滕 楊,劉玉雙,周海瑞,張 杰,焦淑清,倪 蕾

(佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007)

肝癌(hepatocellular carcinoma)作為全球最普遍的實(shí)體器官惡性腫瘤之一,分為原發(fā)性性肝癌和繼發(fā)性肝癌[1]。具有初期確診艱難、進(jìn)展快、手術(shù)后危險(xiǎn)因素大[2]和預(yù)后差的特點(diǎn),所以對(duì)肝癌進(jìn)行一級(jí)預(yù)防以及尋找新的治病藥物是當(dāng)下的研究熱門。中藥作為綜合性醫(yī)治的核心構(gòu)成部分具備與眾不同的醫(yī)治優(yōu)點(diǎn)[3],不但能抑制肝癌細(xì)胞分化,加快肝癌細(xì)胞的凋亡[4],同時(shí)也能夠抑制肝癌細(xì)胞的侵?jǐn)_和遷移,提升肝癌病人的免疫能力、改善肝癌細(xì)胞的多藥耐藥,實(shí)現(xiàn)了從多層次、多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗肝癌的作用[5]。

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(ginkgo biloba L.)的干燥葉[6],所含的關(guān)鍵化學(xué)成分有黃酮類(flavonoids)、萜類(terpenes)、銀杏醇(ginnol)、莽草酸(shikimic acid)等。據(jù)《食療本草》記述,銀杏葉味淡,微辛,甘、苦、澀、平,入心肺功能經(jīng)[7,8]?？捎糜跀糠沃勾?、活血化瘀、活脈止痛、化濁降血脂[9],還有保護(hù)肝臟,促使肝臟機(jī)能充分發(fā)揮的特殊功效[10]。本研究主要是采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)出銀杏葉治療肝癌的有效活性成分、核心作用靶點(diǎn),進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析,再通過分子對(duì)接的方法模擬化合物與疾病靶點(diǎn)間的結(jié)合活性,為銀杏葉抗肝癌作用機(jī)制提供了一定的理論依據(jù),并為中藥治療肝癌提供參考思路。

1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php);UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/);Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/);Drug Bank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/);OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org/);Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/);Metascape分析平臺(tái)(https://metascape.org/);Cytoscape分析平臺(tái)(https://www.cytoscape.org/);STRING分析平臺(tái)(https://string-db.org/);微生信平臺(tái)(https://string-db.org/)。

1.2 軟件

Auto Dock Tools軟件(https://autodock.scripps.edu/);PyMOL軟件(https://pymol.org/2/)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 銀杏葉作用靶點(diǎn)以及肝癌疾病靶點(diǎn)的篩選

篩選標(biāo)準(zhǔn):DL≥0.18、OB≥0.30[11],使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù),以銀杏葉為搜索詞,篩選出其活性成分,在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中查找對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。同時(shí),在Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)中限定物種為人類,選擇已驗(yàn)證過的靶點(diǎn)基因,除去沒有靶點(diǎn)和重復(fù)的活性成分。通過DrugBank、OMIM、Genecards三個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)得到HCC相關(guān)靶點(diǎn),導(dǎo)入U(xiǎn)niport,再次選擇人類物種和以驗(yàn)證過的蛋白,刪去重復(fù)值得到疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.2 藥物-疾病-靶點(diǎn)的確定

將銀杏葉和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0分析平臺(tái),得到78個(gè)共同靶點(diǎn)并繪制Venn圖。

2.3 核心網(wǎng)絡(luò)的確定以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)點(diǎn)(PPI)的構(gòu)建

使用String數(shù)據(jù)庫(kù)建立PPI網(wǎng)絡(luò),除去游離靶點(diǎn),通過Cytoscape3.9.1進(jìn)行可視化,使用軟件中“Network Analyzer”來分析成分疾病網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的屬性值,計(jì)算節(jié)點(diǎn)的介度值(Betweenness)來構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4 成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過整理銀杏葉與肝癌相同靶點(diǎn),得到Network和Type文件,導(dǎo)入Cytoscape3.9.1數(shù)據(jù)庫(kù),節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)、活性成分和疾病,通過改變節(jié)點(diǎn)大小,繪制成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2.5 GO生物過程和KEGG通路富集分析

