李 鑫，廖詩賢，王宇婷，姜廷波

（東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

楊樹（populus）屬楊柳科（Salicaceae）楊屬（Populus）植物，分布廣泛、適應(yīng)性強、在我國約有60 多種[1]。楊樹所具有的速生特性使其成為林木產(chǎn)品生產(chǎn)的重要原料之一，主要用于生物質(zhì)能源制造、民用建筑、板料及紙漿制造等[2]。其中小黑楊（Populus simonii×P.nigra）是通過小葉楊（Populus simonii Carr）和黑楊（Populus nigra）雜交而來的優(yōu)良品種[3]。為培育品質(zhì)更為優(yōu)良的樹種，利用基因工程將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化到植物體內(nèi)來改變植株部分特性是改良樹種的有效途徑之一。AP2/ERF 家族是一個龐大的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子群，在許多生物過程中發(fā)揮重要作用[4]。研究所涉及的ERF 類轉(zhuǎn)錄因子參與植物一系列的重要生命活動，包括激素信號誘導調(diào)控、代謝調(diào)控、細胞分化、植物生長發(fā)育等[5]。根據(jù)報道，ERF76 轉(zhuǎn)基因楊樹中植物激素ABA 和GA 生物合成和信號傳導通路相關(guān)基因的相對表達水平顯著高于野生型[2]。其中GA 參與調(diào)控纖維素的合成，并通過DELLA 參與調(diào)控[6]。這為ERF76 基因影響楊木生長發(fā)育進而影響木材化學組分提供了一定的理論基礎(chǔ)。而化學組分原料主要為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，是有關(guān)木材產(chǎn)品生產(chǎn)最主要的原料[7-10]。對于這些組分的分離與應(yīng)用工藝有許多，例如堿/尿素處理工藝[11]、稀酸處理[12]、水性助溶劑處理[13]、自水解[14,15]、堿處理[16]等處理方式。考慮到能源、機械等實際生產(chǎn)條件以及實驗室條件，文章采用氫氧化鈉對目標楊木進行堿法處理以及半纖維抽提[17]工藝條件進行試驗。

文章研究的主要目的有二，首先是探究過表達ERF76 小黑楊在基因的影響下木材中的化學組分發(fā)生了哪些變化。其次是通過堿處理工藝處理探索由該轉(zhuǎn)基因造成的化學組分變化在工業(yè)化應(yīng)用處理過程中會造成哪些影響，意在對日后該轉(zhuǎn)基因木材的合理應(yīng)用提供一定的理論與數(shù)據(jù)支持。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料實驗選用位于東經(jīng)125°42’—130°10′，北緯44°04′—46°40′野生型小黑楊（WT）與ERF76 過表達轉(zhuǎn)基因小黑楊（2 年生與6 年生）。取樣時間為2022 年6 月

1.1.2 試劑氫氧化鈉、72%濃硫酸、4%硫酸、苯、95%乙醇、70%乙醇、亞氯酸鈉、去離子水、冰醋酸、丙酮、飽和氫氧化鋇溶液、鄰苯二甲酸氫鉀

1.2 楊木化學組分測定方法

水分、有機物抽提、綜纖維素、灰分分別根據(jù)國家標準GB/T462-2008、GB/T2677.6-1994、GB/T2677.10-1995、GB/T2677.3-1993 測定。酸溶木質(zhì)素和酸不溶木質(zhì)素含量按照美國國家可再生能源實驗室NREL/TP-510-4261 “Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass”檢測，楊木纖維素與半纖維素的測定采用高效液相色譜測定水解液（水解液來自酸不溶木質(zhì)素制備過程）中葡萄糖與木糖的含量，以葡萄糖和木糖的標樣作為標準測定含量。分別對WT 與轉(zhuǎn)基因楊木進行水分、綜纖、苯醇-抽提、klason 木質(zhì)素、酸溶木質(zhì)素、半纖維素、纖維素、灰分等組分進行測定。篩選優(yōu)良轉(zhuǎn)基因株系進行進一步實驗。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將楊木試樣送至生工生物工程 （上海） 股份有限公司進行cDNA 文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序，從中找尋ERF76 基因（Potri.005G195000.1）并使用TBtools 軟件分析。對比轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)野生型與ERF76 轉(zhuǎn)基因楊木的差異基因。

1.4 半纖維素抽提

將實驗所用6 年生小黑楊楊木自然風干一段時間后去除樹皮，通過球磨機制備尺寸為40-60 目的楊木木粉，將合格木粉通過苯-醇抽提脫脂，并根據(jù)國標GB/T462-2008 測量木粉水分后備用。稱取1g（絕干、精確0.0001）脫脂木粉放置于錐形瓶中，用20 mL 濃度為100 g/L 的氫氧化鈉溶液與之充分混合，并處于室溫下反應(yīng)（0.5-3 h）反應(yīng)結(jié)束后通過恒重的G2 玻沙漏斗分離固液相。

