王光祖，王少敏，喬素蘭，李曉敬，姚春霞，布蘭娜

〔摘要〕 目的 探究芹菜素對子癇前期（preeclampsia， PE）胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的影響及可能的作用機(jī)制。方法 取人絨毛膜滋養(yǎng)層HTR-8/Svneo細(xì)胞，采用缺氧復(fù)氧1 h（hypoxic-reoxygenation 1 h， H1R1）誘導(dǎo)建立PE細(xì)胞模型，并通過MTT法檢測芹菜素對HTR-8/Svneo細(xì)胞毒性的影響。取對數(shù)生長期的HTR-8/Svneo細(xì)胞，分為對照組、H1R1組、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase， AMPK）激活劑阿卡地新（acadesine， AICAR）組（1 mmol/L）、芹菜素低劑量組（10 μmol/L）、芹菜素高劑量組（20 μmol/L）、芹菜素+AICAR組（芹菜素20 μmol/L+AICAR 1 mmol/L）。采用MTT法檢測細(xì)胞活力；透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬情況；劃痕實驗和Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力；Western blot法檢測細(xì)胞AMPK/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）通路和自噬、侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，10、20 μmol/L芹菜素對HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用（P＜0.05）。與對照組比較，H1R1組細(xì)胞在24、48、72 h時細(xì)胞活力、劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達(dá)、p-mTOR/mTOR比值顯著降低（P＜0.05），微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ， LC3Ⅱ）/微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅰ， LC3Ⅰ）比值、Beclin-1和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)、p-AMPK/AMPK比值顯著升高（P＜0.05），自噬小體數(shù)量增多（P＜0.05）；與H1R1組比較，芹菜素低、高劑量組細(xì)胞活力、劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)、N-cadherin表達(dá)、p-mTOR/mTOR比值顯著升高（P＜0.05），LC3II/LC3I比值、Beclin-1和E-cadherin表達(dá)、p-AMPK/AMPK比值顯著降低（P＜0.05），自噬小體數(shù)量減少（P＜0.05）；與芹菜素高劑量組比較，芹菜素+AICAR組細(xì)胞在24、48、72 h時細(xì)胞活力、劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)、N-cadherin表達(dá)、p-mTOR/mTOR比值顯著降低（P＜0.05），LC3II/LC3I比值、Beclin-1和E-cadherin表達(dá)、p-AMPK/AMPK比值顯著升高（P＜0.05），自噬小體數(shù)量增多（P＜0.05）。結(jié)論 芹菜素能增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，改善PE，其作用機(jī)制可能與抑制AMPK/mTOR通路介導(dǎo)的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞過度自噬有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 芹菜素；子癇前期；胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞；自噬；遷移；侵襲；腺苷酸活化蛋白激酶；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.08.008

Effects of apigenin on autophagy of placental trophoblast cells in preeclampsia by regulating AMPK/mTOR pathway

WANG Guangzu1， WANG Shaomin1， QIAO Sulan1， LI Xiaojing1， YAO Chunxia2， BU Lanna1*

