陳紫荊, 孫朝陽, 張玉英, 楊思林, 魏春廳, 羅建平

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.安徽省華信生物藥業(yè)股份有限公司,安徽 界首 236502)

硒(Se)是一種人體必需的微量元素,為機(jī)體維護(hù)免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、延緩衰老等生理功能所必需,缺硒不僅會誘發(fā)克山病、大骨節(jié)病的發(fā)生,而且增加心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、運動系統(tǒng)等疾病發(fā)生的風(fēng)險[1-3]。自然界中,硒分為無機(jī)硒和有機(jī)硒2種形式,由于無機(jī)硒生物利用度低且對人體毒性大,因此攝取富含硒蛋白、硒氨基酸等有機(jī)硒是人體補(bǔ)硒的主要途徑,目前富硒酵母是最易獲得、使用最為安全有效的人及動物的補(bǔ)硒來源[4-6]。

富硒酵母是酵母細(xì)胞在含有無機(jī)硒的培養(yǎng)基中經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)所得。研究表明,酵母的富硒水平受限于發(fā)酵培養(yǎng)過程中酵母細(xì)胞將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的能力,不僅與無機(jī)硒的添加方式有關(guān),而且與無機(jī)硒由酵母細(xì)胞外進(jìn)入胞內(nèi)及胞內(nèi)無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒反應(yīng)中輔助因子供應(yīng)有關(guān)[7-9]。因此,在優(yōu)化無機(jī)硒添加方式的同時促進(jìn)無機(jī)硒有效進(jìn)入胞內(nèi),提高酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化無機(jī)硒為有機(jī)硒的能力,可以有效地促進(jìn)高富硒酵母的生產(chǎn)。

無機(jī)硒的添加方式以添加時間和添加濃度最為關(guān)鍵[7-9],還原型輔酶Ⅱ(NADPH)是酵母細(xì)胞中既直接參與無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒反應(yīng)的輔助因子,又是反應(yīng)過程中產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物的還原劑,果糖可促進(jìn)無機(jī)硒由胞外進(jìn)入胞內(nèi)從而提高胞內(nèi)有機(jī)硒生成反應(yīng)底物濃度[10-11],鑒于此,本文以前期經(jīng)誘變篩選出的酵母菌株HSX-02[12]為材料,將在無機(jī)硒添加時間和添加質(zhì)量濃度優(yōu)化的基礎(chǔ)上考察NADPH或果糖的添加對酵母富硒發(fā)酵培養(yǎng)的影響,以期為高富硒酵母的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株為啤酒酵母(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心館藏號:1412)經(jīng)NaN3誘變、H2O2篩選所得的富硒菌株HXS-02[12]。

化學(xué)試劑有:亞硒酸鈉、甲酸、濃氨水、甲苯、氫氧化鈉均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙二胺四乙酸、鹽酸羥胺均購于陽光生物科技有限公司;3,3′-二氨基聯(lián)苯胺均購于華中海威(北京)基因科技有限公司。

液體培養(yǎng)基由麥芽膏粉130 g/L和氯霉素0.1 g/L組成(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司),使用時加入定量蒸餾水溶解、調(diào)節(jié)pH值至5.6±0.2,并經(jīng)121 ℃滅菌20 min[13]。

1.2 儀器與設(shè)備

HQ45Z恒溫?fù)u床(中國科學(xué)院(武漢)科學(xué)儀器廠);SKP-02電熱恒溫培養(yǎng)箱(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠);DGF30/7-I電熱鼓風(fēng)干燥箱(南京實驗儀器廠);V1100可見光分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司);TC-201恒溫水浴鍋(上海琪特分析儀器有限公司);CT15RT高速冷凍離心機(jī)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);MDF-U73V SANYO超低溫冰箱、MLS-3750 SANYO高壓蒸汽滅菌鍋(日本Osaka公司);SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);XSZ-3G普通光學(xué)顯微鏡(重慶光電儀器有限公司);AL 104分析天平(梅特勒-托利多公司);PHS-3E pH臺式酸度計(武漢天壹力儀器設(shè)備有限公司);LGJ-18S原位冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母生長和富硒能力的變化

