馬深成，王 杰，李 旭，呂新民，吳俊東，高尚坤，田葉韓*

（1.泰安市泰山森林病蟲害防治檢疫站 山東 泰安 271000；2.平度市大澤山林場(chǎng) 山東 平度 266700；3.泰安市徂徠山林場(chǎng) 山東 泰安 271000；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/山東省林業(yè)有害生物防控工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018）

球毛殼菌（Chaetomium globosum）隸屬于子囊菌門（Ascomycota），核菌綱（Pyrenomycetes），糞殼菌目（Sordariales），毛殼菌科（Chaetomiaceae），毛殼菌屬（Chaetomium），是公認(rèn)的生產(chǎn)碳水化合物活性酶和抗生素的真菌，也是公認(rèn)的植物生防菌[1-3]。球毛殼菌（C.globosum）ND35 是分離自健康毛白楊的一株具有促生、抗逆和防病功能的植物內(nèi)生真菌。大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，球毛殼菌ND35 能夠在宿主植物體內(nèi)長(zhǎng)期定殖，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物抗逆性，同時(shí)對(duì)多種植物病原菌產(chǎn)生拮抗作用[4-10]。

枸杞（Lycium），茄科枸杞屬多年生木本植物，起源于中國(guó)，多分布于溫帶和亞熱帶地區(qū)，在中國(guó)北方多數(shù)省區(qū)都有栽培。枸杞喜光，喜冷涼氣候，耐寒、耐寒、耐鹽堿能力較強(qiáng)，在干旱荒漠地、鹽堿地動(dòng)能生長(zhǎng)。扦插育苗是枸杞是規(guī)?；绲闹饕獰o(wú)性繁殖方式的，具有保持品種遺傳特性、繁殖系數(shù)高、成苗快速、成本低等特點(diǎn)。目前，枸杞扦插育苗的研究主要集中在提高插穗成活率的技術(shù)措施，如促生根劑的選擇及使用方法、采條時(shí)間、促進(jìn)生根等措施[11-13]。為了解決枸杞扦插育苗成活率低，扦插育苗病蟲害等問(wèn)題。本試驗(yàn)通過(guò)采用植物內(nèi)生菌處理寧夏枸杞扦插苗，觀測(cè)球毛殼菌ND35 處理對(duì)寧夏枸杞扦插苗根形態(tài)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，篩選枸杞苗木繁育篩選新型微生物生根劑，為枸杞扦插育苗繁育質(zhì)量和產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 供試材料

供試的球毛殼菌ND35 菌株由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)高克祥教授饋贈(zèng)，枸杞扦插枝（寧枸7 號(hào)）由寧夏農(nóng)林科學(xué)院李越鯤研究員饋贈(zèng)，并于2022 年—2023 年分別在平度市大澤山林場(chǎng)、泰安市徂徠山林場(chǎng)的溫室內(nèi)進(jìn)行引種定植。2023 年5 月從各林場(chǎng)挑選苗高、地徑較均勻一致的健康枸杞扦插苗共60 株，隨機(jī)選擇20 株為一組，共3 組處理。球毛殼菌ND35 對(duì)枸杞扦插苗根系發(fā)育影響的試驗(yàn)均在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室開展。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

枸杞扦插枝清水浸泡30 分鐘后進(jìn)行試驗(yàn)處理，本試驗(yàn)設(shè)置2 個(gè)處理，即對(duì)照組（CK），枸杞扦插時(shí)不加ND35 菌劑；處理組（ND），枸杞扦插時(shí)接種球毛殼菌ND35（使用蘸根法接種球毛殼菌ND35 菌劑（孢子濃度2×107 個(gè)/g），要求球毛殼菌ND35 菌劑均勻覆蓋扦插枝表皮，ND35 菌劑用量約為1.0 g），并于扦插后60 天取樣調(diào)查，調(diào)查側(cè)根數(shù)量、根系活力和葉綠素含量等指標(biāo)。

