王 方，王曉宇

(沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司，遼寧 沈陽 110000)

辛硫磷，又稱“肟硫磷” “克辛” “倍氰松”[1]，是一種廣譜、低毒、高效、低殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥[2，3]，是比較理想的驅(qū)蟲藥品種之一。辛硫磷對害蟲具有較強(qiáng)的殺傷作用，具有環(huán)保、成本低、低毒性和高效的原則，如天牛干性害蟲等，其防治作用主要來源于對害蟲的直接胃毒性、觸殺性及黑暗條件下殘效長特性[4]。隨著辛硫磷在制劑技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，辛硫磷澆潑劑研制成功，規(guī)模生產(chǎn)成本降低，辛硫磷在市場上需求量日益增加。辛硫磷澆潑可以通過皮膚滲透給藥，滲透藥量能夠保證驅(qū)蟲效果，通過皮膚給藥途徑的藥物不需要破壞通過胃腸道的消化液，生物利用度有所提高，同時(shí)避免了肝臟首過效應(yīng)。澆潑劑還具有動(dòng)物保定容易、給藥方便、對動(dòng)物刺激小等優(yōu)點(diǎn)，該劑型是草原放牧條件下對群體牛防治寄生蟲的理想劑型[5]。

辛硫磷澆潑劑具有殺蟲效果好，毒性弱、殺蟲范圍廣、藥效持久等特點(diǎn)，對害蟲有強(qiáng)觸殺及胃毒作用。目前大量研究表明，辛硫磷澆潑劑對于豬疥螨病、牛皮蠅、癩皮病、羊螨病等家畜各種體表外寄生蟲病有較好的殺滅和治療效果。殺滅周圍環(huán)境的蠅、蚊、虱、蜱、蟑螂、臭蟲等[6]。澆潑劑的使用以涂擦、澆注等方式作用于畜體皮膚或采用浸浴的辦法，環(huán)境殺蟲采用噴灑施藥。但目前市面上的辛硫磷澆潑劑透皮性能較差，刺激性強(qiáng)，難以有效殺滅寄生在動(dòng)物皮下的寄生蟲。

透皮吸收促進(jìn)劑是指能夠滲透進(jìn)入皮膚降低藥物通過皮膚阻力的材料，可以輔助藥物穿過角質(zhì)層、擴(kuò)散通過皮膚，由毛細(xì)血管進(jìn)入體循環(huán)，達(dá)到局部用藥全身起效的作用，發(fā)揮全身系統(tǒng)治療作用。目前，市場上新型透皮制劑也很多，如復(fù)方左旋咪唑、阿維菌素、伊維菌素、環(huán)丙沙星等，對于各類體內(nèi)及體表的寄生蟲均有驅(qū)殺效果。為了突破某些動(dòng)物皮厚毛多的皮膚屏障結(jié)構(gòu)，在獸藥的研發(fā)過程中透皮吸收促進(jìn)劑是一種尤為重要的劑型，需要利用目前研究比較先進(jìn)的微乳技術(shù)、脂質(zhì)體、納米粒等透皮制劑技術(shù)，研發(fā)透皮制劑的關(guān)鍵是解決藥物的透皮問題。

本研究以辛硫磷為原料藥，結(jié)合透皮吸收促進(jìn)劑，制備出高皮膚滲透性辛硫磷澆潑劑，初步評(píng)價(jià)了其體外透皮效果和臨床治療效果。本研究首先以體外皮膚累計(jì)滲透量為指標(biāo)，采用Franz 擴(kuò)散池法建立鼠透皮試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚7]，運(yùn)用高效液相色譜法(HPLC) 測定透過液中辛硫磷的含量，評(píng)價(jià)本公司辛硫磷澆潑劑產(chǎn)品(浴舒嘉) 透皮效果，并與市售普通40%辛硫磷澆潑溶液進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果顯示本公司產(chǎn)品浴舒嘉具有良好的透皮效果，且臨床藥效試驗(yàn)結(jié)果顯示產(chǎn)品性能更優(yōu)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品(北京德威鈉生物技術(shù)有限公司)、40%辛硫磷澆潑溶液(商品名為浴舒嘉，批號(hào)20040801)、市售普通40%辛硫磷澆潑溶液液(批號(hào)2371101)、色譜甲醇，色譜乙腈、異丙醇(天津市康科德科技有限公司)、生理鹽水。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 TP - 6 智能透皮擴(kuò)散儀(天津精拓儀器科技有限公司)； 電子天平(FA-1104 型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)； 高效液相色譜儀(LC -10AD 型，大連依利特分析儀器有限公司)； 超聲波清洗儀器(DL-180 型，寧波新芝生物科技股份有限公司)； 高速臺(tái)式離心機(jī)(TGL -16G 型，上海安亭科學(xué)儀器廠)； 循環(huán)水多用真空泵(西安太康生物科技有限公司)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種雄性小鼠20只，體重18 ～24 g (遼寧長生生物技術(shù)有限公司)； 母豬80 頭，體重50 ～80 kg。

