周鑫蔚，丁皓天，董秀金，徐一力，劉毅，吳冰，陳香凝，丁祝進，馬桂珍，程漢良，許建和,2

（1.江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學，江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZON）是一種白色晶體，化學式為C18H22O5，常見于具有赤霉病的玉米和小麥等谷物中，是飼料原料中主要霉變污染物之一。ZON 具有強烈的雌激素作用，在動物體內會引起多種生殖系統(tǒng)相關疾病，如性欲下降、無排卵、不育和細胞質損害等[1,2]。ZON 可通過與魚體細胞雌激素受體相結合的方式影響魚類神經系統(tǒng)以及生殖器官[3]。攝食ZON 超標水產品可導致人體乳腺中的癌細胞增加[4]。目前，我國規(guī)定飼料原料中ZON 的檢出量不得超過500 μg/kg。去除飼料原料中ZON的主要方法有物理、化學和生物降解等方法。其中生物降解法因安全高效無污染，是目前廣泛使用的脫毒方法。生物降解法通過微生物降解使用較多。Zhang 等[5]發(fā)現，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）降解ZON 的效率較高。Harkai 等[6]發(fā)現分離篩選的124 株鏈霉菌（Streptomyces）中有2 個菌株對ZON 毒素的去除率達100%。耿海榮等[7]篩選獲得1株高效降解ZON 毒素的枯草芽孢桿菌（B.subtilis），當ZON 毒素濃度為2 μg/mL 和20 μg/mL 時，其發(fā)酵液對毒素的去除率分別為93.79%和82.40%；無菌發(fā)酵液對ZON 毒素的去除率為62.02%。上述研究中功能菌也均為陸源性菌株，降解的ZON 也都為純品，而對受污染的飼料原料中的ZON 降解效果目前報道較少。

鯽（Carassius auratus）是我國傳統(tǒng)養(yǎng)殖魚類，2020 年淡水養(yǎng)殖產量為274.9 萬t（2021 年中國漁業(yè)年鑒）。鯽養(yǎng)殖過程中需要投喂大量人工配合飼料，而在飼料原料和成品儲存中ZON 是主要霉變毒素之一。飼料中ZON 對生物體的毒害作用也僅見于陸生動物[8]，在水產動物中報道較少。

芽孢桿菌BMF03 是本實驗室從養(yǎng)殖水體分離的一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，對液體培養(yǎng)基中的ZON 有很強的降解作用[9]，但其對鯽飼料中ZON 是否具有同樣的降解功能，且添加到飼料后投喂鯽是否存在安全風險，目前均不清楚。本研究通過給鯽投喂四種不同類型飼料：基礎飼料（對照）、基礎飼料+芽孢桿菌BMF03（1×1010CFU/kg，BMF03 組）、基礎飼料+玉米赤霉烯酮（1 000 μg/kg，ZON 組）和基礎飼料+玉米赤霉烯酮+芽孢桿菌BMF03（ZON03 組），測定各組飼料和魚體肌肉中玉米赤霉烯酮的含量及實驗魚的生長性能、生化指標、腸道和肝胰臟健康狀況等，綜合評價芽孢桿菌BMF03對攝食ZON 污染飼料鯽的保護效應及其作為漁用飼料添加劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與飼料配方

共配制4 組等氮飼料，基礎飼料為對照（配方見表1）；在基礎飼料中分別添加芽孢桿菌BMF03（BMF03）、玉米赤霉烯酮（ZON）以及玉米赤霉烯酮+BMF03 菌株（ZON03）。依本實驗室前期研究結果和魚體對飼料中ZON 的安全耐受劑量[9,10]，確定飼料中ZON（購買自上海士鋒生物有限公司）添加量為1 000 μg/kg；BMF03 菌株為發(fā)酵上清離心后的產物，溶于水加入飼料中，添加量為1×1010CFU/kg，由江蘇海洋大學抗菌微生物及其代謝產物研究與應用重點實驗室提供。各組飼料原料粉碎過60 目篩，用小型混合機（ASY-3D，科勒器械有限公司）攪拌10 min，加水后繼續(xù)揉拌15 min，然后利用便攜式絞肉機（TK-12，豐瑞吉食品機械有限公司）制成直徑為0.4 mm 左右的顆粒飼料，放入干燥箱，35 ℃烘干至水分為10%左右，裝入密封袋，置于4 ℃冰箱冷藏保存。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)組成（干物質%）Tab.1 Ingredients and nutritional composition in basic diet (dry matter basis %)

