饒 英 林 穎 王 健 劉國鋒 張文娥 彭 婷，*

（1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2海南省熱帶特色花木資源生物學(xué)重點實驗室/海南大學(xué)林學(xué)院，海南 海口 570228；3廣州市林業(yè)和園林科學(xué)研究院，廣東 廣州 510405）

三色堇（Viola×wittrockiana）為堇菜科（Violaceae）堇菜屬（Viola）植物，是世界范圍內(nèi)重要的冬春季花壇花卉，具有典型的花瓣色斑性狀，是觀賞植物花色、花斑研究的理想材料。目前國內(nèi)外對三色堇花色、花斑的研究主要集中在花色素成分鑒定［1-2］及花青素合成相關(guān)基因的分離與表達分析等方面［3-4］。

酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase， TyDC）是連接植物初生代謝與次生代謝的初始酶［5］，可將底物酪氨酸脫羧形成酪胺［6-8］。在天然藥源植物紅景天（Rhodiola rosea）和地黃（Rehmannia glutinosa）中，TyDC對紅景天苷和麥角甾苷的合成分別起促進作用［9-11］。近期的一些研究認為TyDC 可能與花色形成有關(guān)。如Zhou 等［12］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥TyDC 的作用底物酪氨酸可以誘導(dǎo)花青素的合成，對酪氨酸降解缺陷突變體fah進一步研究發(fā)現(xiàn)，在突變體中，酪氨酸對花青素的誘導(dǎo)效果顯著低于野生型，且突變體中花青素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因表達量的提升幅度顯著低于野生型，說明酪氨酸的降解產(chǎn)物誘導(dǎo)了花青素的積累。本課題組前期在三色堇品種黃色帶花斑中的研究發(fā)現(xiàn)，VwTyDC基因在花瓣中的表達量顯著高于根、莖和葉，并且在色斑區(qū)的表達量高于非色斑區(qū)［13］。Cui等［2］用酪氨酸對三色堇非色斑區(qū)進行處理，發(fā)現(xiàn)非色斑區(qū)出現(xiàn)了條紋狀的色斑，通過病毒介導(dǎo)的基因沉默（virusinduced gene silencing， VIGS）技術(shù)沉默VwTyDC基因后，三色堇色斑區(qū)的顏色明顯變淺，說明VwTyDC基因可能與花青素的合成有關(guān)。

本課題組在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了一個新基因并命名VwTyDC-like，該基因在三色堇花瓣不同區(qū)域存在差異表達。為進一步探究VwTyDC-like基因在三色堇中的精細表達模式，本研究克隆獲得VwTyDC-like基因的cDNA 及gDNA 序列，并與VwTyDC進行對比分析。同時，通過實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)分析VwTyDC和VwTyDC-like基因在三色堇不同組織器官、花瓣發(fā)育不同時期、不同花色品種及其唇瓣不同區(qū)域的表達模式，以期為探究VwTyDC與VwTyDC-like基因在三色堇中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，為三色堇新品種培育及植物花色形成機理研究提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以三色堇超級賓哥（Matrix）系列的不同花色品種，包括黃色（Yellow）、黃色帶花斑（Yellow Blotch）、純藍色（True Blue）、藍色帶花斑（Blue Blotch）、白色（White）和白色帶花斑（White Blotch），帝國巨人Ⅱ（Majestica GiantsⅡ）系列的淡紫色漸變（Lavender Shades）和得大（Delta）系列的紫羅蘭白雙色（Violet & White）（圖1）為供試材料，所有種子均購于美國泛美種子公司。于2021年8月上旬將不同品種的三色堇種子播種在廣州市觀賞植物種質(zhì)資源圃，采用常規(guī)栽培管理措施，待2021 年10 月上旬三色堇進入始花期，分區(qū)域和發(fā)育時期采集不同品種的花瓣進行后續(xù)試驗。

