徐 瑞，陳素文，段亞飛，張文文，王 珺，周傳朋，王 蕓

（1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣州 510300）

帚狀江蘺（Gracilariaedulis），隸屬于紅藻門（Rhodophyta），江蘺目（Gracilariales），江蘺科（Gracilariaceae），江蘺屬，是一種主要分布于海南省和廣東省沿海的大型海藻［1－2］。帚狀江蘺不僅具有改善水體環(huán)境、修復生態(tài)系統(tǒng)的功能［3－4］，且富含海藻多糖、藻膠、多種氨基酸和微量元素，是生產(chǎn)工業(yè)瓊膠和制作水產(chǎn)動物餌料的重要原料［5－7］。最新研究表明，帚狀江蘺提取物在抗菌和抑制腫瘤細胞增殖等醫(yī)學領域亦發(fā)揮作用［8－10］。目前獲得帚狀江蘺的途徑主要依靠捕撈野生資源，因此，為了實現(xiàn)帚狀江蘺種質資源的可持續(xù)利用，需要開展帚狀江蘺種質資源的鑒定評價與遺傳多樣性分析。

質體基因組和線粒體基因組具有細胞質基質基因組單系遺傳和克隆進化的特征，在植物群體遺傳學研究中應用廣泛［11］。其中，質體UPA基因（質體23S rRNA V區(qū)域）作為通用擴增子，具有通用性強、擴增率高等特點，在大型海藻的分子鑒定中常被選為候選標記［12－14］。線粒體COⅠ基因片段具有母系遺傳、進化速度快的特點［15］，已被公認為是有效區(qū)分不同動物物種的DNA條形碼標準區(qū)域［16］，作為海洋紅藻的DNA條形碼，可以用于區(qū)分親緣關系相近的物種和種內群體的生物地理亞群［17－18］。本研究采集了海南省文昌和鶯歌海潮間帶的野生帚狀江蘺，對其質體UPA基因片段和線粒體COⅠ基因片段進行了序列分析，并結合GenBank數(shù)據(jù)庫中紅藻門其他藻類的UPA和COⅠ序列，從分子水平上對其遺傳距離與系統(tǒng)進化進行分析，以期為帚狀江蘺種質鑒定和系統(tǒng)進化研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

帚狀江蘺樣品于2020年7月采自海南文昌和鶯歌海近海潮間帶，采集30株整株藻體，活體運回實驗室，取藻體幼嫩莖葉組織置于95%乙醇，－20℃保存，以待后續(xù)提取DNA。

1.2 DNA的提取與PCR擴增測序

取出95%乙醇中保存的帚狀江蘺莖葉組織吸干水分（約20 mg），采用液氮研磨和吸附柱法提取樣品DNA，試劑盒選用廣州邁寶瑞生物科技有限公司的磁珠法植物DNA提取試劑盒。提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀檢測后于－80℃保存。

以帚狀江蘺基因組DNA為模板，進行UPA基因片段和COⅠ基因片段的擴增，引物的選擇參照文獻［12］和文獻［18］（表1）。引物p23SrV＿F和p23SrV＿R在紅藻門中具有較好的擴增效果，目前已在紅藻門和綠藻門中成功擴增多個物種［12，19－22］；COⅠ基因選用的引物GazF1和GazR1是目前紅藻門、褐藻門藻類最常用的引物［18－22］。引物購自上海生工生物工程股份有限公司，PCR試劑購自艾科瑞生物工程有限公司，反應體系參照試劑說明。

表1 本實驗所用引物序列及反應程序Tab.1 Primer sequences and reaction procedure used in this study

將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗過有明亮清晰條帶的產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司進行純化回收測序。為避免測序機器測量誤差及確保PCR產(chǎn)物為目的基因擴增產(chǎn)物，每個樣品做兩個平行，送兩管PCR產(chǎn)物進行測序。

1.3 序列分析

使用SeqMan程序對測序數(shù)據(jù)進行峰圖校正和序列拼接，通過BLAST比對確定所獲得序列為目的基因片段，利用MEGA 11進行序列比對并去除引物兩端序列，獲得完整目的基因序列。利用DNAsp 6.0計算序列核苷酸多樣性指數(shù)和單倍型多樣性指數(shù)，并用MEGA 11計算序列堿基組成，基于Kimura-2-parameter模型計算帚狀江蘺種內和種間遺傳距離，利用鄰接法（neighbor joining method）構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap value設置為1 000次重復［23］。

