袁峰 馮丹 李少軍 張書(shū)力 李敏 胡焓 童勝雄 田佳玉

武漢市第一醫(yī)院疼痛科（武漢 430022）

水痘-帶狀皰疹病毒（Varicella-zoster virus，VZV）感染神經(jīng)節(jié)是帶狀皰疹（Herpes zoster，HZ）發(fā)生的病因，而其潛伏于神經(jīng)節(jié)內(nèi)是導(dǎo)致帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛（Post-herpetic neuralgia，PHN）的重要機(jī)制之一［1］。雖然目前對(duì)于PHN 的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，但VZV 所誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫在其中扮演著重要角色［2］。眾所周知，病毒感染后的細(xì)胞免疫是機(jī)體清除病毒的關(guān)鍵步驟，且各類(lèi)型病毒所引起的細(xì)胞免疫具有特異性，故其對(duì)于疾病的發(fā)生及發(fā)展都具有較好的反應(yīng)作用［3-4］。因此本研究擬對(duì)VZV 感染后的特異性免疫反應(yīng)進(jìn)行分析，并根據(jù)分析結(jié)果建立PHN 發(fā)生的預(yù)測(cè)模型，旨在為指導(dǎo)臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 健康人群 選擇2021 年1 月至2022 年6 月于我院體檢中心明確為健康的成年人10 例作為PBMC 提取對(duì)象，所有人在既往均有明確的水痘病史，且已經(jīng)治愈。

1.1.2 HZ 患者 選擇2021 年1 月至2022 年6 月于我院就診的HZ 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合HZ 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且為初次診斷［5］；（2）年齡≥18 周歲；（3）患者或家屬充分知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病原學(xué)檢查明確合并其他病原體感染；（2）嚴(yán)重肝腎功能不全；（3）合并其他自身免疫性疾??；（4）合并其他惡性腫瘤疾病；（5）嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾?。唬?）經(jīng)評(píng)估后可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的其他因素。符合上述條件，并報(bào)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)后（編號(hào)：2100010305）共計(jì)納入患者70例。

1.2 方法

1.2.1 PBMC 提取 抽取樣本（HZ 患者取開(kāi)始治療前）清晨空腹外周靜脈血3 mL，置于EDTA 管內(nèi)保存，采用密度梯度離心法分離PBMC，置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2.2 VZV 特異性細(xì)胞免疫模型構(gòu)建 參照文獻(xiàn)［6］中方案構(gòu)建VZV 特異性細(xì)胞免疫模型，具體如下：將健康人群樣本PBMC 分為兩組，分別在含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、1% L-谷氨酰胺的完全1640 培養(yǎng)基（PRMI 公司生產(chǎn)）中解凍，并制備成1 × 107cells/mL 的PBMC 細(xì)胞液。將3 種VZV特異性肽庫(kù)（gE、IE62、IE63）（由德國(guó)JPT Peptide Technologies 公司提供）混合后制備病毒濃度為10 μg/mL 的病毒液，并在96 孔U 型板（100 μL/孔，廣州潔特生物過(guò)濾股份有限公司提供）加入病毒液20 μL 及PBMC 細(xì)胞液80 μL 混合作為VZV 組；1%二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO；Sigma 公司提供）20 μL 及PBMC 細(xì)胞液80 μL 混合作為對(duì)照組。兩組細(xì)胞均于37 ℃下反應(yīng)24 h 后，收集上清液并儲(chǔ)存在-80 ℃下用于細(xì)胞因子檢測(cè)，U 型板孔底含有細(xì)胞的懸液用于流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.2.3 流式細(xì)胞檢測(cè) 采用賽默飛世爾公司提供的Attune NxT 流式細(xì)胞儀完成本次實(shí)驗(yàn)，主要對(duì)所有樣本的T 細(xì)胞（CD3+、CD4+、CD8+）及PD-1+的CD4+T 淋巴細(xì)胞占比進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以陽(yáng)性率（%）表示。

1.2.4 VZV 特異性細(xì)胞因子檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）（試劑盒均由武漢塞培生物科技公司提供）測(cè)定所有樣本PBMC 上清液中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL-2）水平。