1. Department of Neonatology， Handan Maternal and Child Health Hospital & Handan Children's Hospital， Handan， Hebei 056000， China; 2. School of Medicine， Hebei University of Engineering， Handan， Hebei 056038， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the effects of apigenin on autophagy of placental trophoblast cells in preeclampsia （PE） and its possible mechanism of action. Methods Human chorionic trophoblast HTR-8/Svneo cells were taken and hypoxia-reoxygenation 1 h （H1R1） was used to induce the establishment of PE cell models. The effects of apigenin on HTR-8/Svneo cytotoxicity was tested by MTT method. In addition， HTR-8/Svneo cells in logarithmic growth phase were taken and divided into control group， H1R1 group， adenosine monophosphate-activated protein kinase （AMPK） activator acadesine （AICAR） group （1 mmol/L）， low-dose apigenin group （10 μmol/L）， high-dose apigenin group （20 μmol/L）， and apigenin+AICAR group （apigenin 20 μmol/L+AICAR 1 mmol/L）. Cell viability was determined by MTT method; cell autophagy was observed by transmission electron microscope; cell migration and invasion ability were tested by scratch assay and Transwell chamber assay. Western blot method was used to examine the related protein expressions of cellular AMPK/mammalian target of rapamycin （mTOR） pathway， autophagy， and invasion. Results Compared with the control group， 10 and 20 μmol/L apigenin had a promoting effect on the proliferation of HTR-8/Svneo cells （P<0.05）. Compared with the control group， the cell viability at 24， 48， and 72 h， scratch healing rate， number of transmembrane cells， N-cadherin expression， and p-mTOR/mTOR ratio of the H1R1 group were significantly lower （P<0.05）， while the microtubule-associated protein 1 light chain 3 Ⅱ （LC3Ⅱ）/microtubule-associated protein 1 light chain 3 Ⅰ（LC3Ⅰ） ratio， Beclin-1 and E-cadherin expressions， p-AMPK/AMPK ratio were significantly higher （P<0.05）， and the number of autophagosomes increased （P<0.05）; compared with the H1R1 group， the cell viability at 24， 48， and 72 h， scratch healing rate， number of transmembrane cells， N-cadherin expression， and p-mTOR/mTOR ratio in low- and high-dose apigenin groups were significantly elevated （P<0.05）， while LC3II/LC3I ratio， Beclin-1 and E-cadherin expressions， and p-AMPK/AMPK ratio were significantly reduced （P<0.05）， and the number of autophagosomes became lower （P<0.05）; compared with high-dose apigenin group， the cell viability at 24， 48 and 72 h， scratch healing rate， number of transmembrane cells， N-cadherin expression， and p-mTOR/mTOR ratio of apigenin+AICAR group were significantly lower （P<0.05）， while LC3II/LC3I ratio， Beclin-1 and E-cadherin expressions， and p-AMPK/AMPK ratio were significantly higher （P<0.05）， and the number of autophagosomes increased （P<0.05）. Conclusion Apigenin can enhance the invasion ability of trophoblast cells and thus improve PE， and its mechanism of action may be related to the inhibition of the excessive autophagy of placental trophoblast cells mediated by AMPK/mTOR pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 apigenin; preeclampsia; placental trophoblast cells; autophagy; migration; invasion; adenosine monophosphate-activated protein kinase; mammalian target of rapamycin

子癇前期（preeclampsia， PE）是妊娠期女性常見的一種母嬰共患疾病，胎盤是PE發(fā)病機(jī)制的核心，與異常滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤有關(guān)[1]。自噬在胚胎發(fā)生、植入和妊娠維持中起著重要作用，過度自噬被認(rèn)為是PE發(fā)病過程中胎盤的一個重要特征[2]，對滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)是治療PE的重點。芹菜素是一種黃酮類化合物，具有抗氧化和抗炎作用，亦可降低胰島素抵抗，改善妊娠糖尿病，而胰島素抵抗為PE的病因之一[3]。此外，芹菜素還可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改善妊娠糖尿病大鼠胰腺組織損傷和胰島細(xì)胞凋亡[4]，并可改善妊娠高血壓[5]。芹菜素的作用可能與其控制自噬的能力有關(guān)[6-7]。然而，芹菜素是否能調(diào)節(jié)PE中滋養(yǎng)細(xì)胞自噬尚未可知。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白，已有研究證實，PE期間p-mTOR胎盤表達(dá)降低、mTOR信號通路抑制，通過降低滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力誘導(dǎo)PE的發(fā)生[8]；激活mTOR信號通路可增強(qiáng)PE大鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖分化[9]。而在PE期間，與mTOR通路相關(guān)的基因p-AMPK胎盤表達(dá)增加，并且與正常孕婦相比，嚴(yán)重PE患者腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase， AMPK）較高[10]。AMPK是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對于正常胎盤和胚胎發(fā)育至關(guān)重要。AMPK的過度激活會損害PE中滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲性[11]。mTOR是AMPK的下游靶標(biāo)之一，AMPK和mTOR的活性在自噬調(diào)節(jié)方面具有拮抗作用，AMPK激活負(fù)向調(diào)節(jié)mTOR活性、正向調(diào)節(jié)自噬活性[12]。據(jù)報道，重度PE患者胎盤中mTOR活性下降，滋養(yǎng)細(xì)胞自噬過度激活，侵襲能力降低；抑制胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬，可延緩PE進(jìn)展[13]。這提示，PE患者胎盤中AMPK的激活可下調(diào)mTOR活性，誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞過度自噬，可能是PE發(fā)病的重要機(jī)制。基于以上研究，本研究推測芹菜素可能通過AMPK/mTOR通路調(diào)控PE胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬，并對此展開研究。