圖1 不同花色的三色堇品種Fig.1 Pansy cultivars with different flower colors

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 樣品采集分為四組，第一組：采集黃色帶花斑品種的根、莖、葉、花芽、花、幼果和種子用于不同組織器官的表達分析；第二組：參照Li等［1］的方法將三色堇的花發(fā)育過程劃分為7個時期（S1～S7），采集黃色帶花斑品種7 個時期花瓣中心色斑區(qū)（a）與非色斑區(qū)（b）的樣品，用于不同花發(fā)育時期的表達分析；第三組：將白色帶花斑和白色2個品種的唇瓣由內(nèi)向外劃分為5個區(qū)域（區(qū)域1～5）進行采樣（圖1），用于唇瓣不同區(qū)域的表達分析；第四組：收集5 個不同花色品種（黃色、純藍色、藍色帶花斑、粉紫色漸變和紫羅蘭白雙色）花發(fā)育S7 期中心色斑區(qū)（無斑品種為中心色斑對應(yīng)區(qū)，a）、非色斑區(qū)（無斑品種為非色斑對應(yīng)區(qū)，b）及邊緣色斑區(qū)（僅紫羅蘭白雙色品種有此區(qū)域，c）的樣品，用于不同花色三色堇品種在S7期的表達分析（圖1）。每個樣品設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，于液氮中速凍后，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 植物核酸提取和cDNA合成 以三色堇的嫩葉或花瓣為材料，采用改良溴化十六烷基三甲胺（cetyl trimethylammonium bromide， CTAB）法提取總DNA，利用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊，北京）提取不同品種、時期及組織品種樣本總RNA，將檢測合格的RNA 樣品按照Prime ScriptTMRTreagent kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，大連）說明書進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 樣品置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3VwTyDC-like基因克隆和結(jié)構(gòu)分析 基于黃色帶花斑品種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選到1 個VwTyDC-like（Unigene0055670），結(jié)合分離VwTyDC-like基因啟動子時得到的序列，利用Prime 5.0 軟件設(shè)計特異引物（表1），分別擴增cDNA 及gDNA 序列。將PCR 產(chǎn)物用膠回收試劑盒（艾德萊，北京）進行回收后，連接到pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，挑選單菌落經(jīng)PCR 檢測后，送至上海生工生物公司測序。利用在線網(wǎng)站GSDS（http：//gsds.gao-lab.org/）分析該基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，并利用Exon-Intron Graphic Maker 在線網(wǎng)站（http：//www.wormweb.org/exonintron）繪制基因構(gòu)圖。

表1 本研究所用引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用ProtParam 在線分析軟件（https：//web. expasy. org/protparam/）分析VwTyDClike蛋白的理化性質(zhì)，VwTyDC-like 蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分別使用在線工具SOPMA（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/secpred_sopma. pl）和SWISSMODEL（https：//swissmodel. xpasy. org/）完成。將獲得的VwTyDC-like 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中（https：//blast.ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）進行比對，下載其他物種的同源序列并利用DNAMAN6.0 軟件進行氨基酸序列多重比對。利用MEGA 11 軟件采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)為1 000。

1.2.5 基因表達分析 以反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，按照TB Green?Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa，大連）操作說明，利用實時熒光定量PCR（quantitative real-tive PCR， qRT-PCR）技術(shù)分析VwTyDC-like和VwTyDC在三色堇不同組織器官、花發(fā)育的不同時期、不同品種中的表達模式。利用Primer 5.0 設(shè)計引物（表1），以三色堇β-actin作為內(nèi)參基因［15］，以2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。每個樣本均設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，3 次技術(shù)重復(fù)。使用Excel2016 和SPSS19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，利用Duncan 新復(fù)極差法做顯著性分析（P＜0.05），并采用Origin 2019b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 VwTyDC-like基因的克隆與序列分析

從前期獲得的黃色帶花斑三色堇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到1 個在花瓣不同區(qū)域存在差異表達的Unigene。以黃色帶花斑品種花瓣的cDNA 為模板，通過設(shè)計特異引物進行PCR 擴增，得到1 條特異條帶（圖2-A）。測序后獲得的編碼序列（coding sequence， CDS）序列長1 497 bp，編碼498個氨基酸。該基因序列與VwTyDC高度相似，命名為VwTyDC-like基因，GenBank 登錄號為ON866521。同時，以黃色、純藍色、白色3個無斑品種花瓣的cDNA 為模板通過PCR 擴增VwTyDC-like和VwTyDC的核苷酸序列。結(jié)果顯示，3 個品種VwTyDClike基因的核苷酸序列與黃色帶花斑品種完全一致；純藍色、白色品種VwTyDC基因的核苷酸序列與黃色帶花斑也完全一致，黃色品種的核苷酸序列與黃色帶花斑品種相比，僅有1 個堿基的差異，但編碼氨基酸序列一致。以黃色帶花斑葉片總DNA為模板，擴增得到單一條帶（圖2-B），長度為2 340 bp（包含部分啟動子序列），GenBank 登錄號為ON866520?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，VwTyDC-like基因包含2個外顯子和1個內(nèi)含子（圖2-C）。