1.2.5 HZ患者PBMC內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè) 采用1.2.2中的方式對(duì)納入研究的70 例HZ 患者進(jìn)行PBMC細(xì)胞液制備，于37 ℃下靜置24 h 后，根據(jù)VZV 特異性細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果，對(duì)具有差異的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 隨訪(fǎng)方案 所有入組的HZ 患者均按照文獻(xiàn)［5］當(dāng)中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行為期半年的隨訪(fǎng)，而后根據(jù)文獻(xiàn)［7］當(dāng)中對(duì)于PHN 診斷標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)隨訪(fǎng)期間PHN發(fā)生情況，并根據(jù)隨訪(fǎng)結(jié)果將所有患者分為PHN組及非PHN 組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0 軟件。計(jì)數(shù)資料以例表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用COX 回歸分析PHN 發(fā)生的危險(xiǎn)因素；建立ROC曲線(xiàn)分析VZV 特異性細(xì)胞因子對(duì)PHN 發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值，曲線(xiàn)下面積（area under the curve，AUC）比較采用Z檢驗(yàn)；P＜0.05 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VZV 組及對(duì)照組流式細(xì)胞結(jié)果比較 VZV 組患者CD4+T 細(xì)胞占比低于對(duì)照組，而CD8+T 細(xì)胞及PD-1+CD4+T 細(xì)胞占比高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 VZV 組及對(duì)照組流式細(xì)胞結(jié)果比較Fig.1 Comparison of flow cytometry results in VZV group and control group

2.2 VZV 組及對(duì)照組細(xì)胞因子情況比較 兩組患者PBMC 上清液中IFN-γ、IL-2 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），VZV 組患者PBMC 上清液中TNF-α 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 VZV 組及對(duì)照組細(xì)胞因子情況比較Fig.2 Comparison of cytokines level between VZV group and control group

2.3 PHN組與非PHN組TNF-α、CD4+T比較 截至2022 年12 月31 日隨訪(fǎng)結(jié)束，共計(jì)6 例患者因失訪(fǎng)視為脫落，剩余64 例帶狀皰疹患者中，共計(jì)17 例患者發(fā)生PHN，PHN 發(fā)生率為26.56%。兩組患者臨床資料比較結(jié)果提示：PHN 組患者合并前區(qū)疼痛占比、多階段發(fā)病占比、發(fā)病至開(kāi)始治療時(shí)間及PBMC 上清液的TNF-α 水平均高于非PHN 組，CD4+T 細(xì)胞百分比低于非PHN 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 PHN 組與非PHN 組TNF-α、CD4+T 比較Tab.1 Comparison of TNF-α and CD4+T between the two groups例（%）

2.4 HZ 患者PHN 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的COX 回歸分析COX 回歸分析結(jié)果顯示：PBMC 上清液TNF-α 水平（HR= 1.148）是HZ 患者PHN 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 HZ 患者PHN 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的COX 回歸分析Tab.2 COX regression analysis of PHN risk in patients with herpes zoster ±s

表2 HZ 患者PHN 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的COX 回歸分析Tab.2 COX regression analysis of PHN risk in patients with herpes zoster ±s

因素發(fā)病至開(kāi)始治療時(shí)間CD4+T PBMC 上清液TNF-α合并前驅(qū)疼痛多階段發(fā)病常量β 值0.429-0.024 0.138 0.902 1.356-10.737標(biāo)準(zhǔn)誤0.342 0.024 0.045 1.069 0.972 3.827 Wald χ2 95%CI 1.574 0.934 9.383 0.712 1.946 7.873 P 值0.212 0.334 0.002 0.399 0.163 0.005 HR 1.536 0.977 1.148 2.464 3.882＜0.001下限0.786 0.931 1.051 0.303 0.577上限3.004 1.025 1.254 20.032 26.112

2.5 PBMC 內(nèi)TNF-α 預(yù)測(cè)HZ 患者PHN 發(fā)生的ROC 分析 以PBMC 內(nèi)TNF-α 指標(biāo)建立預(yù)測(cè)PHN的ROC 曲線(xiàn)，結(jié)果顯示：PBMC 上清液中TNF-α 對(duì)于PHN 發(fā)生具有較好的預(yù)測(cè)效果（AUC = 0.902，P＜0.001，95%CI：0.821 ～0.981），見(jiàn)圖3。預(yù)測(cè)的截?cái)嘀禐椋?4.36 pg/mL，預(yù)測(cè)敏感度為82.35%，特異度為85.11%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為66.67%，陰性預(yù)測(cè)值為93.02%。

