黃媛媛,譚美玲,薄瑞紅,余承波,張美詩(shī),楊長(zhǎng)根,王 福,趙家喜,余杞強(qiáng),阮祥春,6*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽合肥 230036;2.望江縣小月山農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,安徽望江 246200;3.霍山縣畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心,安徽霍山 237200;4.望江畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心,安徽望江 246200;5.宿松縣農(nóng)業(yè)綜合技術(shù)推廣服務(wù)中心,安徽宿松 246500;6.獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230036)

湖羊主要產(chǎn)于浙江嘉興和太湖地區(qū),成年公羊體重40～50 kg,母羊35～45 kg,耐熱、耐濕,慣舍飼,成熟早,肉質(zhì)好,母羊終年發(fā)情,繁殖力高。近年來(lái),隨著長(zhǎng)三角地區(qū)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)移速度的加快和安徽省皖江城市帶承接產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)移示范區(qū)的建設(shè),長(zhǎng)三角地區(qū)湖羊養(yǎng)殖快速向安徽省內(nèi)轉(zhuǎn)移[1],湖羊在安徽省的養(yǎng)殖數(shù)量和規(guī)模隨之不斷增加。

舍飼是湖羊的基本飼養(yǎng)方式。集約化養(yǎng)殖使得羊群密度增加,因飼養(yǎng)管理水平和防疫措施不到位,導(dǎo)致羊病的發(fā)生和流行呈上升趨勢(shì)。其中,以羊的呼吸道疾病尤為常見(jiàn)。羊呼吸道疾病的發(fā)生通常是由多種細(xì)菌引起的,常見(jiàn)的有多殺性巴氏桿菌、鏈球菌、肺炎支原體、肺炎克雷伯氏菌、溶血性曼氏體、卵形肺炎梅氏桿菌等。它們主要存在于羊的上呼吸道,在機(jī)體感染其他呼吸道致病菌后侵入下呼吸道,引起羊的慢性和持續(xù)性的咳嗽、呼吸困難、流涕和打噴嚏,部分可見(jiàn)急性纖維素性肺炎等主要臨床癥狀,此外還伴有不同類(lèi)型的發(fā)熱、精神沉郁、飲食欲減退或廢絕、生長(zhǎng)緩慢等,嚴(yán)重者往往還存在混合感染和繼發(fā)感染現(xiàn)象,使得疾病呈現(xiàn)復(fù)雜化[2-6]。

為了解湖羊呼吸道病原微生物的種類(lèi)及分布情況,筆者在安徽省霍山縣、望江縣和宿松縣的4個(gè)羊場(chǎng)共采集湖羊上呼吸道鼻拭子樣本598份,進(jìn)行細(xì)菌分離純化及鑒定,為湖羊呼吸道疾病的臨床診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2021年12月,在安徽省霍山縣、望江縣和宿松縣的4個(gè)不同規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng),按照90%的置信區(qū)間,共采集4—8月齡湖羊鼻拭子樣本598份。樣本保存于裝有1 mL胎牛血清LB肉湯的2 mL滅菌離心管中,2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定用接種環(huán)于離心管中蘸取胎牛血清LB肉湯,采用四區(qū)劃線法接種于胎牛血清LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂和腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基,挑選單菌落純化,于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察記錄菌落生長(zhǎng)情況。待菌落長(zhǎng)成,在超凈臺(tái)中挑取單菌落,用無(wú)菌水稀釋,在載玻片上進(jìn)行涂片、干燥、固定,然后進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢,觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.3 病原菌分子鑒定用接種環(huán)挑取形態(tài)學(xué)無(wú)法鑒別的病原菌菌落于50 μL Lysis Buffer 中,80 ℃恒溫水浴鍋加熱15 min,DNA提取完后保存于-20 ℃中備用。將提取的DNA用16S rDNA通用引物(27F:5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3;1492R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列。采用25 μL 反應(yīng)體系,即上游引物、下游引物各1 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)9.5 μL,ddH2O 12.5 μL,DNA 模板1 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min預(yù)變性,94 ℃ 45 s變性,60 ℃ 45 s退火,72 ℃ 72 s延伸,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min后延伸。取10 L PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)DNA片段長(zhǎng)度,并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶大小,確認(rèn)質(zhì)量合格、無(wú)明顯雜帶后,將經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序并拼接[5]。測(cè)得的序列結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上的“Blast”GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),獲取與所測(cè)序列相似度高的序列,判斷16S rDNA基因鑒定結(jié)果。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建取得雙向測(cè)序拼接后的完整病原菌DNA序列后,導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站上的“Blast”數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),設(shè)置參數(shù)Identify>95,再下載Identify最高的前12條16S rDNA序列,并利用MEGA7.0版本軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)后,采用MEGA7.0-Phylogeny繪制Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[7-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果采集的598份鼻拭子樣本中,通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定的菌株共391株,分別為葡萄球菌屬211株、大腸埃希氏菌屬102株、芽孢桿菌屬76株、多殺性巴氏桿菌和鏈球菌各1株。