2 結果與分析

2.1 序列組成分析

帚狀江蘺UPA和COⅠ基因片段PCR產(chǎn)物經(jīng)測序拼接后，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，確認所得序列為江蘺的UPA和COⅠ基因片段。利用MEGA 11軟件進行序列比對，刪去測序不準確的序列，分別得到370 bp的UPA基因片段和664 bp的COⅠ基因片段。

30個帚狀江蘺樣品的UPA基因片段共檢測到1種單倍型，無多態(tài)性位點，堿基T、C、A、G和A＋T的平均含量分別為26.2%、16.2%、30.3%、27.3%和56.5%。30個帚狀江蘺樣品的COⅠ基因片段共檢測到2種單倍型（hap1、hap2），3個多態(tài)性位點，均為簡約信息位點，其中轉換位點2個，均為A／G轉換，分別在第325和第379位點，顛換位點1個，為A／C顛換，位于第532位點，轉換顛換比值為2.0（表2）。序列無缺失和插入位點；堿基T、C、A、G和A＋T的平均含量分別為39.2%、15.1%、27.6%、18.1%和66.8%，與其他藻類的堿基組成研究結果一致［24－25］。

表2 帚狀江蘺不同單倍型CO I 基因序列的變異位點分布Tab.2 Distribution of variab le sites of CO I gene sequence from different hap lotypes of G.edu lis

利用DNAsp 6.0軟件對帚狀江蘺UPA和COⅠ基因片段的遺傳多樣性參數(shù)進行統(tǒng)計（表3）。其中，UPA基因只有1種單倍型，各項遺傳多樣性參數(shù)均為0，UPA基因片段的遺傳多樣性參數(shù)均低于COⅠ基因片段，說明UPA基因片段比COⅠ基因片段更保守。

表3 帚狀江蘺UPA和CO I 基因片段的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of UPA and CO I gene fragments of G.edulis

2.2 基于UPA基因的遺傳距離與系統(tǒng)進化分析

從GenBank中選擇15種紅藻的UPA序列作為外群物種的UPA序列，包含江蘺屬、角叉菜屬（Chondrus）、海頭紅屬（Plocamium）、沙菜屬（Hypnea）、蜈蚣藻屬（Grateloupia）、石花菜屬（Gelidium）和仙菜屬（Ceramium）共7個屬。外群物種的序列信息見表4，15個外群物種的UPA基因序列堿基含量差異不大，相同屬的堿基含量則更為接近。

表4 外群物種UPA基因序列基本信息Tab.4 Basic data of UPA gene sequences of outgroup species

基于Kimura-2-parameter模型，計算得到PCR擴增帚狀江蘺UPA基因序列的1種單倍型與15種外群物種UPA序列的遺傳距離（表5）。江蘺屬中，傘房江蘺（Gracilariacoronopifolia）與扁江蘺（Gracilariatextorii）遺傳距離最近，為0.025；帚狀江蘺與真江蘺（Gracilariavermiculophylla）遺傳距離最遠，為 0.089。16 種藻類中，石花菜（Gelidium amansi）和細毛石花菜（Gelidium crinale）遺傳距離最近，為0.005，真江蘺與細毛石花菜遺傳距離最遠，為0.152。不同屬間，海頭紅屬與沙菜屬間遺傳距離最近，江蘺屬和石花菜屬間遺傳距離最遠。

表5 基于UPA基因片段的Kimura-2-parameter遺傳距離（對角線左下）Tab.5 K imura-2-parameter genetic distances（lower left of the diagonal）based on UPA gene fragments

鄰接法構建的16種紅藻的UPA基因系統(tǒng)進化樹（圖1）顯示，傘房江蘺與扁江蘺先匯為一支，真江蘺和縊江蘺（Gracilariasalicornia）先匯為一支，這二支匯聚后再與帚狀江蘺匯聚，最后再與龍須菜（Gracilarialemaneiformis）匯聚為江蘺屬。沙菜屬、仙菜屬和石花菜屬首先分別聚為一支，隨后，石花菜屬與仙菜屬匯為一支，沙菜屬與海頭紅匯為一支，蜈蚣藻屬和角叉菜匯為一支，最后與江蘺屬匯聚。