圖2 VwTyDC-like基因克隆與結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Cloning of VwTyDC-like and exon-intron structure analysis

2.2 VwTyDC-like的序列分析

利用ExPASy中的ProtParam tool分析VwTyDC-like蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明該蛋白的相對分子量為54.94 kDa，理論等電點為5.84，脂肪系數(shù)86.97，總平均親水性為-0.052。利用ProtScale 程序分析VwTyDC-like 蛋白親水/疏水性，結(jié)果顯示其屬于親水性蛋白，二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示2 個蛋白主要由α 螺旋和無規(guī)則卷曲組成。用DNAMAN 對來自不同物種的TyDC 蛋白進行序列比對，發(fā)現(xiàn)VwTyDC-like與VwTyDC（ASW27173.1）氨基酸序列有37 個位點存在差異，與狗尾草（Setaria viridis）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）和毛果楊（Populus trichocarpa）等物種的同源性為66.18%（圖3）。使用MEGA 11軟件對三色堇及其他物種的TyDC蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，VwTyDC-like 蛋白與三色堇VwTyDC 蛋白進化關(guān)系最近，與橡膠樹TyDC 蛋白親緣關(guān)系相對較近，與葡萄（Vitis riparia）TyDC 蛋白親緣關(guān)系相對較遠，與單子葉植物狗尾草和玉米（Zea mays）TyDC 蛋白親緣關(guān)系最遠（圖4）。

圖3 VwTyDC-like與其他物種TyDCs蛋白序列比對Fig.3 Protein sequence alignment of VwTyDC-like and other TyDCs from different plants

圖4 三色堇與其他物種TyDC的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of VwTyDC-like and VwTyDC with other TyDCs from different plants

2.3 VwTyDC-like 與VwTyDC 在不同組織及不同花發(fā)育時期的表達模式

qRT-PCR 結(jié)果顯示，VwTyDC-like基因在超級賓哥系列黃色帶花斑品種中的表達具有組織特異性，在花中的表達量顯著高于其他組織（圖5-A）。在花發(fā)育的S7 期，VwTyDC-like在花瓣基部的中心色斑區(qū)（a）的表達量顯著高于非色斑區(qū)（b），并達到峰值，此前S1～S6期該基因在中心色斑區(qū)（a）與非色斑區(qū)（b）的表達量無顯著差異（圖5-C）。進一步分析顯示，VwTyDC與VwTyDC-like基因呈現(xiàn)出相似的表達模式（圖5）。

圖5 VwTyDC-like與VwTyDC在黃色帶花斑品種不同組織（A、B）和花發(fā)育的不同時期的表達分析（C、D）Fig.5 Expression analysis of VwTyDC-like and VwTyDC in different tissues （A， B） and at different flower developmental stages in Yellow Blotch cultivar （C， D）

2.4 VwTyDC-like與VwTyDC在花瓣中的表達模式

本研究利用得大系列的紫羅蘭白雙色品種分析了2 個基因的表達模式，該品種的色斑分布比較特殊，除花瓣基部有較大塊的色斑以外，下方三枚花瓣的邊緣也有小面積的色斑（圖1-H）。qRT-PCR 分析結(jié)果表明，在花發(fā)育的S7期，2個基因在中心色斑區(qū)（a）的表達量顯著高于邊緣色斑區(qū)（c）和非色斑區(qū)（b）；此外，非色斑區(qū)（b）的表達量高于邊緣色斑區(qū)（c）（圖6-A、B），推測VwTyDC-like與VwTyDC基因在花瓣中的表達可能具有位置效應(yīng)。

為進一步明確VwTyDC-like與VwTyDC在花瓣中的表達分布是否與位置有關(guān)，本研究將白色帶花斑和白色品種在S7 期的唇瓣劃分成5 個區(qū)域，即從花瓣基部到花瓣邊緣分為區(qū)域1～5（圖7-A），采用qRT-PCR分析VwTyDC-like與VwTyDC在唇瓣不同區(qū)域的表達模式。結(jié)果顯示，2 個基因明顯呈現(xiàn)出從基部到邊緣表達量逐漸下降的趨勢，在唇瓣基部（區(qū)域1，無色斑）的表達量均顯著高于其他位置（區(qū)域2～5），且在唇瓣邊緣（區(qū)域5）幾乎檢測不到2 個基因的表達（圖7），說明VwTyDC-like與VwTyDC在花瓣中的表達分布的確與位置有關(guān)。同時，VwTyDC-like基因的表達量遠高于VwTyDC，達到了后者的7～13倍（圖6、7）。