1 材料

1.1? 細(xì)胞

人絨毛膜滋養(yǎng)層HTR-8/Svneo細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：20210615；HTR-8/Svneo維持在RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素）中，于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2? 藥品與主要試劑

芹菜素（純度＞98%，批號：201109，成都瑞芬思生物科技有限公司）；阿卡地新（acadesine， AICAR）（AMPK激活劑，批號：20210724）、MTT試劑盒（批號：20210805）、RIPA裂解液（批號：20210622）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（批號：210316）、RPMI1640培養(yǎng)基（批號：210409）、胰蛋白酶（批號：210420）均購自美國Gibco公司；兔源一抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3， LC3）Ⅱ/Ⅰ（批號：20210812）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）（批號：20210524）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）（批號：20210608）、AMPK（批號：20210519）、p-AMPK（批號：20210420）、mTOR（批號：20210615）、p-mTOR（批號：20210617）、Beclin-1（批號：20210506）抗體均購自英國Abcam公司。

1.3? 主要儀器

超薄切片機(jī)（型號：Leica EM UC7，德國Leica公司）；多功能酶標(biāo)儀（型號：iMark680，美國Bio-Rad公司）；倒置熒光顯微鏡（型號：IX73，日本Olympus公司）；透射電子顯微鏡（型號：JEM-1230，日本Jeol公司）。

2 方法

2.1? PE細(xì)胞模型建立及芹菜素的細(xì)胞毒性實驗

采用缺氧復(fù)氧1 h（hypoxic-reoxygenation 1 h， H1R1）誘導(dǎo)建立PE細(xì)胞模型[14]。取HTR-8/Svneo細(xì)胞（1×105個/mL），接種于96孔板（200 μL/孔），培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時，換用含芹菜素終濃度為0、5、10、20、40、80 μmol/L的培養(yǎng)基處理24 h。然后，將細(xì)胞置于低氧環(huán)境（1%O2、5%CO2、94%N2）中培養(yǎng)1 h，再進(jìn)行常氧（21%O2）處理。H1R1后，向每個孔中加入40 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育2 h。使用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長下各孔吸光度（A）值，與未經(jīng)芹菜素處理的對照細(xì)胞相比，計算芹菜素處理組的細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=（芹菜素處理組A值-空白孔A值）/（未經(jīng)芹菜素處理組A值-空白孔A值）×100%。

2.2? 細(xì)胞分組與處理

取HTR-8/Svneo細(xì)胞，分為對照組（常氧21%O2培養(yǎng)，不作處理）、H1R1組（1%O2/21%O2培養(yǎng)）、AICAR組（給予AMPK激活劑AICAR 1 mmol/L處理）、芹菜素低劑量組（10 μmol/L）、芹菜素高劑量組（20 μmol/L）、芹菜素+AICAR組（給予芹菜素20 μmol/L和AICAR 1 mmol/L處理）。此外，AICAR組、芹菜素各劑量組和芹菜素+AICAR組細(xì)胞分別給予相應(yīng)劑量的藥物處理24 h后，進(jìn)行H1R1誘導(dǎo)建立PE細(xì)胞模型。

2.3? MTT法檢測細(xì)胞活力

HTR-8/Svneo細(xì)胞以2×104個/孔的密度接種于96孔板中，每孔200 μL（細(xì)胞密度為1×105個/mL），按照“2.2”項分組進(jìn)行處理后，在24、48、72 h分別向每孔加入40 μL MTT溶液（5 mg/mL），孵育2 h。檢測各組細(xì)胞在570 nm處的A值（A570 nm值），評估細(xì)胞活力。