2.3 基于CO I 基因的遺傳距離與系統(tǒng)進化分析

從GenBank中選擇15種紅藻的COⅠ序列作為外群物種的COⅠ序列，包含江蘺屬、角叉菜屬、海頭紅屬、沙菜屬、蜈蚣藻屬、石花菜屬和仙菜屬共7個屬。外群物種的序列信息見表6，15個外群物種的COⅠ基因序列堿基含量差異不大。A＋T含量顯著高于C＋G，相同屬藻類的堿基含量更為接近。

表6 外群物種CO I 基因序列信息Tab.6 Data of CO I gene sequences of outgroup species

基于Kimura-2-parameter模型，計算得到PCR擴增的帚狀江蘺COⅠ基因序列的2種單倍型（hap1、hap2）與15種外群物種COⅠ序列的遺傳距離（表7），帚狀江蘺2種單倍型的遺傳距離為0.005。江蘺屬中，縊江蘺和傘房江蘺遺傳距離最近，為0.127，扁江蘺和龍須菜遺傳距離最遠，為0.175。16種藻類中，帶型蜈蚣藻和蜈蚣藻間遺傳距離最近，為0.120；扁江蘺和三叉仙菜（Ceramiumkondo）遺傳距離最遠，為0.275。不同屬間，江蘺屬與仙菜屬遺傳距離最遠，海頭紅屬和角叉菜屬遺傳距離最近。

表7 基于CO I 基因片段的K imura-2-parameter遺傳距離（對角線左下）Tab.7 K imura-2-parameter genetic distances（lower left of the diagonal）based on CO I gene fragments

鄰接法構建的16種紅藻的COⅠ基因系統(tǒng)進化樹（圖2）顯示，傘房江蘺和扁江蘺先匯為一支，真江蘺和縊江蘺分別獨立為一支，帚狀江蘺的2種單倍型聚在一起成一支，這5種江蘺匯聚后再與龍須菜匯為江蘺屬。石花菜屬、蜈蚣藻屬、海頭紅、角叉菜、沙菜屬和仙菜屬先各自分別匯為一支，隨后，沙菜屬與角叉菜和海頭紅匯為一支，然后再與蜈蚣藻屬和江蘺屬匯聚，最后與石花菜屬和仙菜屬匯聚。

圖2 基于CO I 基因片段構建的NJ進化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree based on CO I gene fragments

3 討論

3.1 帚狀江蘺UPA和CO I 基因片段的序列比較

本研究采用PCR技術對帚狀江蘺的UPA和COⅠ基因序列進行擴增，分別得到370 bp和664 bp的基因序列，序列分析結果表明，帚狀江蘺UPA基因和COⅠ基因的A＋T含量（分別為56.5%和66.8%）均高于G＋C。SHERWOOD等［25］研究發(fā)現(xiàn)，紅藻門藻類COⅠ基因的A＋T含量大于60%，而UPA基因的堿基含量更為均衡，A＋T和G＋C含量通常各約占50%。相關研究表明，相對于COⅠ基因，UPA基因進化速度更慢，更為保守；COⅠ基因比UPA基因擁有更高的變異度［14］。

本研究中，帚狀江蘺的野生群體30個樣本中，UPA基因只檢測出1個單倍型，COⅠ基因則檢測出2個單倍型和3個多態(tài)性位點，COⅠ基因片段的各項遺傳參數(shù)均高于UPA基因片段。結果表明，與COⅠ基因序列相比，UPA基因序列的遺傳變異更小，序列更保守。本研究中，UPA片段只檢測到一種單倍型，推測與UPA基因的保守性相關。SHERWOOD等［25］的研究表明，由于COⅠ基因是一個編碼基因，密碼子的第3個堿基位點的差異是大部分變異的來源，COⅠ基因片段顯示出最大的置換飽和度，而UPA基因片段則沒有顯示出置換飽和度，這也驗證了UPA基因更加保守。對沙菜屬的研究結果表明，COⅠ基因在6個沙菜種間的差異為10.1%～16.3%，而UPA基因只有2.5%～4.4%的種間差異，也證明了UPA基因的保守性［26］。本研究中，帚狀江蘺UPA基因片段與傘房江蘺、縊江蘺、扁江蘺、真江蘺和龍須菜的序列差異分別為4.5%、7.1%、5.0%、8.9%和8.6%，而帚狀江蘺COⅠ基因片段與傘房江蘺、縊江蘺、扁江蘺、真江蘺和龍須菜的序列差異均大于10.0%。UPA和COⅠ基因均能夠區(qū)分江蘺屬內不同種間的物種，本研究表明，UPA基因不適合帚狀江蘺種內的遺傳多樣性分析，但仍能用于屬內種間的物種鑒定；與UPA基因相比較，COⅠ基因適用于帚狀江蘺種內遺傳多樣性分析，在物種鑒定上也更具優(yōu)勢。但本研究中，UPA基因只檢測到1種單倍型，COⅠ基因也只檢測到2種單倍型，且COⅠ基因的3個變異位點中包含2個轉換位點和1個顛換位點，轉換顛換比值高，COⅠ基因變異尚未達到飽和，也反映了海南海域的帚狀江蘺種質資源相對單一。