1.2 實驗動物與飼養(yǎng)管理

實驗用鯽初始體質量為（20.13±0.12）g，購買自連云港市博旺特種水產養(yǎng)殖有限公司。養(yǎng)殖實驗在江蘇海洋大學水產養(yǎng)殖實驗室內的養(yǎng)殖系統(tǒng)（大連匯新）進行。正式實驗開始前用對照組飼料暫養(yǎng)1周，馴化鯽上浮搶食。分組前停食24 h，隨后選取480 尾規(guī)格均勻的健康鯽，隨機分成4 組，每組3 個重復，每個重復40 尾魚。每天投喂四次（8:30、11:30、14:30 和17:30），日投喂量為體質量的4%，每周根據體質量增長情況調整一次，養(yǎng)殖周期為8 周。實驗期間每天處理殘餌，換水一次，換水量約25%，養(yǎng)殖水溫23 ℃～26 ℃，水體pH7.0～7.5，氨氮含量小于0.2 mg/L，溶氧量大于5 mg/L，自然光照，每日記錄采食量。

1.3 樣品采集與測定

養(yǎng)殖實驗結束時，將實驗魚饑餓24 h 后計數、稱重，用于測定增重率等生長指標。每組隨機取9尾魚用濃度為50 mg/L 的MS-222 進行麻醉，其中3尾魚用于測定體長和體質量，然后用2 800 U/mL 肝素鈉溶液濕潤處理過的一次性2 mL 針頭注射器在尾靜脈處采血，在4 ℃下3 000 r/min 離心10 min 后收集上清液于2 mL 離心管中，-20 ℃冰箱保存，用于測定生化指標。取血后解剖魚體，取出內臟并稱重，用于計算臟體比。另外3 尾取側線和背鰭間肌肉，置于密封袋中，-80 ℃冰箱保存，用于測定肌肉中常規(guī)營養(yǎng)組成；剩余3 尾魚解剖后，取肝胰臟和1 cm 左右中腸，放入4%多聚甲醛中固定，用于組織形態(tài)的觀察。

1.4 飼料和魚體肌肉中ZON 含量的測定

將飼料和肌肉樣品在60℃下烘干至恒重，磨碎后用甲醇水溶液提取，用免疫親和柱（月旭科技，中國）提取液，洗脫和凈化，置于高效液相色譜儀（Agilent-1260，美國）分析。色譜條件∶流動相為甲醇水溶液（8∶2），紫外檢測波長為236 nm，柱溫25℃，進樣量為20 μL，流速為1 mL/min。

1.5 鯽生長性能的測定

實驗中測定生長性能參數如下：

式中，m1、m2分別為鯽的初始體質量和終末體質量（g）；m3為飼料攝入量（g）；m4、m5分別為實驗開始和結束時鯽的數量（尾）；m6為內臟重（g）；t 為養(yǎng)殖時間（d）；P 為粗蛋白含量（%）；L 為體長（cm）。

1.6 鯽肌肉常規(guī)營養(yǎng)組分的測定

稱取干重樣品1 g（精確至0.000 1 g）置于消化管中，加入硫酸鉀4.5 g、硫酸銅0.5 g 和硫酸10 mL，420 ℃消化1.5 h，冷卻15 min 后上機，利用全自動凱氏定氮儀（KjeltecTM-8400）測定粗蛋白含量；

稱取干重樣品1 g（精確至0.000 1 g）置于濾紙筒中，塞入脫脂棉，在恒重完的鋁杯中加入80 mL石油醚，利用索式抽提儀（SoxtecTM8000）測定粗脂肪含量；采用550 ℃灼燒稱量法（GB5009.4-2016）測定粗灰分含量。