固相用去離子水洗滌至濾液為中性后放入（105±2℃）烘箱內(nèi)烘至絕干，稱重計算固相得率。液相使用冰醋酸調(diào)節(jié)液體pH 值為5.5 并加入3 倍體積（60 mL，濃度95%）的乙醇溶液。等待完全沉淀后再次固液分離，用70%的乙醇溶液洗滌并風干稱量半纖維素質(zhì)量并計算半纖維素提取率。

1.5 堿法組分分離

將實驗楊木（6 年生）靜置一段時間自然風干水分后去除樹皮分別裁剪制備長2 mm 寬1 mm 高30 mm的木桿。將5g 楊木桿分別用用堿量為20、30（NaOH 計）的氫氧化鈉，以液比為1∶6 的配比放在玻璃瓶中混合并充分攪拌。封蓋后將盛有溶液的玻璃瓶轉(zhuǎn)移到高壓滅菌鍋中，預(yù)設(shè)滅菌鍋反應(yīng)時間90 min 溫度120℃。靜待反應(yīng)結(jié)束后采用布氏漏斗過濾，分離固液相。固相產(chǎn)物用去離子水清洗直至產(chǎn)物濾液變?yōu)橹行詾橹埂Ｊ占腆w產(chǎn)物并放入（105±2℃）烘箱中烘干并記錄得率數(shù)據(jù)，烘干原料經(jīng)球磨機粉碎，并篩選40～60 目木粉用于檢測殘余木質(zhì)素含量（參照1.2）每種處理包含3 次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 組分分析

由（表1）可知，轉(zhuǎn)基因株系在纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等化學組分含量上發(fā)生了變化。由此可以判斷過表達ERF76 基因?qū)π『跅钅静慕M分造成了一定影響，且由于轉(zhuǎn)基因株系的不同表現(xiàn)出了不同的結(jié)果。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得知ERF76 基因在不同小黑楊株系中的表達倍數(shù)，將其與木材各個化學組分定量結(jié)果相互比對發(fā)現(xiàn)，當FC 倍數(shù)相對較低時ERF76 過表達小黑楊的纖維素占比有所提高。當FC 倍數(shù)進一步提高后纖維素占比含量逐步下降直至出現(xiàn)負增長；半纖維素的含量占比與FC 變化的規(guī)律與纖維素相反，木質(zhì)素含量占比的變化規(guī)律與半纖維素相同，雖然這一規(guī)律在木質(zhì)素組分變化上有所體現(xiàn)但總體上對木質(zhì)素占比含量影響并不是很大，變化的規(guī)律主要體現(xiàn)在纖維素與半纖維素的變化之上。

表1 兩年生楊木各化學組分含量表Table1 Biennial poplar content table of each chemical component

經(jīng)過比較P1、P2、P3 株系與WT 在纖維素的占比差的絕對值分別為1.25、0.37、0.06；半纖維素的占比差的絕對值分別為1.06、0.22、0.21；根據(jù)比較結(jié)果P1 的化學組分變化較其它株系更加明顯，因此選定P1 株系進行進一步的研究。

由（表2）可知經(jīng)歷過4 年生長發(fā)育，由ERF76 基因的過表達木材對化學組分的影響在P1 株系體內(nèi)不斷累積并增大。與WT 纖維素含量的差值由四年前的1.25 變?yōu)?.05； 半纖維素的差值由1.06 變?yōu)?.16；四年生長發(fā)育過程中小黑楊木質(zhì)化水平不斷提高，但WT 與P1 的木質(zhì)素水平差距不大。

表2 6 年生楊木各化學組分含量表Table2 Six-year-old poplar content table of various chemical components

由轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過TBtools 軟件分析并結(jié)合（表3）可知ERF76 過表達轉(zhuǎn)基因楊樹與野生型楊樹在549個基因表達上有所差異。其中上調(diào)基因195 個，下調(diào)基因354 個，其中影響轉(zhuǎn)基因楊樹碳水化合物合成的差異基因共27 個上調(diào)基因7 個（ID：Potri.002G006200.2；Potri.003G122000.1；Potri.004G071600.1；Potri.005G195000.1；Potri.007G015500.2；Potri.008G132500.1；Potri.010G201500.2），下調(diào)基因 20 個（ID：Potri.001G192200.2；Potri.002G060500.1；Potri.002G089800.1；Potri.002G089800.4；Potri.002G145300.1；Potri.005G201200.2；Potri.006G140300.3；Potri.008G055900.2；Potri.008G120000.2；Potri.008G123500.1；Potri.008G192600.1；Potri.008G219200.1；Potri.009G060800.4；Potri.010G010500.1；Potri.010G063100.1；Potri.014G094800.1；Potri.014G116800.1；Potri.016G025500.2；Potri.016G054600.2；Potri.016G075700.4；Potri.017G073200.3）由此為轉(zhuǎn)基因楊木纖維素、半纖維素組分含量發(fā)生變化提供了分子層面的的依據(jù)。

表3 ERF76 楊木轉(zhuǎn)錄組差異基因統(tǒng)計表Table3 Transcriptome differential gene statistics table