1.1.4 辛硫磷體外高效液相色譜法(HPLC)分析方法學(xué)建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立: 精密稱取辛硫磷對照品，配置質(zhì)量濃度為0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5 和5.0 mg?mL-1的梯度對照品溶液，進(jìn)行高效液相色譜檢測，于260 nm 紫外波長處測定吸光度值(A)，建立質(zhì)量濃度(C) 與吸光度(A) 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度試驗(yàn): 精密稱取辛硫磷對照品，配制成濃度為0.05，0.5 和5.0 mg?mL-1的梯度溶液，按5 次/d 統(tǒng)計(jì)日內(nèi)誤差； 同法1 次/d測定5 d，統(tǒng)計(jì)日間誤差。

回收率試驗(yàn): 精密稱取辛硫磷對照品，配制成濃度為0.05，0.5 和5.0 mg?mL-1的梯度溶液，每組設(shè)置5 個(gè)平行組別，進(jìn)行高效液相色譜檢測，于260 nm 紫外波長處測定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算數(shù)值對比統(tǒng)計(jì)各梯度濃度回收率平均值及RSD 值。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體外透皮試驗(yàn)

離體鼠皮的制備: 取昆明系小鼠，斷頸處死后，立即刮凈腹部毛發(fā)，剪取腹部皮膚，將取下的皮膚小心去除結(jié)締組織、皮下脂肪層，用生理鹽水沖洗，沖洗干凈后放置于盛有生理鹽水的容器中，放置在4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?，試?yàn)前需要自然解凍，并浸泡在生理鹽水中0.5 h，解凍后在1 周內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。每次試驗(yàn)前仔細(xì)檢查鼠皮是否完整，保證不存在任何劃痕和破損。

陰性干擾試驗(yàn): 鼠皮膚固定于擴(kuò)散池中，并按角質(zhì)層向上放置。各加入等量的接收液，試驗(yàn)24 h 取出100 μL 接收液更換為等體積的標(biāo)準(zhǔn)品、空白接收液、空白接收液＋標(biāo)準(zhǔn)品[8]以考察接收液對本試驗(yàn)的影響。

體外透皮擴(kuò)散試驗(yàn): 采用Franz 擴(kuò)散池，接收池的有效滲透面積2.58 cm2，將處理好的小鼠皮膚用剪刀剪裁成適合尺寸，置于擴(kuò)散池與接收池之間，用夾子固定，皮膚的真皮層要與接收液接觸，需要將氣泡排除，接收液為異丙醇: 生理鹽水(50/50，v/v) 17.8 mL，擴(kuò)散池中分別加入浴舒嘉、市售普通40%辛硫磷澆潑溶液各3 mL，裝置恒溫水浴中 (37 ±1)℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為350 r/min，于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 分別取樣0.5 mL，并隨即補(bǔ)充相同體積、相同溫度、相同組成的接收液。各時(shí)間點(diǎn)的接收液經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm) 過濾，40 μL 進(jìn)樣，試驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算單位面積的累積滲透量 (Q，mg/cm2)。