2.4? 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬

將各組細(xì)胞用2.5%戊二醛-1%餓酸固定，PBS洗后，梯度乙醇和丙酮進(jìn)行脫水，然后包埋在純812包埋劑中，在60 ℃烘箱中聚合48 h；使用超薄切片機(jī)將樣品切成60～80 nm的超薄切片。切片用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬。

2.5? 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

取對數(shù)生長期的HTR-8/Svneo細(xì)胞，以1×105個/mL的密度接種在60 mm培養(yǎng)皿中，并使其生長24 h。用無菌藍(lán)色移液管的尖端刮擦劃一道劃痕。隨后，按照“2.2”項進(jìn)行分組與處理，并將細(xì)胞再培養(yǎng)24 h。在0 h和24 h時在同一位置用倒置顯微鏡拍照，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（1-24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度）×100%。

2.6? Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力

取HTR-8/Svneo細(xì)胞按照“2.2”項進(jìn)行分組和處理后，重懸在無血清培養(yǎng)液中（2×104個/mL）。取200 μL細(xì)胞懸液加入上室（預(yù)先包被Matrigel），600 μL培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）加入下室。培養(yǎng)48 h后，將穿膜細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中30 min，在結(jié)晶紫染液中染色20 min后，在倒置顯微鏡下對侵襲細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

2.7? Western blot法檢測細(xì)胞AMPK/mTOR通路和自噬、侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)

RIPA裂解液提取經(jīng)芹菜素和H1R1處理后的HTR-8/Svneo細(xì)胞總蛋白。測量蛋白濃度后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白樣品（30 μg），并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。將膜封閉在5%脫脂牛奶中1 h，將膜在4 ℃下與在封閉溶液中稀釋的一抗（AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、E-cadherin、N-cadherin、β-actin，1∶1 000）孵育過夜。將膜在室溫下用二抗（1∶4 000）孵育1 h后，顯影，檢測條帶灰度值，計算目的蛋白表達(dá)量。

2.8? 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用“ｘ±s”表示，數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性和方差齊性分別通過Kolmogorov-Smirnov檢驗和Levene檢驗進(jìn)行分析，多組間比較符合正態(tài)分布且方差齊時采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時，選擇Dunnett-t3檢驗；不服從正態(tài)分布者，采用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 不同濃度的芹菜素對H1R1誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo細(xì)胞毒性的影響

與0 μmol/L的芹菜素濃度比較，5、10、20、40 μmol/L的芹菜素對HTR-8/Svneo細(xì)胞無明顯毒性作用。10 μmol/L芹菜素對HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用（P>0.05），20 μmol/L時促進(jìn)作用更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），當(dāng)劑量達(dá)到80 μmol/L時有抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖的趨勢（P＜0.05）。詳見表1。故選擇10、20 μmol/L芹菜素用于后續(xù)實驗。3.2? 芹菜素對H1R1誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo細(xì)胞活力的影響

與對照組比較，H1R1組細(xì)胞在24、48、72 h時細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與H1R1組比較，AICAR組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），芹菜素低、高劑量組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05）；與AICAR組比較，芹菜素+AICAR組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05）；與芹菜素高劑量組比較，芹菜素+AICAR組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

3.3? 芹菜素對H1R1誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo細(xì)胞自噬的影響

與對照組比較，H1R1組細(xì)胞中自噬小體數(shù)量增多（P＜0.05）；與H1R1組比較，AICAR組細(xì)胞中自噬小體數(shù)量增多（P＜0.05），芹菜素低、高劑量組細(xì)胞中自噬小體數(shù)量減少（P＜0.05）；與AICAR組比較，芹菜素+AICAR組細(xì)胞中自噬小體數(shù)量減少（P＜0.05）；與芹菜素高劑量組比較，芹菜素+AICAR組細(xì)胞中自噬小體數(shù)量增多（P＜0.05）。詳見表3、圖1。

3.4? 芹菜素對H1R1誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

與對照組比較，H1R1組細(xì)胞劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與H1R1組比較，AICAR組細(xì)胞劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05），芹菜素低、高劑量組細(xì)胞劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與AICAR組比較，芹菜素+AICAR組細(xì)胞劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與芹菜素高劑量組比較，芹菜素+AICAR組細(xì)胞劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）。詳見表4、圖2。