2.2 病原菌分子學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.1分離菌株16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果。對(duì)形態(tài)學(xué)鑒定未知的菌株,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,擴(kuò)增獲得的目標(biāo)片段大小均約為1 500 bp,其中WJ61和HS100樣品菌株的電泳擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

注:M為DNA Marker,1為WJ61菌株,2為HS100菌株。Note:M is DNA Marker,1 is WJ61 strain,and 2 is HS100 strain.

2.2.2未知菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建與同源性比對(duì)。以WJ61菌株為例,獲得拼接過(guò)的完整細(xì)菌序列后,提交至NCBI“Blast”數(shù)據(jù)庫(kù)中,由MEGA7.0軟件制作系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。菌株WJ61的16S rDNA序列與紅沙雷氏菌JCM1240(登錄號(hào)為:NR-024644.1)、DSM4480(登錄號(hào)為:NR-114716.1)和NBRC103169(登錄號(hào)為:NR-114232.1)在同一側(cè)支上,同源性達(dá)100%,親緣關(guān)系最為接近。綜合其革蘭氏染色和測(cè)序結(jié)果,判定菌株WJ61為紅沙雷氏菌(圖2)。剩余10株未知菌株的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 未知菌株基因序列比對(duì)結(jié)果

圖2 WJ61菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建Fig.2 Phylogenetic tree construction of WJ61 strain

對(duì)未知菌株進(jìn)行16S rDNA基因PCR擴(kuò)增,再經(jīng)測(cè)序比對(duì)以及革蘭氏染色,共鑒定出11種不同菌株(細(xì)菌革蘭氏染色圖見(jiàn)圖3),分別為鮑曼不動(dòng)桿菌、糞腸球菌、紅沙雷氏菌、萊克勒西亞菌、銅綠假單孢菌、乳酸明串珠菌、奇異變形桿菌、普羅維登斯尼比亞菌、蒙氏腸球菌、河生雷特勒氏菌、假單孢菌。

2.3 病原菌檢出結(jié)果采集的598份湖羊鼻拭子病原菌檢出結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,598份鼻拭子樣本中共檢出445株菌株,分屬15個(gè)種屬,分別為葡萄球菌屬、腸球菌屬、芽孢桿菌屬、假單孢菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬、巴氏桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、變形桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、普羅維登西亞菌屬、萊克勒西亞菌屬和Lelliottia屬。檢出菌株數(shù)最多的為葡萄球菌屬,其次依次為腸桿菌屬和芽孢桿菌屬。葡萄球菌、大腸埃希氏菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌、蒙氏腸球菌、河生雷特勒氏菌、紅沙雷氏菌、乳酸明串珠菌、萊克勒西亞菌和銅綠假單孢菌均屬于條件致病菌。巴氏桿菌(1株)、鏈球菌(1株)、鮑曼不動(dòng)桿菌(5株)屬于羊呼吸道致病菌。

表2 4個(gè)湖羊場(chǎng)呼吸道微生物分布

從區(qū)域分布情況看,霍山縣241份樣本中共檢出223株菌株(檢出率92.53%),分屬9種菌屬;望江縣華陽(yáng)鎮(zhèn)180份樣本中共檢出74株菌株(檢出率41.11%),分屬6種菌屬;望江縣鴨灘鎮(zhèn)83份樣本中共檢出54株菌株(檢出率65.06%),分屬7種菌屬;宿松縣94份樣本中共檢出94株菌株(檢出率100%),分屬6種菌屬。其中,霍山縣樣本中呼吸道致病菌檢出率2.24%,宿松縣樣本中呼吸道致病菌檢出率2.13%,望江縣2個(gè)羊場(chǎng)的樣本中均未檢出上述呼吸道致病菌。