圖6 VwTyDC-like與VwTyDC基因在紫羅蘭白雙色品種中心色斑區(qū)（a）、非色斑區(qū)（b）和邊緣色斑區(qū)（c）的表達分析Fig.6 Expression analysis of VwTyDC-like （A） and VwTyDC （B） in the central blotch areas （a）、 non-blotch areas （b） and marginal blotch areas （c） of pansy petals in Violet & White cultivar

圖7 白色帶花斑和白色品種唇瓣不同區(qū)域（A）中VwTyDC-like （B）與VwTyDC （C）的表達分析Fig.7 Expression analysis of VwTyDC-like （B） and VwTyDC （C） in different areas of labella （A） in White Blotch and White cultivars

2.5 VwTyDC-like 與VwTyDC 在不同花色品種中的位置效應(yīng)

為了解VwTyDC-like與VwTyDC基因表達的位置效應(yīng)在其他三色堇品種中是否廣泛存在，本研究還檢測了二者在不同系列不同花色三色堇品種中的表達情況，包括超級賓哥系列黃色、純藍色、藍色帶花斑和帝國巨人II 系列的淡紫色漸變品種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有斑品種淡紫色漸變和藍色帶花斑中，VwTyDC-like與VwTyDC基因在花發(fā)育的S7 期，中心色斑區(qū)（a）的表達量顯著高于非色斑區(qū)（b）。而且，在無斑品種黃色和純藍色中，VwTyDC-like與VwTyDC基因的表達量在中心色斑對應(yīng)區(qū)（a）同樣顯著高于非色斑對應(yīng)區(qū)（b），無斑品種表現(xiàn)出與有斑品種相似的表達特點（圖8）。說明VwTyDC-like與VwTyDC基因表達的位置效應(yīng)在其他三色堇品種中同樣存在。同時，VwTyDC-like在不同品種中的表達量明顯高于VwTyDC，在淡紫色漸變品種中，VwTyDC-like的表達量比VwTyDC高252倍（圖8）。

圖8 VwTyDC-like（A）與VwTyDC（B）基因在不同花色品種不同區(qū)域的表達分析Fig.8 Expression analysis of VwTyDC-like （A） and VwTyDC （B） in the different areas of pansy petals with or without blotches in the pansy cultivars with different flower colors

3 討論

目前有關(guān)植物TyDC基因的研究較少，主要集中在逆境脅迫應(yīng)答［14-22］和酪氨酸衍生物合成路徑中活性分子的生物合成等方面［5-11，23-24］。本研究從三色堇中分離了一個新的酪氨酸脫羧酶基因（VwTyDC-like），并將該基因與之前報道的VwTyDC進行了精細表達模式的比較分析。

3.1 VwTyDC-like與VwTyDC的同源性

VwTyDC-like與VwTyDC基因具有相似的核苷酸序列，氨基酸序列一致性為92.37%。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示2 個蛋白主要由α 螺旋和無規(guī)則卷曲組成。同時，qRT-PCR 分析結(jié)果顯示，2個基因在三色堇不同組織器官、花發(fā)育不同時期、唇瓣不同區(qū)域、不同花色品種中呈現(xiàn)出高度一致的表達模式，在花中表達量最高；在花發(fā)育不同時期，表達差異僅在花發(fā)育的后期（S7）出現(xiàn)；無論品種有無色斑存在，在不同花色品種及其唇瓣的不同區(qū)域，表達量均由花瓣基部向外遞減。VwTyDC-like與VwTyDC基因有著高度相似的氨基酸序列及表達模式，說明二者為同源基因，可能具有相似的生物學(xué)功能。值得注意的是，VwTyDC-like的表達量明顯高于VwTyDC（圖5～8），暗示VwTyDClike可能在同源基因發(fā)揮功能的過程中具有更大作用。