1.7 鯽血清生化指標的測定

血清中超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、溶菌酶活性和總蛋白含量用南京建成生物試劑盒測定。

1.8 鯽腸道和肝胰臟組織形態(tài)的測定

將4%多聚甲醛固定好的鯽中腸和肝胰臟樣品送至Servicebio 有限公司（武漢）制作石蠟切片并進行H&E 染色。使用CaseViewer2.2（3DHISTECH）瀏覽數字切片，對切片中病理改變進行文字描述，用箭頭標識說明切片之間差異。

1.9 數據統(tǒng)計分析

實驗數據用SPSS 23 軟件經單因素方差分析（One-way ANOVA）后以平均值±標準偏差（mean±SD）表示。用Student t-test 和Duncan 進行顯著性檢驗，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 飼料和魚體肌肉中ZON 含量

實驗前后各組飼料中玉米赤霉烯酮的含量見表2。由表2 可知，實驗開始時ZON 和ZON03 組飼料中ZON 含量顯著高于對照組和BMF03 組，8 周后ZON 組飼料中ZON 含量未見明顯下降，但ZON03組飼料中ZON 水平顯著低于ZON 組（P＜0.05）。

表2 8 周后飼料中ZON 含量變化/（μg·kg-1）Tab.2 Concentrations of ZON in diets after eight weeks/（μg·kg-1）

實驗前后魚體肌肉中玉米赤霉烯酮含量見表3。由表3 可知，實驗開始時魚體肌肉中未檢出ZON，8 周后對照組和BMF03 組魚體肌肉中檢測出少量ZON，但含量顯著低于ZON 和ZON03 組（P＜0.05）。ZON03 組魚體肌肉中ZON 含量顯著低于ZON 組（P＜0.05）。

表3 8 周后肌肉中ZON 含量變化/（μg·kg-1）Tab.3 Concentrations of ZON in muscles after eight weeks/（μg·kg-1）

2.2 投喂不同飼料對鯽生長性能的影響

投喂不同飼料對鯽生長性能的影響見表4。養(yǎng)殖實驗結束時，各實驗組之間蛋白質效率、飼料系數、特定生長率及肥滿度和存活率無顯著差異（P＞0.05）。但ZON 組鯽終末體質量和增重率均顯著高于對照組和BMF03 組（P＜0.05），但與ZON03 組無顯著差異（P＞0.05）。

表4 投喂不同飼料后對鯽生長性能的影響Tab.4 Effects of different diets on the growth performance of crucian carp

2.3 投喂不同飼料對鯽肌肉常規(guī)營養(yǎng)組分影響

投喂不同飼料對鯽肌肉常規(guī)營養(yǎng)組分影響見表5。BMF03 組魚體肌肉粗蛋白含量顯著高于其他三組（P＜0.05）。ZON 和ZON03 組魚體粗脂肪和粗灰分含量與對照組相比均顯著升高（P＜0.05），但兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。各組魚體肌肉中水分含量無明顯差異（P＞0.05）。

表5 投喂不同飼料后對鯽肌肉常規(guī)營養(yǎng)組分的影響（濕物質%）Tab.5 Approximate nutritional composition in muscle of crucian carps fed different diets（wet matter basis %）

2.4 投喂不同飼料對鯽血清生化指標的影響

投喂不同飼料對鯽血清生化指標的影響見表6。BMF03 和ZON03 組魚體血清CAT 活性與對照組相比無顯著差異，但顯著高于ZON 組。ZON 組魚體血清SOD 和AKP 活性明顯低于其他組（P＜0.05），各實驗組中LZM活性均顯著高于對照組（P＜0.05），但添加毒素組LZM 活性低于BMF03 組（P＜0.05）。各組間魚體血清ACP 活性和TP 含量差異不顯著（P＞0.05）。

表6 投喂不同飼料對鯽血清生化指標的影響Tab.6 The serum biochemical indicators of crucian carps fed different diets