圖3 PBMC 內(nèi)TNF-α 預(yù)測(cè)HZ 患者PHN 發(fā)生的ROC 分析Fig.3 ROC analysis of TNF-α in PBMC to predict PHN occurrence in patients with herpes zoster

3 討論

PHN 的治療一直以來(lái)是臨床上HZ 相關(guān)性疼痛治療中的難點(diǎn)，目前雖然通過(guò)神經(jīng)阻斷、富血小板血漿、中西醫(yī)結(jié)合等各種治療方式可以取得較好的療效，但治療不可能一蹴而就，在此過(guò)程中部分患者仍需要承受較大的痛苦［8］。早期發(fā)現(xiàn)危險(xiǎn)因素較高的HZ 患者并采取多學(xué)科干預(yù)治療方案能夠減少PHN 的發(fā)病率，從源頭上解決PHN發(fā)病的可能性，是目前臨床上干預(yù)PHN 較好的方案之一［9］。

目前在國(guó)內(nèi)針對(duì)PHN 發(fā)生的相關(guān)因素研究中，關(guān)鍵指標(biāo)主要集中于一般臨床資料。結(jié)合國(guó)外文獻(xiàn)進(jìn)行分析后，筆者認(rèn)為由于臨床常用的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)中混合有多種血液細(xì)胞，會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響［10］。本研究在設(shè)計(jì)之初經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，PBMC 種類(lèi)相對(duì)單一，且其中包含的淋巴細(xì)胞是參與到PHN 發(fā)生的重要因素，故作為預(yù)測(cè)因子特異性相對(duì)較好。而通過(guò)基礎(chǔ)研究對(duì)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證后開(kāi)展臨床研究更具有針對(duì)性，故在臨床研究前還對(duì)VZV 感染后的特異性指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)。

針對(duì)VZV 感染后的PMBC 細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果中，各類(lèi)型淋巴細(xì)胞占比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。首先，絕大部分HZ 患者是由于體內(nèi)潛伏的VZV 再次活化，而CD4+T 細(xì)胞分化的記憶性CD4+T 細(xì)胞在被VZV 激活后會(huì)立即活化并啟動(dòng)免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抗病毒的效果［11-12］。但由于VZV 會(huì)通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡抑制蛋白的表達(dá)并激活Fas 信號(hào)途徑，從而誘導(dǎo)CD4+細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到免疫逃逸的效果，故PHN 組CD4+T 細(xì)胞會(huì)明顯降低。在MERCAN等［13］的研究中指出，在VZV 病毒感染程中，CD8+T細(xì)胞會(huì)受到激活從而大量浸潤(rùn)到HZ 患者神經(jīng)節(jié)中，從而導(dǎo)致疼痛的發(fā)生，這一結(jié)果與本次研究相符?？梢?jiàn)，CD4+T 功能下降是導(dǎo)致VZV 再激活及發(fā)病的重要因素。在一項(xiàng)針對(duì)淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）的研究中指出，當(dāng)PD-1/PD-L1 軸被抑制后，LCMV載量會(huì)明顯下降，說(shuō)明PD-1+CD4+T 細(xì)胞會(huì)與PD-L1結(jié)合并導(dǎo)致細(xì)胞功能抑制，從而導(dǎo)致病毒復(fù)制［14］。

本研究中VZV 感染后PD-1 陽(yáng)性表達(dá)的PD-1+CD4+T 細(xì)胞明顯升高，再次證實(shí)了VZV 可能與LCMV 病毒類(lèi)似，會(huì)導(dǎo)致CD4+T 細(xì)胞功能抑制，從而達(dá)到促進(jìn)病毒復(fù)制的作用。在選擇細(xì)胞因子指標(biāo)的考量上，本研究所納入的IFN-γ、IL-2 及TNF-α均是在之前研究中被證實(shí)與PHN 之間可能存在相關(guān)性的因子［15］。而需要補(bǔ)充說(shuō)明的是，白細(xì)胞介素中與PHN 相關(guān)的因素相對(duì)較多，但我們通過(guò)總結(jié)既往研究中PHN 患者與普通患者實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)之間的差異結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-2 可能是導(dǎo)致其他白細(xì)胞介素改變的關(guān)鍵因素，故僅采用IL-2 代表白細(xì)胞介素加入研究［16］。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩組患者中IFN-γ、IL-2 并無(wú)明顯差異，考慮可能是因?yàn)楸敬窝芯克{入的患者均為急性期HZ 患者，上述兩個(gè)指標(biāo)可能受到病情的影響，故并無(wú)顯著差異。TNF-α 是機(jī)體對(duì)于腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷炎性細(xì)胞因子，但在VZV 感染的患者中，反而會(huì)因?yàn)門(mén)NF-α 激活導(dǎo)致感染的神經(jīng)局部炎性反應(yīng)加重的情況發(fā)生，從而會(huì)導(dǎo)致患者發(fā)生疼痛等并發(fā)癥，而其激活受到CD4+T 及CD8+T 細(xì)胞的影響［17］。