3.5? 芹菜素對H1R1誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo細(xì)胞中自噬、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，H1R1組細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1和E-cadherin表達(dá)顯著升高（P＜0.05），N-cadherin表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與H1R1組比較，AICAR組細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1和E-cadherin表達(dá)顯著升高（P＜0.05），N-cadherin表達(dá)顯著降低（P＜0.05），芹菜素低、高劑量組細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1和E-cadherin表達(dá)顯著降低（P＜0.05），N-cadherin表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與AICAR組比較，芹菜素+AICAR組細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1和E-cadherin表達(dá)顯著降低（P＜0.05），N-cadherin表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與芹菜素高劑量組比較，芹菜素+AICAR組細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1和E-cadherin表達(dá)顯著升高（P＜0.05），N-cadherin表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。詳見圖3、表5。

3.6? 芹菜素對H1R1誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo細(xì)胞中AMPK/mTOR通路的影響

與對照組比較，H1R1組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK比值升高、p-mTOR/mTOR比值降低（P＜0.05）；與H1R1組比較，AICAR組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK比值升高、p-mTOR/mTOR比值降低（P＜0.05），芹菜素低、高劑量組p-AMPK/AMPK比值降低、p-mTOR/mTOR比值升高（P＜0.05）；與AICAR組比較，芹菜素+AICAR組p-AMPK/AMPK比值降低、p-mTOR/mTOR比值升高（P＜0.05）；與芹菜素高劑量組比較，芹菜素+AICAR組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK比值升高、p-mTOR/mTOR比值降低（P＜0.05）。詳見圖4、表6。

4 討論

在正常妊娠中，胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮壁并用低阻力的血管系統(tǒng)取代高阻力的子宮螺旋動脈和小動脈，而這種重塑在PE中是有缺陷的（可能繼發(fā)于胎兒-母體間期免疫反應(yīng)的改變），可能導(dǎo)致胎盤缺血[15]。PE長期以來一直被認(rèn)為是胎盤的缺血性疾病，缺氧可引起細(xì)胞侵襲力減弱，并影響滋養(yǎng)細(xì)胞向侵襲性表型分化[16]；此外，H1R1可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞AMPK激活，可有效誘導(dǎo)HTR8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞PE前期研究模型[14]，因此，本研究通過H1R1誘導(dǎo)建立PE滋養(yǎng)細(xì)胞模型。結(jié)果顯示，與常氧處理細(xì)胞相比，H1R1可降低滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、侵襲能力，并上調(diào)p-AMPK/AMPK比值，激活A(yù)MPK。

芹菜素是在芹菜、歐芹、洋蔥、茶和葡萄柚等蔬菜和水果中發(fā)現(xiàn)的天然黃酮類化合物之一。黃酮類化合物可以作為抗氧化劑，保護(hù)生物分子免受氧化損傷。據(jù)報道，芹菜素可改善妊娠糖尿病和妊娠高血壓，并降低胰島素抵抗[3，5]。而氧化應(yīng)激會導(dǎo)致胎盤功能異常，糖尿病是PE的高危因素，胰島素抵抗為其病因之一，這提示芹菜素可能對PE具有保護(hù)作用。本研究首次探究了不同濃度的芹菜素對滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/Svneo的影響，結(jié)果顯示，5、10、20、40 μmol/L的芹菜素對HTR-8/Svneo細(xì)胞無明顯毒性作用，并且10、20 μmol/L芹菜素對HTR-8/Svneo細(xì)胞有促增殖作用，而當(dāng)劑量達(dá)到80 μmol/L時有抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖的趨勢，表明高濃度的芹菜素對HTR-8/Svneo細(xì)胞有明顯毒性，因此，選擇低濃度芹菜素（10、20 μmol/L）進(jìn)一步研究其對HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移與侵襲的影響，后續(xù)將在此試驗劑量范圍內(nèi)設(shè)置多個濃度來進(jìn)一步評估劑量依賴性。在妊娠期，滋養(yǎng)細(xì)胞通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得遷移、侵襲能力，進(jìn)而侵入子宮內(nèi)膜以重塑螺旋動脈，胎盤功能障礙與滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲不足密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，10、20 μmol/L芹菜素可顯著增加經(jīng)H1R1處理后的HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移與侵襲能力；Western blot結(jié)果也證實，芹菜素可降低E-cadherin表達(dá)，升高N-cadherin表達(dá)。這表明芹菜素可增強(qiáng)H1R1處理后的HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在PE中具有重要作用，然而，其調(diào)控HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制尚不明確。