2.5 投喂不同飼料對鯽腸道和肝胰臟健康狀況的影響

投喂不同飼料對鯽中腸組織結構的影響見圖1。圖1 中可見，對照組、BMF03 組和ZON03 組中腸組織皺襞結構完整，可見少量杯狀細胞，少量黏膜上皮細胞點狀壞死（黑色箭頭）。ZON 組中組織局部黏膜下層輕度水腫（黑色箭頭），結構疏松，黏膜與黏膜下層輕度脫落（藍色箭頭）；較多黏膜上皮細胞壞死（綠色箭頭）。

圖1 攝食不同飼料鯽中腸的組織結構Fig.1 The intestinal tissue structures of crucian carp fed different diets

投喂不同飼料對鯽肝胰臟組織結構的影響見圖2。由圖2 可見，對照組和BMF03 組肝細胞空泡變性程度較?。ê谏^），胰腺腺泡細胞排列緊密，未見明顯炎性細胞浸潤；ZON 組中，肝細胞重度空泡變性（黑色箭頭），局部可見少量大泡，周圍可見輕微出血（藍色箭頭），多處胰腺腺泡周圍少量巨噬細胞浸潤（黃色箭頭）；ZON03 組中，肝細胞中度空泡變性（黑色箭頭），多處胰腺腺泡周圍少量出血（黃色箭頭）。

圖2 攝食不同飼料鯽肝胰臟的組織結構Fig.2 The hepatopancreatic structure of crucian carp fed different diets

3 討論

本研究中ZON 組飼料中添加芽孢桿菌BMF03 8 周后，飼料中ZON 濃度顯著降低，表明芽孢桿菌BMF03 在體外對ZON 具有一定的去除效果。已有的研究表明，除芽孢桿菌對ZON 有降解作用外，其他多種微生物對ZON 也有降解作用。Keller 等[11]從飼料中分離出的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株能消除培養(yǎng)基中90%以上的ZON 毒素；采用戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）JM0812 菌株能夠吸附乙酸鈉緩沖溶液中83.17%的ZON[12]；乳酸菌（Lactobacillus）發(fā)酵液可以降解麥芽中23%的ZON[13]；從發(fā)霉玉米中分離出的乳酸桿菌（Lactobacillus beijerinck）和明串珠菌（Leucanostoc）可以將ZON 生物轉化為α-ZAL[14]。微生物對ZON 毒素降解主要通過細胞壁的吸附、胞內活性物質和胞外蛋白等途徑。彭云等[9]報道，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對ZON 毒素降解主要通過細胞壁的吸附、胞內活性物質和胞外蛋白的共同作用，pH、溫度等因素對菌株去除ZON 毒素有明顯影響，pH 為7 時菌株對ZON毒素去除作用最強，溫度低于23 ℃或高于28 ℃毒素去除作用下降。本研究中芽孢桿菌BMF03 對飼料中ZON 降解效率遠低于對液體或固體培養(yǎng)基中ZON 的降解效果，去除率不足20%。而彭云等[9]報道當培養(yǎng)液中ZON 濃度為15 μg/mL 時，BMF04 菌株48 h 對其去除率達99%。推測原因可能與BMF03 也屬于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，其發(fā)揮功能也需要滿足一定溫度和介質條件,本研究中飼料配制后一直貯存于4 ℃，遠低于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對ZON 毒素降解所需適宜溫度，同時飼料中較低水分含量也影響了BMF03 對ZON 的降解效果。