3.2 帚狀江蘺的系統(tǒng)進化

本研究中，基于UPA基因的江蘺屬內的遺傳距離為0.025～0.089，基于COⅠ基因的江蘺屬內遺傳距離為0.136～0.175，帚狀江蘺種內遺傳距離為0.005，符合相關研究中提出的種間差異大于種內差異的10倍的標準［27］。COⅠ基因的種間差異度高，已經(jīng)作為DNA條形碼成功鑒定了許多紅藻物種［28－29］。

對于傳統(tǒng)形態(tài)學難以鑒定的生物，DNA序列分析提供了一個分類新工具，同時也被廣泛應用于系統(tǒng)進化關系的研究［30］?；贑OⅠ基因構建的NJ系統(tǒng)進化樹表明，帚狀江蘺與傘房江蘺、縊江蘺、扁江蘺、真江蘺、龍須菜匯聚為一支，江蘺屬、沙菜屬、仙菜屬、石花菜屬和海頭紅屬各自匯成獨立的一支，這與形態(tài)學分類結果一致［1，31］?；赨PA基因構建的NJ進化樹在江蘺屬內和蜈蚣藻屬的劃分和COⅠ基因有些不一致：UPA構建的進化樹中，縊江蘺和真江蘺、傘房江蘺和扁江蘺分別匯為一支，而COⅠ構建的進化樹中，縊江蘺和真江蘺被分為獨立的兩支，傘房江蘺和扁江蘺匯為一支；UPA構建的進化樹中，蜈蚣藻被單獨分為一支，帶形蜈蚣藻與角叉菜匯為一支，而COⅠ構建的進化樹中，蜈蚣藻屬的兩個種匯聚到一起，角叉菜單獨一支。黃艷等［20］的研究中，同樣也出現(xiàn)UPA基因無法區(qū)分親緣關系較近的種的現(xiàn)象。相較于UPA基因，COⅠ更能區(qū)分親緣關系更近的物種。結合形態(tài)學分類特征，COⅠ基因比UPA基因更適合構建紅藻的系統(tǒng)進化關系；COⅠ基因適合進行屬內種間的系統(tǒng)進化分析，UPA基因則適合在更高階的分類單元應用。

大型海洋藻類種類繁多，形態(tài)復雜，采用單一的形態(tài)鑒定方法確定物種較為困難。DNA條形碼技術多應用于獲取未鑒定生物的分類學信息［32］，在大型海藻的鑒定和遺傳分析中也被廣泛應用［33］，本研究所選用的UPA和COⅠ基因片段在紅藻門藻類的分子鑒定中具有較高的適用性［34］。UPA基因在分析帚狀江蘺的遺傳多樣性時，其保守性可能會導致對南海海區(qū)帚狀江蘺遺傳多樣性的低估，但UPA序列易于獲取，通用性強，仍可作為紅藻門DNA條形碼的一個備選。COⅠ基因在本研究和其他學者的研究中，均表現(xiàn)出較強的區(qū)分物種的能力，適合作為紅藻門藻類的DNA條形碼，但也有研究表明，COⅠ基因在某些藻類中存在擴增和測序方面的問題［35］。

用于研究海洋藻類的DNA條形碼還有許多，本研究僅選擇了UPA和COⅠ基因對帚狀江蘺進行評估，未來將選擇更多DNA條形碼進行海洋藻類種質資源及遺傳多樣性研究。本研究結果顯示，南海海區(qū)帚狀江蘺種質資源相對單一，未來應著手開展江蘺資源保護工作。