寧薇,聶方欽,張哲

(1.湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,長(zhǎng)沙 410005;2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科,長(zhǎng)沙 410013;3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院藥學(xué)部,長(zhǎng)沙 410013)

顆粒細(xì)胞是包繞在卵母細(xì)胞外層的多邊形的細(xì)胞,通過(guò)縫隙連接和橋粒與卵母細(xì)胞連接,與卵泡發(fā)育密切相關(guān)。多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種育齡期女性最常見(jiàn)的排卵障礙性不孕癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)自噬可能是PCOS患者卵泡發(fā)育異常的重要原因[2]。自噬是細(xì)胞降解廢棄蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的過(guò)程[3],維持著細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,但過(guò)度的自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞,引起細(xì)胞死亡。自噬體的積聚可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞死亡,從而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。然而目前對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的自噬研究還較少。

脂質(zhì)是參與代謝和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及生殖功能的細(xì)胞的重要組成部分[4],PCOS與脂質(zhì)代謝異常有關(guān),其中脂肪酸的急劇增加是PCOS患者的脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂的重要原因之一[5]。棕櫚酸(palmitic acid,PA)是一種長(zhǎng)鏈脂肪酸,是機(jī)體內(nèi)最常見(jiàn)的飽和脂肪酸。研究發(fā)現(xiàn)在PCOS患者卵泡液中PA的水平增加[6]。但是PA對(duì)顆粒細(xì)胞影響的機(jī)制尚不清楚。本研究以人卵巢顆粒細(xì)胞KGN細(xì)胞系為研究對(duì)象,觀察PA對(duì)KGN細(xì)胞自噬平衡及脂質(zhì)代謝的影響,并探討該過(guò)程潛在的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人卵巢顆粒細(xì)胞系KGN購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。PA(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào):P0500,含量≥99%)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)(美國(guó)MedChemExpress公司,貨號(hào):HY-19312,含量≥99%);油紅O染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):G1262)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)紅色熒光試劑(北京普利萊基因技術(shù)公司,貨號(hào):C1300-2)、細(xì)胞增殖試劑盒(cell counting kit,CCK-8,美國(guó)APExBIO公司,貨號(hào):K1018);SREBP1鼠抗人多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司,貨號(hào):ab28481);p62(貨號(hào):18420-1-AP)、LC3(貨號(hào):14600-1-AP)、PTEN誘導(dǎo)的假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)(貨號(hào):23274-1-AP)、Parkin(貨號(hào):14060-1-AP)、β-actin兔抗人多克隆抗體(貨號(hào):20536-1-AP)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)公司。

1.2儀器與設(shè)備 全自動(dòng)顯微鏡(日本 Olympus BX61),多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Beckman DTX 880),凝膠成像分析儀(美國(guó)BIO-RAD 1708195)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù) KGN細(xì)胞系采用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)液/F12培養(yǎng)基于 37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合至80%時(shí)進(jìn)行傳代。根據(jù)前期細(xì)胞活性測(cè)定預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定PA及3-MA刺激的濃度和時(shí)間,將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的KGN細(xì)胞分為正常對(duì)照組(無(wú)處理)、含有不同濃度PA處理組(100、200、400 μmol·L-1)、3-MA(3 mmol·L-1)處理組、3-MA(3 mmol·L-1)+PA(400 μmol·L-1)處理組。各組加藥處理 24 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

1.4油紅O染色試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KGN細(xì)胞,以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于放爬片的6孔板上,細(xì)胞培養(yǎng)至密度60%～70%時(shí),進(jìn)行PA干預(yù),正常對(duì)照組加不含PA的完全培基。放入孵箱培養(yǎng)24 h后,取出培養(yǎng)板,磷酸鹽緩沖液洗3次,用4%多聚甲醛固定30 min,磷酸鹽緩沖液洗3次,油紅O染液室溫染色30 min,純化水洗30 s至背景透明,再用蘇木精復(fù)染室溫染色3 min,純化水洗30～60 s,用水性封片劑封片,顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的脂滴。