按照文獻(xiàn)[12]方法,挑取1環(huán)菌種于裝液量為50 mL液體培養(yǎng)基的搖瓶(250 mL)中,28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h作為活化的菌種。取活化的菌種以10%的接種量轉(zhuǎn)移至新鮮的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)6 h,加入亞硒酸鈉至終質(zhì)量濃度為25 mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,期間每隔6 h離心收集菌體,測定菌株生物量和富硒能力的變化。

1.3.2 無機(jī)硒添加方式對酵母富硒能力的影響

1) 無機(jī)硒的添加時間?；罨木N在搖瓶振蕩培養(yǎng)的0、2、4、6、8、10 h分別加入亞硒酸鈉至質(zhì)量濃度為25 mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)至24 h,測定無機(jī)硒添加時間對菌株生長和富硒能力的影響。

2) 無機(jī)硒的添加質(zhì)量濃度。活化的菌種搖瓶振蕩培養(yǎng)8 h,分別加入亞硒酸鈉至質(zhì)量濃度為12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)至24 h,測定無機(jī)硒添加質(zhì)量濃度對菌株生長和富硒能力的影響。

3) 無機(jī)硒添加后酵母富硒能力的變化?；罨木N搖瓶振蕩培養(yǎng)8 h時,加入亞硒酸鈉至質(zhì)量濃度為62.5 mg/L,繼續(xù)培養(yǎng),共培養(yǎng)至72 h,期間每隔8 h離心收集菌體,測定菌株生物量和富硒能力的變化。

4) NADPH對酵母富硒能力的影響。取活化的菌種,搖瓶振蕩培養(yǎng)8 h時,加入亞硒酸鈉至質(zhì)量濃度為62.5 mg/L的同時分別加入NADPH至濃度為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng),共培養(yǎng)至24 h,測定NADPH對菌株生長和富硒能力的影響。

5) 果糖對富鉻酵母富硒能力的影響。取活化的菌種,搖瓶振蕩培養(yǎng)8 h,加入終質(zhì)量濃度為62.5 mg/L亞硒酸鈉的同時分別加入果糖至質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 g/L,繼續(xù)培養(yǎng)至24 h,測定果糖對菌株生長和富硒能力的影響。

1.3.3 菌體生物量與富硒能力的測定

1) 菌體生物量。培養(yǎng)結(jié)束后,8 000 r/min,離心10 min收集菌體,經(jīng)去離子水離心洗滌2～3次后,于60 ℃下烘干至恒重,測定菌體的質(zhì)量濃度。

2) 富硒能力。烘干的菌體中總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w總硒)及產(chǎn)率(用ρ總硒表示)、有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w有機(jī)硒)及產(chǎn)率(用ρ有機(jī)硒表示)、有機(jī)硒占比的測定按文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個單獨實驗至少重復(fù)3次,所有實驗數(shù)據(jù)均以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,并利用SPASS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理,采用ANOVA進(jìn)行不同實驗組間的鄧肯氏差異分析(P<0.05),采用Origin 8.0軟件繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種培養(yǎng)時間對酵母富硒能力的影響

菌種培養(yǎng)時間對酵母富硒能力的影響如圖1所示,圖1中,不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同。由圖1可知:菌株HXS-02在搖瓶培養(yǎng)12～24 h內(nèi)快速生長,ρ菌株在24 h時達(dá)到最高,為(3.52±0.15) g/L,且顯著高于其他時間點(P<0.05);菌體的w總硒隨著培養(yǎng)時間的增加而快速增加,在24 h后逐漸減緩,但ρ總硒隨時間的變化呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,且在24 h達(dá)到峰值,為(7 664.9±361.17) μg/L;相應(yīng)地,菌體的w有機(jī)硒、ρ有機(jī)硒在24 h前也呈現(xiàn)快速增長的趨勢,隨后趨于穩(wěn)定;期間有機(jī)硒占總硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從12 h的89%上升到24 h后的97%。由以上分析可知,24 h為菌株無機(jī)硒添加方式優(yōu)化時的最佳培養(yǎng)時間。