2.2.2 根系活力測(cè)定

根系活力測(cè)定的樣品應(yīng)該保證扦插苗根系的完整，取0.2 g 根系生命活動(dòng)力最為旺盛的部位是根尖（根分生區(qū)）作為測(cè)定根系活力的材料。采用北京索萊寶科技有限公司所生產(chǎn)的植物根系活力檢測(cè)試劑盒（TTC法，BC5270）測(cè)定不同處理下枸杞根系活力。

2.2.3 根系木質(zhì)素含量及其合成相關(guān)酶活性測(cè)定

根系木質(zhì)素測(cè)定的樣品應(yīng)該保證扦插苗根系的完整，取0.2 g 根系成熟區(qū)（靠近扦插條的部位）作為測(cè)定根系木質(zhì)素含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和過(guò)氧化物酶（POD）活性的材料。采用北京索萊寶科技有限公司所生產(chǎn)的木質(zhì)素含量檢測(cè)試劑盒（BC4200）、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性檢測(cè)試劑盒（BC0210）、過(guò)氧化物酶(POD)活性檢測(cè)試劑盒（BC0090）測(cè)定不同處理下枸杞根系活力及其合成相關(guān)酶活性。

2.2.4 葉綠素含量測(cè)定

將材料葉片表面的灰塵清洗干凈，用打孔器取直徑約1 cm 的葉片組織，取樣時(shí)注意避開主脈和較粗大的副脈。每一重復(fù)稱取0.2 g 樣品組織并剪成細(xì)絲，可使葉綠素提取更加充分。處理完成后放入試管內(nèi)，加入10 mL 丙酮乙醇等比例混合液，充分搖晃使提取液完全浸沒(méi)葉片細(xì)絲，置于30℃黑暗條件下提取至細(xì)絲完全變白，提取過(guò)程中輕輕搖晃試管幾次可以有效縮短提取時(shí)間。分別在波長(zhǎng)為663 nm 和645 nm 下測(cè)定提取液吸光度值，記錄吸光度D 的值。將吸光度D 帶入對(duì)應(yīng)公式中計(jì)算葉綠素a 含量、葉綠素b 含量和葉綠素總量并求均值。

葉綠素含量的計(jì)算公式如下：

2.3 數(shù)據(jù)處理

用IBM SPSS Statistics 21 軟件對(duì)不同處理扦插苗的根系活力、葉綠素總含量和側(cè)根數(shù)量進(jìn)行檢驗(yàn)分析。用WPS 2023、OriginPro 2017 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 球毛殼菌ND35 對(duì)枸杞根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，球毛殼菌ND35 處理對(duì)寧枸7 號(hào)扦插苗的成活率沒(méi)有影響，但對(duì)枸杞扦插苗的根系生長(zhǎng)發(fā)育存在影響（表1）。相比于對(duì)照組（CK），球毛殼菌ND35 處理組（ND）的枸杞扦插苗側(cè)根數(shù)量、根系活力、根系木質(zhì)素含量和葉綠色含量顯著增加（P＜0.05），分別提高了 44.83%、14.28%、9.49%和49.05%。

表1 球毛殼菌ND35 對(duì)枸杞根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響Table 1 The effect of C.globosum strain ND35 on the root growth and development of Lycium barbarum

3.2 球毛殼菌ND35 對(duì)枸杞根系酶活性的影響

從寧枸7 號(hào)扦插苗生長(zhǎng)時(shí)期的苯丙氨酸解氨酶（PAL） 活性和過(guò)氧化物酶（POD） 活性活性變化趨勢(shì)可以看出，球毛殼菌ND35處理的枸杞扦插苗的PAL活性和POD 活性總體上高于對(duì)照組（CK）。球毛殼菌ND35 處理的枸杞扦插苗的生長(zhǎng)前期 （7 天和14 天）PAL 活性和POD 活性與對(duì)照組（CK）無(wú)顯著差異。球毛殼菌ND35 處理的枸杞扦插苗的生長(zhǎng)后期 （21～49 天）PAL 活性顯著高于對(duì)照組（CK），分別提高了25.86%、20.27%、18.35%、19.22%、23.62%（圖2A）。球毛殼菌ND35 處理的枸杞扦插苗的生長(zhǎng)后期 （21～49 天）POD活性總體上高于對(duì)照組（CK），分別提高了20.55%、27.12%、-11.94%、20.01%、17.51%，其中，第21 天、第28 天和第42 天時(shí)ND 處理組POD 活性顯著高于對(duì)照組，第35 天時(shí)ND 處理組POD 活性低于對(duì)照組（圖2B）。

