上所述,榆黃湯對激素依賴性皮炎豚鼠模型具有較好的干預作用,其機制可能與減輕機體炎癥反應、改善免疫功能有關。榆黃湯的作用效果與他克莫司相似,或許可作為免疫抑制劑的替代藥物,用于治療激素依賴性皮炎。