2.2 硒添加時間對酵母富硒能力的影響

無機(jī)硒的添加時間不僅影響酵母的生長,而且影響有機(jī)硒的積累[14]。亞硒酸鈉添加時間對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響如圖2所示。由圖2可知,隨著亞硒酸鈉添加時間的延遲,酵母培養(yǎng)24 h后菌株的質(zhì)量濃度逐漸增加,w總硒、w有機(jī)硒在添加時間為6 h達(dá)到最高,ρ總硒、ρ有機(jī)硒在添加時間為8 h時達(dá)到最高,有機(jī)硒占總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)在添加時間為6 h時超過95%,隨后穩(wěn)定。酵母富硒發(fā)酵既要使收獲的菌體有機(jī)硒質(zhì)量濃度高,也要使收獲的富硒酵母產(chǎn)率高,雖然亞硒酸鈉在培養(yǎng)6 h時添加比在培養(yǎng)8 h時添加所收獲的菌體有機(jī)硒質(zhì)量濃度高,但ρ有機(jī)硒只有8 h的87%,因此選擇搖瓶培養(yǎng)8 h為亞硒酸鈉的最適添加時間。

圖2 硒添加時間對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響

2.3 硒添加質(zhì)量濃度對酵母富硒能力的影響

培養(yǎng)基中的無機(jī)硒質(zhì)量濃度會影響酵母對硒的轉(zhuǎn)化吸收和酵母生物量的積累,當(dāng)培養(yǎng)基中無機(jī)硒的質(zhì)量濃度過高時,酵母的生物量和有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率會受到抑制[14]。因此適宜的無機(jī)硒質(zhì)量濃度是酵母富硒的重要條件。亞硒酸鈉添加質(zhì)量濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響如圖3所示。

圖3 亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響

由圖3可知,隨著ρ亞硒酸鈉的增加,富硒酵母的ρ菌株逐漸下降,w總硒、w有機(jī)硒和有機(jī)硒占比逐漸上升至亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為62.5 mg/L時達(dá)到最高,其中w總硒、w有機(jī)硒均比亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為25.0 mg/L時的值高30%以上,而ρ總硒、ρ有機(jī)硒在亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為25.0 mg/L時分別達(dá)到(8 099.7±430.9)、(7 869.7±412.7) μg/L,隨后下降,至亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為62.5 mg/L時重新達(dá)到峰值?？紤]到菌體在亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為25.0 mg/L時的w總硒,特別是w有機(jī)硒低于亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為6.25 mg/L時的值,且有利于后續(xù)有機(jī)硒產(chǎn)率的優(yōu)化提高,因此選擇62.5 mg/L為亞硒酸鈉的最適添加質(zhì)量濃度。

2.4 發(fā)酵時間對酵母富硒能力的影響

以培養(yǎng)時間8 h時加入質(zhì)量濃度為62.5 mg/L的亞硒酸鈉作為優(yōu)化的無機(jī)硒添加方式,考察酵母生長和富硒能力在培養(yǎng)過程中的變化,結(jié)果如圖4所示。

圖4 硒添加方式優(yōu)化后對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響

由圖4可知:ρ菌株在亞硒酸鈉添加后呈先上升后降低的趨勢,培養(yǎng)24 h達(dá)到生長峰值;w總硒、w有機(jī)硒隨培養(yǎng)時間的延長而增加,在培養(yǎng)的48 h均達(dá)到峰值,隨后迅速下降,有機(jī)硒占總硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在培養(yǎng)24 h后均維持在97%以上,雖然ρ總硒、ρ有機(jī)硒也呈先上升后降低的趨勢,但兩者的峰值均出現(xiàn)在培養(yǎng)的24 h,約是培養(yǎng)48 h的1.3倍。綜合以上結(jié)果,以ρ總硒、ρ有機(jī)硒計,酵母菌株HXS-02富硒培養(yǎng)時加入亞硒酸鈉的適宜時間和適宜質(zhì)量濃度分別為8 h和62.5 mg/L,適宜的富硒發(fā)酵時間為24 h。