式中，Q: 單位面積累積透過量(mg/cm2)；A: 有效經(jīng)皮吸收面積(cm2)；V: 接收液體積(mL)；V0: 取樣體積(mL)；Cn: 為第n個(gè)取樣點(diǎn)測得的接收液中藥物濃度(mg/mL)；Ci為第i(i≤n-1) 個(gè)取樣點(diǎn)測得的接收液中藥物的濃度(mg/mL)。

按下式計(jì)算透過百分率Q%:

式中，QT: 供給室加入的總藥量； Qt: t時(shí)刻的藥物累積透過量。

1.2.2 臨床藥效試驗(yàn)

試驗(yàn)動(dòng)物分組及試驗(yàn)方法: 將感染豬疥螨的60 頭后備母豬隨機(jī)分為3 組 (A、B、C組)，每組20 頭； 把無寄生蟲感染的健康后備母豬20 頭作為健康空白對照組(D 組)； 各組分欄飼養(yǎng)，詳見表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組

體表寄生蟲檢查: 在用藥前以及治療后的1、7、14、21、28 d 進(jìn)行樣本采集，從每頭豬的四肢及耳郭內(nèi)側(cè)有明顯病變處(每處4 cm2)采集樣本。在刮取樣本時(shí)，先將采樣處用純化水濕潤后用鈍刀刮，然后收集刮取物。在有水的平皿中分別加入刮取物樣本，搗爛并混勻，放置在顯微鏡下，觀察螨蟲狀態(tài)并記錄好感染豬頭數(shù)。療效觀察: 每天觀察用藥后各組豬的臨床癥狀，并做好結(jié)果記錄。判斷該藥物療效通過計(jì)算用藥后轉(zhuǎn)陰率: 轉(zhuǎn)陰率＝(用藥前陽性豬頭數(shù)-用藥后陽性豬頭數(shù)) /用藥前陽性豬頭數(shù)×用藥前陽性豬頭數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛硫磷高效液相色譜法(HPLC) 分析方法的建立

2.1.1 色譜條件的確定 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈一水(70∶30) 為流動(dòng)相，檢測波長為260 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量40 μL，柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)按辛硫磷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，辛硫磷主峰與雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求[9，10]。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱定辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品適量，用乙腈溶解并稀釋至10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再分別配成濃度為0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，2.5，5.0 mg/mL 的系列對照品溶液。分別吸取上述溶液40ul 進(jìn)樣，測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品濃度(mg?mL-1) 為橫坐標(biāo)(X)，按最小二乘法進(jìn)行線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝10 457x＋294.54，R2＝0.999 8。試驗(yàn)結(jié)果表明: 辛硫磷濃度在0.01 ～5.0 mg?mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果詳見表2 和圖1。

圖1 辛硫磷HPLC 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 辛硫磷HPLC 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)結(jié)果(n ＝3)

2.1.3 精密度試驗(yàn) 試驗(yàn)所得辛硫磷溶液日內(nèi)日間精密度結(jié)果見表3。本法精密度良好，符合方法學(xué)要求。

表3 辛硫磷HPLC 日內(nèi)日間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n ＝3)

2.1.4 回收率試驗(yàn) 取 0.05，0.5 和5.0 mg?mL-1的辛硫磷溶液，測定其回收率(n＝3)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算濃度及回收率。結(jié)果表明，回收率試驗(yàn)符合方法學(xué)要求。試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 辛硫磷HPLC 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n ＝3)

2.2 體外透皮試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 陰性干擾試驗(yàn) 結(jié)果表明，在空白接收液辛硫磷出峰位置無干擾峰，分析條件可行，相關(guān)色譜圖見圖2。

圖2 體外透皮試驗(yàn)接收液HPLC 色譜

2.2.2 體外透皮試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)方法1.2.1.3計(jì)算，浴舒嘉、市售普通40%辛硫磷澆潑溶液兩個(gè)產(chǎn)品在0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 的累積透過量及透過率，結(jié)果見表5、表6。

表5 浴舒嘉體外透皮試驗(yàn)結(jié)果(n ＝6)

表6 市售普通40%辛硫磷澆潑溶液體外透皮試驗(yàn)結(jié)果(n ＝6)