本研究PHN 發(fā)生率為26.56%，與共識(shí)當(dāng)中的數(shù)據(jù)相符［6］。針對(duì)后續(xù)存在差異的指標(biāo)進(jìn)行分析：（1）兩組患者合并前屈疼痛存在差異，主要是由于VZV 病毒多數(shù)潛伏于神經(jīng)中，血液中分布較少，故檢出率較低，往往等到后期出現(xiàn)皮疹以后才能明確HZ 診斷并對(duì)癥治療，但VZV 再發(fā)后疼痛發(fā)生的時(shí)間可能相對(duì)較早，病程相對(duì)較長(zhǎng)，故發(fā)生PHN 的可能性也會(huì)增大；（2）開(kāi)始治療時(shí)間預(yù)示著病毒復(fù)制的時(shí)間，在未開(kāi)始治療期間，病毒復(fù)制控制相對(duì)更差，故此類(lèi)患者局部病毒載量往往更高，清除相對(duì)難度更大，故PHN 發(fā)生率較高；（3）發(fā)病階段指標(biāo)差異也相對(duì)容易理解，由于發(fā)病節(jié)段多預(yù)示著神經(jīng)損傷更嚴(yán)重，故后續(xù)發(fā)生PHN 概率也會(huì)增加；（4）TNF-α 是由PBMC 中的淋巴細(xì)胞介導(dǎo)所釋放，且有研究［18］指出，TNF-α 相對(duì)集中于CD4+T 及CD8+T 細(xì)胞周?chē)试赑HN 患者PBMC 上清液中的TNF-α 含量也會(huì)相對(duì)升高。需要特別指出的是，針對(duì)外周血中的TNF-α 對(duì)比結(jié)果不存在差異，分析原因可能由于外周血中組成成分更多，且更復(fù)雜，會(huì)稀釋TNF-α 的含量，從而外周血中的TNF-α 水平低于PBMC 上清液當(dāng)中的TNF-α 水平，且兩組之間比較并無(wú)顯著差異。

隨后的多因素分析結(jié)果再次說(shuō)明了PBMC 上清液當(dāng)中的TNF-α 水平是影響PHN 發(fā)病的獨(dú)立因素，再次說(shuō)明TNF-α 是影響PHN 發(fā)生的特異性細(xì)胞免疫因子，且對(duì)于PBMC 上清液當(dāng)中的TNF-α 水平對(duì)于PHN 發(fā)生預(yù)測(cè)的ROC 結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明具有較好的預(yù)測(cè)效果，可以作為HZ 患者PHN 發(fā)生的預(yù)測(cè)因子之一。

本研究的局限性為，樣本量相對(duì)較小，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差，同時(shí)PMBC 提取相對(duì)復(fù)雜，對(duì)于臨床實(shí)用性有限。結(jié)果提示TNF-α 是影響PHN 發(fā)生的VZV 特異性細(xì)胞免疫因子，故今后可以進(jìn)一步增加樣本量，同時(shí)開(kāi)展多中心研究評(píng)估外周血TNF-α 水平與HZ 患者發(fā)生PHN 之間的關(guān)系，對(duì)本次研究進(jìn)行補(bǔ)充，同時(shí)為臨床治療提供指導(dǎo)。

【Author contributions】YUAN Feng conceptualized，methodized and wrote original draft.FENG Dan supervised，wrote review and edited.LI Shaojun，ZHANG Shuli and LI Min investigated and validated the data.HU Han，TONG Shengxiong and TIAN Jiayu investigated and TIAN Jiayu investigated and contributed to formal analysis.All authors read and approved the final manuscript as submitted.