在String平臺(tái)查找到的蛋白靶點(diǎn),以度值>30為條件得到10個(gè)核心靶點(diǎn),將其輸入Metascape中,分別對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析,將結(jié)果導(dǎo)入微生信制作富集氣泡圖。

2.6 核心活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)分子對(duì)接

在Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)下載成分的二維結(jié)構(gòu)并存為SDF文件,使用Chem Bio 3D軟件將核心活性成份轉(zhuǎn)化成PDB格式,導(dǎo)入Auto Dock軟件將PDB轉(zhuǎn)化成PDBQT;在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)并保留為PDB文件;用PyMOL軟件去掉水分子和配體。將處理好的的關(guān)鍵靶蛋白儲(chǔ)存為PDB格式導(dǎo)入Auto Dock軟件,對(duì)分子進(jìn)行常規(guī)化處理并進(jìn)行分子對(duì)接,最終用PyMOL進(jìn)行對(duì)接結(jié)果可視化。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 銀杏葉活性化學(xué)成分與作用靶點(diǎn)匯總以及肝癌疾病靶點(diǎn)篩選

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)并根據(jù)OB值和DL值篩選得到可以進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)的活性成分10種(YXY1-YXY10),主要含有木犀草素-4'-葡萄糖苷、丁香素和芝麻素等,銀杏葉有效成分匯總見表1。在DrugBank、OMIM、Genecards三個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選疾病靶點(diǎn),將得到數(shù)據(jù)輸入U(xiǎn)niport數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,刪去重復(fù)靶點(diǎn)名稱,得到與疾病相關(guān)靶點(diǎn)共1637個(gè)。

表1 銀杏葉活性有效成分匯總

3.2 藥物-疾病交集靶點(diǎn)Venn圖

將藥物和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1.0平臺(tái)中,得到交集靶點(diǎn)78個(gè),制作藥物-疾病靶點(diǎn)交集圖,見圖1。

圖1 銀杏葉活性有效成分基因與肝癌基因Venn圖

3.3 核心網(wǎng)絡(luò)的確定以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)點(diǎn)(PPI)的構(gòu)建

將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String平臺(tái)中,設(shè)置置信度≥0.4,刪去兩個(gè)無蛋白作用靶點(diǎn),構(gòu)建“YXY-HCC”的PPI網(wǎng)絡(luò),將Stv文檔導(dǎo)入Cytoscape3.9.1中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖,按照Betweenness值大小逐一排列,其中藍(lán)色表示相對(duì)重要靶點(diǎn)名稱,見圖2。

圖2 銀杏葉活性化合物-肝癌疾病共有靶點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)

3.4 有效成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將成分與疾病相同靶點(diǎn)整理為Network和Type文件,將其導(dǎo)入Cytoscape3.9.1分析平臺(tái)進(jìn)行繪圖。其中倒三角形表示銀杏葉藥物,圓形表示銀杏葉活性成分,正八邊形為肝癌疾病,菱形與長(zhǎng)方形為作用靶點(diǎn),其中顏色深的為核心作用靶點(diǎn),見圖3。

圖3 銀杏葉活性成分-肝癌疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.5 核心靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG富集分析

在本研究中,10個(gè)核心靶點(diǎn)共得到了30個(gè)GO注釋和10個(gè)KEGG通路,GO分析包括三個(gè)子項(xiàng),分別為生物過程(biological process)、細(xì)胞組成(cell component)以及分子功能(molecular function),見圖4。此外,使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析,得到79條通路,排名前10通路,見圖5。

圖4 GO富集分析條形圖

圖5 KEGG富集氣泡圖

3.6 分子對(duì)接結(jié)果分析

選取Degree值排名前三的靶點(diǎn)蛋白作為配體,靶目標(biāo)蛋白相匹配的活性成份做為化合物開展分子對(duì)接,其結(jié)合能(Binding energy)結(jié)果見表2,分子對(duì)接模擬見圖6。