3 結(jié)論與討論

湖羊呼吸道疾病的發(fā)生通常是由多種細(xì)菌引起的。多殺性巴氏桿菌、溶血性鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌以及曼氏小體等是引起湖羊呼吸道疾病發(fā)生的主要致病菌,且與湖羊呼吸道疾病的持續(xù)感染有關(guān)[9]。

該試驗(yàn)按照90%的置信區(qū)間,從安徽省霍山縣、望江縣和宿松縣的4個(gè)湖羊養(yǎng)殖場(chǎng)共采集598份鼻拭子樣本,經(jīng)細(xì)菌分離純化、鑒定,共檢出445株菌株,分屬15個(gè)種屬,分別為葡萄球菌屬、腸球菌屬、芽孢桿菌屬、假單孢菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬、巴氏桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、變形桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬、普羅維登西亞菌屬、萊克勒西亞菌屬和Lelliottia屬。檢出菌株數(shù)最多的為葡萄球菌屬,其次依次為腸桿菌屬和芽孢桿菌屬。葡萄球菌、大腸埃希氏菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌、蒙氏腸球菌、河生雷特勒氏菌、紅沙雷氏菌、乳酸明串珠菌株、萊克勒西亞菌和銅綠假單孢菌均屬于條件致病菌。巴氏桿菌(1株)、鏈球菌(1株)、鮑曼不動(dòng)桿菌(5株)屬于羊呼吸道致病菌。從區(qū)域分布看,霍山縣241份樣本中共檢出223株菌株(檢出率92.53%),分屬9種菌屬;望江縣華陽(yáng)鎮(zhèn)180份樣本中共檢出74株菌株(檢出率41.11%),分屬6種菌屬;望江縣鴨灘鎮(zhèn)83份樣本中共檢出54株菌株(檢出率65.06%),分屬7種菌屬;宿松縣94份樣本中共檢出94株菌株(檢出率100%),分屬6種菌屬。其中,霍山縣樣本呼吸道致病菌檢出率最高(2.24%),其次為宿松縣(2.13%),望江縣2個(gè)羊場(chǎng)的樣本均未檢出上述呼吸道致病菌菌株。由此可見(jiàn),雖然這4個(gè)羊場(chǎng)的樣本中呼吸道致病菌檢出率較低,但葡萄球菌、大腸埃希氏菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌和銅綠假單孢菌等條件致病菌均有較高的檢出率。條件致病菌雖不能直接導(dǎo)致呼吸道疾病的發(fā)生,但在外界環(huán)境改變或機(jī)體自身免疫力下降時(shí),容易使得羊群產(chǎn)生其他疾病或感染,而在這個(gè)過(guò)程中就有可能誘發(fā)羊群呼吸道疾病的發(fā)生。

何川川[10]調(diào)查發(fā)現(xiàn),新疆部分地區(qū)健康羊呼吸系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌種分別為糞腸球菌、乳酸乳桿菌、羊莫拉菌、溶血不動(dòng)桿菌、鏈球菌和溶血性曼氏桿菌等。韓林梅[11]對(duì)廣西6個(gè)地區(qū)的73份樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),廣西部分地區(qū)主要以肺炎支原體、肺炎克雷伯氏菌和化膿隱秘桿菌等的感染為主。該試驗(yàn)采集的598份樣本中,優(yōu)勢(shì)菌株主要為葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌等條件致病菌,霍山縣樣本中還檢出了鏈球菌、蒙氏腸球菌、銅綠假單孢菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、河生雷特勒氏菌和多殺性巴氏桿菌;望江縣樣本中檢出了乳酸明串珠菌、紅沙雷氏菌、普羅維登斯尼比亞菌和奇異變形菌;宿松縣樣本中檢出了鮑曼不動(dòng)桿菌和萊克勒西亞屬。說(shuō)明湖羊呼吸道病原微生物種類(lèi)存在一定的地區(qū)性差異。

該研究結(jié)果表明,安徽省霍山縣、望江縣和宿松縣的湖羊呼吸道病原微生物中優(yōu)勢(shì)菌株主要為葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌等條件致病菌,巴氏桿菌、鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等致病菌檢出率較低。所以,了解該區(qū)域內(nèi)的湖羊呼吸道病原微生物的種類(lèi)和分布情況,對(duì)于合理選擇敏感藥物來(lái)進(jìn)行科學(xué)防治具有指導(dǎo)意義。