自噬在胚胎發(fā)生、植入和妊娠維持中起著重要作用，NAKASHIMA等[18-19]研究顯示，自噬機(jī)制在PE中受損，自噬抑制與胎盤不良有關(guān)，是PE胎盤的一個重要特征。然而，過度自噬也被認(rèn)為是PE發(fā)病過程中胎盤的一個重要特征[2，20]。當(dāng)mTOR的磷酸化被阻止時，滋養(yǎng)細(xì)胞自噬過度激活，妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力降低[21]；通過mTOR途徑調(diào)節(jié)自噬可進(jìn)一步影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和黏附[22]。以上研究表明，mTOR介導(dǎo)的細(xì)胞自噬可影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲。AMPK是mTOR的上游調(diào)控因子，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白[12]。AMPK協(xié)調(diào)細(xì)胞生長、分化和營養(yǎng)運輸以維持細(xì)胞存活，在多種缺血性疾病中發(fā)揮重要作用[23]。AMPK的適當(dāng)調(diào)節(jié)對于正常胎盤和胚胎發(fā)育至關(guān)重要，其失調(diào)可能導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病，如宮內(nèi)生長受限、胎盤功能不全或PE。據(jù)報道，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中AMPK敲低會導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和功能改變[24]，AMPK激活可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞分化，改善受異常胎盤影響的人胎盤中滋養(yǎng)細(xì)胞的功能[25]。但是，AMPK的過度激活會降低PE中滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲性[11]。TSAI等[8]研究指出，在PE期間，胎盤中p-mTOR表達(dá)降低，p-AMPK表達(dá)增加；KOROGLU等[10]也發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重PE患者的AMPK表達(dá)水平顯著高于健康孕婦和無嚴(yán)重特征的PE患者。本研究結(jié)果顯示，H1R1后HTR-8/Svneo細(xì)胞中p-AMPK/AMPK比值升高，p-mTOR/mTOR比值降低，并且采用AMPK激活劑AICAR上調(diào)p-AMPK/AMPK后，p-mTOR/mTOR比值進(jìn)一步降低，HTR-8/Svneo細(xì)胞的自噬增加，侵襲能力減弱，這與TSAI等[8]的研究結(jié)果一致，與NAKASHIMA等[18-19]研究結(jié)果不一致，推測其原因可能與自噬的雙重作用有關(guān)。由此猜想：在PE患者胎盤中，過度激活的AMPK可能通過抑制mTOR活化，誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞過度自噬。而經(jīng)芹菜素處理后，HTR-8/Svneo細(xì)胞中AMPK的激活被抑制，mTOR活化增加，細(xì)胞自噬減少，遷移與侵襲能力增強(qiáng)；并且使用AICAR可明顯減弱芹菜素對AMPK激活和自噬的抑制作用，并削弱芹菜素對HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用。上述結(jié)果提示芹菜素可能通過抑制AMPK的激活，促進(jìn)mTOR活化，進(jìn)而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞過度自噬，增強(qiáng)其侵襲能力。AICAR為AMPK/mTOR通路的激活劑，可進(jìn)一步增強(qiáng)自噬，降低滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、侵襲能力，芹菜素與AICAR聯(lián)合使用后，AICAR對AMPK/mTOR通路的激活作用減弱了芹菜素對胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞過度自噬的抑制作用，表明芹菜素可能通過抑制AMPK/mTOR通路發(fā)揮作用。

芹菜素可增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，改善PE，其作用機(jī)制可能與抑制AMPK/mTOR通路介導(dǎo)的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞過度自噬有關(guān)。本研究結(jié)果尚需體內(nèi)動物模型進(jìn)一步證實。

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（本文編輯? 周? 旦）