1.5Western blotting檢測(cè)SREBP1、p62、LC3、PINK1、Parkin表達(dá)水平 使用RIPA細(xì)胞裂解液處理各組KGN細(xì)胞;制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropho-resis,SDS-PAGE)凝膠,將蛋白樣品上樣到SDS-PAGE 凝膠加樣孔內(nèi)進(jìn)行電泳;電泳結(jié)束后用濕式轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜。室溫下,經(jīng)含5%脫脂奶粉的 TBST封閉1 h后,4 ℃條件下孵育一抗過(guò)夜后,37 ℃溫箱中分別與相應(yīng)的連接有辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育1 h,用TBST洗去未發(fā)生結(jié)合的二抗。利用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶。膠片經(jīng)掃描后,利用Image J定量對(duì)應(yīng)條帶的強(qiáng)度。

1.6CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KGN細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,以每孔4×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于 96 孔板中,待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理,各處理組于24 h后,每孔加入CCK-8溶液10 μL,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 2 h;用酶標(biāo)儀測(cè)定其在波長(zhǎng) 450 nm 處的吸光度(A值)。細(xì)胞活性(%)=處理組A值/正常對(duì)照組A值×100%,重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平分析 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KGN接種于放有爬片的6孔板,常規(guī)培養(yǎng)貼壁后更換不同加藥處理組的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液洗滌3次,加入用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA 熒光探針和細(xì)胞一起在37 ℃溫箱孵育30 min,再用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞3次,將爬片置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。用 Image J 圖像分析系統(tǒng)分析各實(shí)驗(yàn)組紅色熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1不同濃度PA對(duì)KGN細(xì)胞脂滴油紅O染色結(jié)果 見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示正常KGN細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯橘紅色脂滴。隨PA刺激濃度增加,與正常對(duì)照組比較,細(xì)胞體積增大,細(xì)胞內(nèi)脂滴形成增多,細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)大量大泡樣橘紅色脂滴。且隨著PA濃度的增加胞內(nèi)脂滴數(shù)量增加更為明顯。

圖1 不同濃度PA對(duì)KGN細(xì)胞脂滴油紅O染色的影響(n=3)

2.2不同濃度PA對(duì)KGN細(xì)胞SREBP1蛋白表達(dá)結(jié)果 與正常對(duì)照組比較,隨PA刺激濃度增加,KGN細(xì)胞固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白SREBP1蛋白表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢(shì),其中PA為400 μmol·L-1時(shí)對(duì)SREBP1表達(dá)上調(diào)最為明顯(t=4.52,P<0.05),見(jiàn)圖2。

①與正常對(duì)照組比較,t=4.52,P<0.05。

2.3PA抑制卵巢顆粒細(xì)胞活性 正常對(duì)照組、PA(100、200、400 μmol·L-1)處理組的KGN細(xì)胞活性分別為(100.00±0.00)%、(78.74±2.87)%、(57.48±6.50)%、(46.58±4.26)%。PA(100、200、400 μmol·L-1)處理組與正常對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.10、11.06、21.15,P<0.05)。隨著PA濃度增加,KGN的活性呈下降趨勢(shì),其中PA濃度為400 μmol·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞活性的影響最為明顯,表現(xiàn)出明顯的抑制作用,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以400 μmol·L-1PA進(jìn)行處理。

2.4自噬抑制劑3-MA對(duì)KGN細(xì)胞活性的影響 正常對(duì)照組、400 μmol·L-1PA處理組、3-MA組、PA和3-MA聯(lián)合處理組的KGN細(xì)胞活性分別為(100.00±0.00)%、(28.11±1.24)%、(81.66±5.12)%、(37.26±1.28)%。400 μmol·L-1的PA 處理后,細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(t=78.11,P<0.01),加入3-MA預(yù)處理后,可逆轉(zhuǎn)PA對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用(t=8.87,P<0.05)。而3-MA單獨(dú)作用細(xì)胞不引起細(xì)胞活性改變(P>0.05)。