ZON 對魚體組織損傷作用在較多文獻中已有報道。Wang等[15]發(fā)現，飼料中ZON的劑量大于1 041 μg/kg 會引起草魚腸道內組織的氧化損傷和細胞凋亡。Wony等[16]發(fā)現，ZON會造成虹鱒（Oncorhynchus mykiss）肝臟組織損害（包括細胞質空泡化和巨噬細胞聚集）。本研究中也發(fā)現鯽攝食含ZON 飼料后腸道組織表現出明顯的病理癥狀，如黏膜層水腫，較多上皮細胞壞死以及杯狀細胞消失等，肝細胞也出現重度空泡變性，與在其他魚類中結果相似。而攝食添加BMF03 菌株飼料后實驗魚腸道和肝臟組織結構完整，表明飼料中添加BMF03 可降低ZON 對魚體的損傷作用，緩解ZON 在魚體內的毒害作用。王悅等在小鼠中也發(fā)現降解ZON 菌株在體內可明顯降低ZON 毒性，保護肝臟[17]。CAT 和SOD 是機體抗氧化酶系統(tǒng)重要成員，可防止活性氧損害，維持自由基產生和清除之間的平衡[18]。SOD 可清除機體內的活性氧自由基,將其轉化為H2O2，再通過CAT進一步還原生成H2O 和O2。本研究中添加BMF03菌株飼料組魚體血清SOD、CAT 酶活力均明顯高于ZON 組，表明BMF03 可提高魚體抗氧化能力，維持其抗氧化系統(tǒng)的平衡，保護魚體組織免受ZON 的氧化損傷。飼料中添加芽孢桿菌可提升水產動物抗氧化能力在魚類和甲殼類中均有報道。黃坤鵬等[19]研究也發(fā)現,芽孢桿菌可顯著提高斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）仔魚體內的SOD活力。袁衛(wèi)[20]研究表明，飼料中添加芽孢桿菌能提高凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）體內抗氧化活性指標。但目前芽孢桿菌對水產動物抗氧化系統(tǒng)的具體益生機制仍待進一步研究。溶菌酶（LZM）是魚類先天免疫的重要指標之一，是魚類血清中重要的殺菌劑[21]。堿性磷酸酶（AKP）是魚類免疫系統(tǒng)中非常重要的水解酶，在保護機體防御病原體入侵，參與細胞中生物大分子的消化，維持細胞正常代謝活動有重要功能[22]。蔡紅丹等[23]報道，飼料中添加復合芽孢桿菌可顯著提高石斑魚血清中溶菌酶和AKP 活力。本研究亦發(fā)現BMF03 組魚體血清中LZM 和AKP 活力均明顯高于ZON 組，表明添加芽孢桿菌BMF03 能夠提高鯽免疫能力，緩解ZON 毒素對魚體免疫造成的負面影響。

本實驗中，鯽攝食添加ZON 的飼料時，終末體質量和增重率都顯著增加。Wony 等[24]也發(fā)現在飼料中添加2 mg/kg 的ZON 投喂虹鱒，其終末體質量、生長速度和飼料利用率顯著提高。這一結果可能與ZON 在動物體內產生的代謝物生理功能有關。ZON 在動物體內會分解成兩種植物雌激素α-ZAL和β-ZAL，其中α-ZAL 可通過刺激垂體產生內生生長激素來促進骨骼和肌肉的生長，從而在短時間內表現出對魚體生長具有一定的促進作用[25,26]。本實驗中，魚體攝食添加BMF03 飼料后促進了肌肉中蛋白質積累。周曉波等[27]也發(fā)現羅非魚攝食添加乳酸菌（Lactobacillus）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）飼料后，魚體肌肉中粗蛋白含量明顯上升。黃靈等[28]報道，虎龍斑（Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）攝食添加光合細菌和芽孢桿菌飼料后能夠提高肌肉中粗蛋白的含量。但本研究中添加BMF03菌株未顯著改善魚體的終末體質量、增重率以及特定生長率，這與在羅非魚[29]和凡納濱對蝦[30]中研究結果相似。這些不同的研究結果可能由于益生菌種類和劑量以及物種的特異性所導致，溫度、水質等環(huán)境因素也會影響益生菌對養(yǎng)殖對象的作用效果[ 31 ]。

結論

本實驗中，飼料中添加玉米赤霉烯酮短期內可促進鯽生長發(fā)育，但免疫參數測定和組織切片觀察結果表明，玉米赤霉烯酮對魚體的毒害作用明顯；BMF03 菌株可在一定程度上降解鯽飼料中玉米赤霉烯酮毒素。攝食添加BMF03 菌株的玉米赤霉烯酮污染飼料可緩解玉米赤霉烯酮在鯽體內的毒害作用，且不影響魚體生長性能，表明BMF03 菌株對攝食玉米赤霉烯酮污染飼料的鯽具有保護作用。