2.2 半纖維抽提&堿法處理

針對P1 株系木材化學組分的特點，文章對該木材的工業(yè)化應(yīng)用做了一些探究，對P1 轉(zhuǎn)基因小黑楊進行了堿法工藝和半纖維素提取工藝[18]的進一步研究，研究相同工藝下WT 與ERF76 轉(zhuǎn)基因楊樹（P1 株系）的不同。實驗結(jié)果如下：

根據(jù)報道，室溫（25℃）下100 g/L 的氫氧化鈉只能溶解聚合度較低的半纖維素[19]。結(jié)合（表4）和（圖1）所示結(jié)果可以得出以下結(jié)論：從氫氧化鈉抽提結(jié)果上看，在相同的處理條件下P1 脫除半纖維素的效率明顯高于WT。由于該工藝條件針對于聚合度低的半纖維素進行抽提，且P1 的半纖維素脫除率較高，因此P1 所含低聚合度的半纖維素在總半纖維素中占比相對較高。由此側(cè)面證明了P1 植株的半纖維素合成途經(jīng)受到了ERF76 基因過表達的影響。同時通過實驗平衡時間與半纖維素脫除效率，找尋到了ERF76 過表達小黑楊木材在室溫 （25℃）氫氧化鈉提取液濃度為100 g/L 提取半纖維素的最適時間為90 min。

圖1 半纖維素脫除率Figure1 Hemicellulose removal rate

表4 半纖維素抽提結(jié)果表Table4 Hemicellulose extraction results table

正如（表5）所示結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的堿處理工藝下P1 與WT 木材在脫除木質(zhì)素方面的差別不大，但P1 可以保持較高的制漿得率。提高反應(yīng)工藝的用堿量后轉(zhuǎn)基因木材仍舊維持著上述結(jié)果。造成這一結(jié)果的原因主要應(yīng)有兩點，第一轉(zhuǎn)基因株系的和WT 纖維素組分含量、半纖維素組分含量存在差異（詳見表2）。由于反應(yīng)溫度并未超過150℃，因此反應(yīng)釜內(nèi)的主要化學反應(yīng)應(yīng)為剝皮反應(yīng)[20]。根據(jù)上述半纖維素抽提所得結(jié)論，P1 含有大量聚合度較低的半纖維素。因剝皮反應(yīng)的特性是從纖維素、半纖維素鏈條的末端依次反應(yīng)降解，且半纖維素含有大量支鏈更易降解。因此WT 與P1 在反應(yīng)之初半纖維素快速溶出并降解，而纖維素反應(yīng)較慢，此時木材纖維素組分上的不同成為了得率差異的主要原因。第二從反應(yīng)接觸面積來看，半纖維素的降解會為反應(yīng)液的侵入提供更多的接觸孔隙。由于P1 與WT 在半纖維素組分含量上的差異（詳見表2）P1 較少的半纖維素含量，致使反應(yīng)過程中WT 更易與反應(yīng)液接觸促進碳水化合物的不斷降解。

表5 固體產(chǎn)物的得率、木質(zhì)素分析表Table5 Table of yield and lignin analysis of solid products

3 結(jié)論

通過研究多年生過表達ERF76 小黑楊的化學組分變化為人們進一步了解ERF76 基因?qū)δ静慕M分方面的影響提供了相關(guān)依據(jù)。通過對兩年生WT 與不同ERF76 過表達轉(zhuǎn)基因株系木材化學組分的分析和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，揭示了ERF76 基因過表達倍率不同對木材各組分的影響。當FC 增高時纖維素組分占比曾高，半纖維素含量占比較低；當FC 進一步提高時半纖維素含量占比得到逐步提高，纖維素占比下降。根據(jù)實驗結(jié)果選出化學組分來變化較為明顯的ERF76 轉(zhuǎn)基因株系（P1），通過進一步檢驗六年生WT 與P1 植株的木材化學組分數(shù)據(jù)，觀察到由ERF76 基因過表達造成的纖維素、半纖維素組分影響在植物生長發(fā)育過程中不斷累積。

針對ERF76 基因?qū)w維素、半纖維素組分影響較大的特點，對轉(zhuǎn)基因小黑楊木材中相關(guān)纖維素、半纖維素材料方面進行了低聚合度半纖維素的提取和堿法處理工藝處理的進一步的探究。研究發(fā)現(xiàn)ERF76過表達的小黑楊木材中低聚合度的半纖維素占據(jù)其半纖維素總量的大部分。這為探究ERF76 基因影響植株低聚合度半纖維素合成路徑提供了一定的思路。在堿處理實驗過程中通過對反應(yīng)溫度的限制，利用剝皮反應(yīng)為主要反應(yīng)探究化學組分變化在比較溫和的堿性反應(yīng)過程中帶來的影響。具體表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因株系（P1）相較WT 存在高纖維素低半纖維素的特點。在剝皮反應(yīng)中半纖維素含量低反應(yīng)快、纖維素含量高反應(yīng)慢，最終導致了P1 高得率結(jié)果。半纖維素提取結(jié)果上找到了轉(zhuǎn)基因木材在室溫下氫氧化鈉濃度為100 g/L 時最適提取時間為90 min。