3.2 VwTyDC-like與VwTyDC基因表達的位置效應(yīng)

本研究對超級賓哥系列黃色帶花斑品種VwTyDC-like與VwTyDC基因的表達模式進行了分析。結(jié)果顯示，在有斑品種黃色帶花斑中，VwTyDC-like與VwTyDC在花發(fā)育S7 期的中心色斑區(qū)（a）的表達量顯著高于非色斑區(qū)（b）（圖5），這與前人的研究結(jié)果一致［13］。為探究VwTyDC-like與VwTyDC基因在有斑品種中心色斑區(qū)與非色斑區(qū)的表達差異是否源于位置效應(yīng)，本研究還檢測了在花瓣基部與邊緣都有色斑分布的品種紫羅蘭白雙色VwTyDC-like與VwTyDC基因的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 個基因在非色斑區(qū)的表達量雖然低于基部的中心色斑區(qū)，但高于邊緣色斑區(qū)（圖6）。

進一步將白色與白色帶花斑品種的唇瓣劃分為5個區(qū)域進行分析，結(jié)果顯示，在有斑品種和無斑品種中，VwTyDC-like與VwTyDC基因在唇瓣中的表達水平均由內(nèi)向外依次降低（圖7），說明它們的表達存在明顯的位置效應(yīng)。為驗證VwTyDC-like與VwTyDC基因表達的位置效應(yīng)在其他三色堇品種中是否同樣存在，分析了2個基因在三色堇不同系列不同色系品種中的表達模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同花色品種中，不論三色堇花瓣是否帶有花斑，二者在中心色斑區(qū)或其對應(yīng)區(qū)的表達量均顯著高于非色斑區(qū)或其對應(yīng)區(qū)（圖8），進一步說明VwTyDC-like與VwTyDC基因表達的位置效應(yīng)在三色堇品種中廣泛存在。至于VwTyDC-like與VwTyDC基因在花瓣上表達具有位置效應(yīng)的原因，仍有待進一步研究。

3.3 VwTyDC-like 和VwTyDC 基因與三色堇色斑形成的可能關(guān)系

已有研究表明，植物花斑形成的本質(zhì)是花色素合成及調(diào)控基因在花器官（特別是花瓣或花萼）的特定區(qū)域差異表達的結(jié)果［25-27］。前人對擬南芥進行研究發(fā)現(xiàn)，TyDC的底物酪氨酸以一種劑量依賴型的方式有效誘導(dǎo)花青素的生物合成，主要通過上調(diào)花青素合成途徑中的下游基因如DFR、LODX和UF3GT的表達量以及MYB-bHLH-WD40轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中PAP1/MYB75、PAP2、GL3、EGL3、TTG1基因的表達促進花青素的積累［12］。Ma等［28］對茶葉品種Huabai 1的研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸與類黃酮化合物的積累有關(guān)。Cui等［2］用酪氨酸處理三色堇花瓣非色斑區(qū)，發(fā)現(xiàn)非色斑區(qū)出現(xiàn)了條紋狀色斑，通過VIGS技術(shù)沉默VwTyDC基因后，三色堇花瓣的色斑顏色明顯變淺，這些結(jié)果說明酪氨酸和VwTyDC基因確實與三色堇花青素的合成有關(guān)聯(lián)。本研究通過基因表達模式分析，發(fā)現(xiàn)VwTyDC-like與VwTyDC的表達模式與三色堇花瓣中花斑的分布可能沒有直接對應(yīng)關(guān)系。由此推測在三色堇花斑形成過程中，酪氨酸脫羧酶基因還需要和其他因子聯(lián)合發(fā)揮作用，而無斑品種缺乏這些相關(guān)因子。有研究發(fā)現(xiàn)，三色堇花斑由S和K兩個基因控制［29］，酪氨酸脫羧酶基因可能是其中一個基因，需要和另一個基因共同發(fā)揮作用。但是，另一個基因尚未被克隆，二者如何聯(lián)合發(fā)揮作用還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從三色堇花瓣中克隆到一個VwTyDC-like基因，與VwTyDC同源性最高。VwTyDC-like與VwTyDC基因在三色堇不同組織器官、花發(fā)育不同時期、不同花色品種及其唇瓣不同區(qū)域表現(xiàn)出高度一致的表達模式，但VwTyDC-like基因的表達水平普遍高于VwTyDC。VwTyDC-like與VwTyDC基因的表達均具有組織特異性，在花瓣中的表達量遠遠高于其他組織器官，且在花發(fā)育后期（S7）表達量最高。無論三色堇花瓣是否帶有花斑，VwTyDC-like與VwTyDC基因的表達量均由花瓣基部向外逐漸降低。本研究結(jié)果表明VwTyDC-like與VwTyDC基因在花瓣中的表達具有明顯的位置效應(yīng)。