2.5 NADPH或果糖的添加對富硒能力的影響

NADPH的濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響如圖5所示。

圖5 NADPH濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響

由圖5可知,NADPH的添加可以顯著影響菌株的生長,隨著NADPH添加濃度的提高,菌株的生長干重呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,當(dāng)cNADPH在0.15～0.20 mmol/L時,w菌株最高,比未添加NADPH菌株的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高23%以上;w總硒、w有機(jī)硒以及ρ總硒、ρ有機(jī)硒也隨NADPH添加濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減緩的趨勢,并均在cNADPH為0.20 mmol/L時達(dá)到峰值,有機(jī)硒占總硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均保持在97%以上。結(jié)果表明,在無機(jī)硒添加的同時,在培養(yǎng)基中加入適量的NADPH不僅有效促進(jìn)菌株的生長,而且可明顯提高酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化無機(jī)硒為有機(jī)硒的能力,與未添加NADPH的培養(yǎng)相比,0.20 mmol/L NADPH的添加可使菌株的w總硒、ρ總硒、w有機(jī)硒、ρ有機(jī)硒分別提高15.8%、42.6%、16.1%、42.9%。

果糖的質(zhì)量濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響如圖6所示。

圖6 果糖質(zhì)量濃度對菌株HXS-02生長和富硒能力的影響

由圖6可知,果糖的添加可顯著促進(jìn)菌株的生長,促進(jìn)作用隨果糖質(zhì)量濃度增加至6 g/L時呈現(xiàn)快速上升趨勢,繼續(xù)增加ρ果糖則促進(jìn)作用開始下降,與未添加果糖的培養(yǎng)相比,添加6 g/L的果糖可使ρ菌株提高32.6%;果糖添加后菌株的總硒及有機(jī)硒的質(zhì)量濃度和產(chǎn)率表現(xiàn)出與菌株生長相似的變化趨勢,當(dāng)培養(yǎng)基中果糖添加至質(zhì)量濃度為6 g/L時,它們的值均達(dá)到最高;與未添加果糖的培養(yǎng)相比,果糖的添加不改變菌株中有機(jī)硒占總硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù),添加6 g/L的果糖雖然僅使w總硒從(2 851.9±69.3) μg/g提高到(2 969.2±15.0) μg/g、w有機(jī)硒從(2 789.5±67.7) μg/g提高到(2 903.0±15.7) μg/g,但可使ρ菌株、ρ總硒、ρ有機(jī)硒分別提高32.6%、38.1%、38.0%。結(jié)果表明,果糖的添加可通過促進(jìn)酵母細(xì)胞生物量的增加,從而提高富硒酵母的產(chǎn)率。

3 結(jié) 論

本文以前期篩選出的釀酒酵母菌株HXS-02為起始菌株,以有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化能力為指標(biāo),經(jīng)酵母富硒培養(yǎng)過程中無機(jī)硒添加時間和添加質(zhì)量濃度的優(yōu)化,確定了無機(jī)硒的最佳添加方式為菌株搖瓶培養(yǎng)8 h時添加ρ亞硒酸鈉為62.5 mg/L。在此添加方式下菌株經(jīng)24 h培養(yǎng)后總硒和有機(jī)硒的產(chǎn)率最高,分別比優(yōu)化前提高了14.3%、15.8%。

NADPH作為細(xì)胞代謝的一種還原力,果糖作為細(xì)胞代謝的一種能量物質(zhì),在亞硒酸鈉添加的同時,適當(dāng)添加NADPH或果糖可進(jìn)一步提高菌株的富集有機(jī)硒能力,其中NADPH可通過促進(jìn)菌株生長和轉(zhuǎn)化無機(jī)硒為有機(jī)硒能力實現(xiàn)有機(jī)硒的高水平富集,而果糖則是通過促進(jìn)菌株的生長實現(xiàn)有機(jī)硒的高水平富集。結(jié)果表明,酵母在富硒培養(yǎng)過程中采取適合的無機(jī)硒添加方式并輔以添加適量的NADPH或果糖,將可有效地提高酵母富硒培養(yǎng)的產(chǎn)率。NADPH和果糖是否對酵母富硒培養(yǎng)具有協(xié)同作用尚有待研究。