應(yīng)用Franz 擴(kuò)散池法對比40%辛硫磷澆潑溶液(浴舒嘉)、市售普通40%辛硫磷澆潑溶液的體外透皮效果表明，由兩種辛硫磷澆潑劑皮膚累積滲透量數(shù)據(jù)(表5、表6) 和累積滲透曲線(圖3) 可知，本公司40%辛硫磷澆潑溶液產(chǎn)品(浴舒嘉) 24h 皮膚累積透過量是市售普通40%辛硫磷澆潑溶液的累積透過量的95 倍，表明本公司產(chǎn)品40%辛硫磷澆潑溶液(浴舒嘉) 透皮性能明顯優(yōu)于市售普通40%辛硫磷澆潑溶液。

圖3 40%辛硫磷澆潑透皮制劑體外皮膚累積滲透量曲線

2.3 臨床藥效試驗(yàn)

2.3.1 臨床觀察 試驗(yàn)期間，各試驗(yàn)組母豬未出現(xiàn)中毒、過敏等毒副反應(yīng)癥狀，各試驗(yàn)組母豬采食飲水、精神狀態(tài)、排便、給藥部位均正常。

2.3.2 試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果顯示，使用40%辛硫磷澆潑溶液(浴舒嘉) 試驗(yàn)組驅(qū)蟲后第28 d，試驗(yàn)豬體表寄生蟲轉(zhuǎn)陰率為100%，使用市售普通40%辛硫磷澆潑溶液試驗(yàn)組在驅(qū)蟲后28 d，試驗(yàn)豬體表寄生蟲轉(zhuǎn)陰率為75%，表明浴舒嘉對豬疥螨感染具有良好的療效，且其效果優(yōu)于市售普通40%辛硫磷澆潑溶液。治療14 d 后，治愈率可達(dá)到85%，21 d 治愈率100%。詳見表7。

表7 各試驗(yàn)組體表寄生蟲檢查結(jié)果

3 結(jié)論

從本試驗(yàn)結(jié)果看，40%辛硫磷澆潑溶液經(jīng)皮膚外用給藥，滲透到皮下組織的藥量能夠保證驅(qū)蟲效果，經(jīng)皮膚涂抹和噴灑給藥途徑，藥物不需要通過胃腸道消化液的破壞，不經(jīng)過口腔黏膜吸收對黏膜的損害，通過試驗(yàn)測定回收率和透過率，顯示辛硫磷澆潑溶液有提高藥物的生物利用度的作用，也避免了肝臟首過效應(yīng)，降低藥物的不良反應(yīng)發(fā)生率，尤其是規(guī)模化養(yǎng)殖和群體飼養(yǎng)家畜在防治寄生蟲疾病上的首選藥劑。2000 年以來，透皮給藥制劑技術(shù)研究的迅速發(fā)展，突破了傳統(tǒng)體外經(jīng)皮滲透給藥的觀念，以皮膚作為媒介，在產(chǎn)品研究開發(fā)過程中加入適當(dāng)?shù)耐钙の沾龠M(jìn)劑，能夠輔助藥物穿過角質(zhì)層、促進(jìn)通過批復(fù)擴(kuò)散，由毛細(xì)血管將藥物輸入體內(nèi)進(jìn)入體循環(huán)，使藥物發(fā)揮治療的作用。目前，外用藥劑經(jīng)透皮給藥普遍存在療效差的問題，主要問題是通過透皮給藥途徑，批復(fù)對藥物透析的效果不明顯，藥物吸收的生物利用度差等原因?qū)е?，這也是經(jīng)皮外用給藥系統(tǒng)研究技術(shù)的關(guān)鍵。本公司開發(fā)的40%辛硫磷澆潑溶液(浴舒嘉)，通過體外透皮試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)，其透皮性能明顯提高，對豬疥螨感染具有良好的療效，治療14 d 后，治愈率可達(dá)到85%，21 d 治愈率100%，且優(yōu)于市售普通40%辛硫磷澆潑溶液； 并通過臨床藥效試驗(yàn)證明浴舒嘉可發(fā)揮高效的驅(qū)蟲作用，對治療豬疥螨等體外寄生蟲感染具有廣闊應(yīng)用前景。