圖1 球毛殼菌ND35 對(duì)枸杞根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響Figure 1 The effect of C.globosum strain ND35 on the root growth and development of L.barbarum

圖2 球毛殼菌ND35 對(duì)枸杞根系PAL 活性（A）和POD 活性（B）的影響Figure 2 The effect of C.globosum strain ND35 on PAL activity (A) and POD activity(B) of L.barbarum roots

4 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生菌是廣泛分布于自然界植物體內(nèi)的微生物資源，由于內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活在植物體的特殊和環(huán)境里，并和宿主協(xié)同進(jìn)化，在演變過(guò)程中二者形成了互利共生關(guān)系，一方面植物為內(nèi)生菌提供光合產(chǎn)物和礦物質(zhì)供內(nèi)生菌生長(zhǎng)需要，另一方面內(nèi)生菌在宿主的生長(zhǎng)發(fā)育和系統(tǒng)演化過(guò)程中起重要作用[14]。目前研究表明，植物內(nèi)生菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，誘導(dǎo)植物抗病性，增強(qiáng)抵抗非生物脅迫的抗性如干旱、寒冷、重金屬，抑制病原微生物生長(zhǎng)等功能[15]。植物內(nèi)生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的方式，主要體現(xiàn)在以下幾方面：1）增進(jìn)宿主植物對(duì)N、P、K 等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[16]，如植物內(nèi)生菌Neotyphodium coenophialum 可顯著促進(jìn)高羊茅的氮積累和氮代謝[17]；2）通過(guò)調(diào)節(jié)植物的激素分泌調(diào)節(jié)植物內(nèi)部激素水平來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[18]，如植物內(nèi)生菌印度梨形孢(Piriformospora indica)可通過(guò)誘導(dǎo)宿主植物細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素的產(chǎn)生，促進(jìn)了寄主植物的生長(zhǎng)[19]；3）植物內(nèi)生菌能生成與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，如高溫脅迫環(huán)境下內(nèi)生菌(Paecilomyces formosus)能夠產(chǎn)生植物激素和有機(jī)酸促進(jìn)粳稻生長(zhǎng)[20]。

球毛殼菌（Chaetomium globosum）ND35 是分離自健康毛白楊的一株具有促生、抗逆和防病功能的植物內(nèi)生真菌。前期試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，球毛殼菌ND35 能夠促進(jìn)楊樹、核桃、板栗、平邑甜茶、楸樹、小麥、草莓、黃瓜、番茄、菜豆、煙草、生姜等十余種植物的生長(zhǎng)發(fā)育[5-7,21-26]。球毛殼菌ND35 能夠通過(guò)誘導(dǎo)植物內(nèi)源赤霉素(GA)、生長(zhǎng)素(IAA)、水楊酸(SA)、茉莉素(JA)等激素產(chǎn)生促進(jìn)黃瓜胚根的生長(zhǎng)發(fā)育[5]，同時(shí)，球毛殼菌ND35 能夠通過(guò)誘導(dǎo)PAL、POD 和多酚氧化酶（PPO）活性的提高，增加植物對(duì)病原微生物的抗性[9]。本研究證明球毛殼菌ND35 能夠顯著促進(jìn)枸杞扦插苗生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)枸杞側(cè)根生長(zhǎng)和木質(zhì)化具有積極影響。本研究論文進(jìn)一步驗(yàn)證了球毛殼菌ND35 的廣譜促生效果，同時(shí)也為球毛殼菌ND35 在枸杞繁育、栽培生產(chǎn)中的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。