圖6 分子對(duì)接模式圖

表2 銀杏葉活性成分與肝癌作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

4 討論

肝癌的發(fā)病機(jī)制可能與體重、年紀(jì)、自然環(huán)境、生活方式、基因遺傳等原因相關(guān)。中醫(yī)學(xué)的整體觀念將身體視作一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng),疾病是身體作用網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)情況。中醫(yī)學(xué)治療著眼于復(fù)雜系統(tǒng)作用的總體調(diào)整,調(diào)節(jié)這一不平衡的網(wǎng)絡(luò),使其修復(fù)到平衡狀態(tài)。因而,在中醫(yī)臨床實(shí)踐活動(dòng)中,尋找治療肝癌的合理中藥,并分析其作用機(jī)制,才有較長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展?jié)摿12]。

本實(shí)驗(yàn)通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對(duì)接初步探討了銀杏葉抗肝癌的作用機(jī)制,篩選出銀杏葉抗肝癌的主要成分為木犀草素-4'-葡萄糖苷、毛莨黃素和芝麻素等10個(gè)關(guān)鍵化合物及10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)、10個(gè)相關(guān)信號(hào)通路,推斷出銀杏葉可能有抗肝癌的效果。根據(jù)GO和KEGG通路富集分析結(jié)果確定銀杏葉抗肝癌的重要作用通路,去除廣泛通路后,重點(diǎn)對(duì)“Estrogen signaling pathway”這一通路進(jìn)行討論。

雌激素受體(estrogen receptor,ER)包括ERα和ERβ,在1977年首次發(fā)現(xiàn)于子宮內(nèi)膜細(xì)胞,隨后,人們陸續(xù)在肝臟、乳腺、前列腺等器官中發(fā)現(xiàn)了ER的表達(dá)。ER是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,歸屬于核受體(nucleus receptor,NR)超家族成員,近些年,雌激素的基因組作用已獲得充足確認(rèn),對(duì)雌激素受體的非基因組作用的探究變成關(guān)注的聚焦點(diǎn),尤其要注意激活磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋清絲氨酸、蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)數(shù)據(jù)信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)數(shù)據(jù)信號(hào)通路[13]。

PI3K/AKT數(shù)據(jù)信號(hào)通路、雌激素與肝癌的發(fā)生發(fā)展趨勢(shì)PI3K/AKT數(shù)據(jù)信號(hào)通路被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞存活的關(guān)鍵通路,被稱作“抗細(xì)胞凋亡通路”。由此可見,雌激素能一定程度抑制AKT磷酸化抑制肝癌細(xì)胞增殖,ER通路抑制STAT3活性來改變腫瘤的發(fā)展趨向,在非雌激素依賴的腫瘤中,炎癥因子的含量降低,危害腫瘤的自身免疫,進(jìn)而形成腫瘤免疫的核心部分,ER通路抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)揮抗腫瘤功效,通過ER抑制NF-κB活化,既可以抑制下游增殖周期相關(guān)分子和基質(zhì)金屬蛋白等腫瘤侵襲相關(guān)分子的表達(dá)[14],又可以下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2,肝癌的發(fā)病率可以通過雌激素和其信號(hào)通路降低,進(jìn)一步驗(yàn)證雌激素具有抑制肝癌的分子機(jī)制。因而,在雌激素存有的情形下,PI3K/AKT信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與STAT3信號(hào)通路與肝癌的產(chǎn)生、發(fā)展趨勢(shì)和遷移息息相關(guān),為進(jìn)一步討論雌激素激活PI3K/AKT信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與STAT3信號(hào)通路在抗肝癌的作用機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

綜上所述,本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接手段,從分子層面探討銀杏葉抗肝癌的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)銀杏葉主要通過影響Estrogen signaling pathway信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞,具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療肝癌疾病的特點(diǎn),為后續(xù)銀杏葉的開發(fā)研究提供理論基礎(chǔ)。