2.53-MA對(duì)PA誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞ROS含量的影響 ROS熒光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。與正常對(duì)照組的KGN細(xì)胞比較,400 μmol·L-1PA處理4 h后的KGN細(xì)胞紅色熒光信號(hào)強(qiáng)度增加,表明ROS水平升高(t=15.54,P<0.01),而使用3-MA預(yù)處理后ROS生成減少(t=5.04,P<0.05)。此外,3-MA單獨(dú)作用細(xì)胞與對(duì)照組相比不引起ROS水平的改變(P>0.05)。

A.正常對(duì)照組;B.400 μmol·L-1PA組;C.3 mmol·L-13-MA組;D.3 mmol·L-13-MA+400 μmol·L-1PA組。①與正常對(duì)照組比較,t=15.54,P<0.01;②與PA組比較,t=5.04,P<0.05。

2.63-MA對(duì)PA誘導(dǎo)的p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4,各實(shí)驗(yàn)組中均可見(jiàn)p62及LC3蛋白表達(dá)。3-MA單獨(dú)處理組與對(duì)照組比較,LC3比值和p62相對(duì)表達(dá)水平均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。而400 μmol·L-1PA處理組與對(duì)照組比較,p62相對(duì)表達(dá)水平與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.58、10.75,P<0.05)。加入3-MA預(yù)處理后與PA組比較,p62表達(dá)下調(diào)(t=10.28,P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值減小(t=8.02,P<0.01)。

A.正常對(duì)照組;B.400 μmol·L-1 PA組;C.3 mmol·L-1 3-MA組;D.3 mmol·L-1 3-MA+400 μmol·L-1 PA組;①與正常對(duì)照組比較,P<0.01;②與PA組比較,P<0.05;③ 與PA組比較,P<0.01。

2.73-MA對(duì)PA誘導(dǎo)的PINK1、Parkin表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5,與正常對(duì)照組比較,400 μmol·L-1PA處理組KGN細(xì)胞PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平升高(t=6.43、5.97,P<0.05)。使用3-MA預(yù)處理細(xì)胞后,與PA處理組比較,KGN細(xì)胞PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平降低(t=4.65、6.50,P<0.05)。

A.正常對(duì)照組;B.400 μmol·L-1PA組;C.3 mmol·L-13-MA組;D.3 mmol·L-13-MA+400 μmol·L-1PA組;①與正常對(duì)照組比較,P<0.05;②與PA組比較,P<0.05。

3 討論

本研究表明PA對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞具有脂毒性,導(dǎo)致顆粒細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和細(xì)胞活性降低,ROS含量增加。細(xì)胞表型改變與PA誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激,激活線粒體自噬有關(guān)。

體內(nèi)游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)會(huì)引起心臟及外周器官細(xì)胞脂質(zhì)含量增加,并轉(zhuǎn)化為三酰甘油[7]。過(guò)量的FFA對(duì)顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞發(fā)育是有害的。在以往的研究中證明了飽和游離脂肪酸尤其是PA,可以引發(fā)胰島素抵抗,對(duì)卵泡發(fā)育產(chǎn)生負(fù)性影響[8]。本研究顯示,隨著PA濃度增加引起了顆粒細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量的顯著增加,脂肪酸合成途徑的主調(diào)控因子SREBP1蛋白表達(dá)水平增加,伴隨顆粒細(xì)胞活性下降,提示PA促進(jìn)顆粒細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積,影響顆粒細(xì)胞脂質(zhì)代謝,從而引起細(xì)胞損傷。

卵母細(xì)胞是人體內(nèi)最大的細(xì)胞,其發(fā)育需要充足能量供應(yīng)。除自身線粒體產(chǎn)生的能量外,還需要其周圍的顆粒細(xì)胞線粒體氧化呼吸提供能量。顆粒細(xì)胞中含有豐富的線粒體,通過(guò)糖酵解途徑將胞質(zhì)中的葡萄糖代謝為丙酮酸,并轉(zhuǎn)運(yùn)到卵母細(xì)胞中用以產(chǎn)生三磷酸腺苷,維持卵母細(xì)胞的發(fā)育[9]。本研究發(fā)現(xiàn)PA引起顆粒細(xì)胞ROS含量增加,說(shuō)明在PA刺激下顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激加重,細(xì)胞損傷的效應(yīng)細(xì)胞器主要在線粒體。3-MA為經(jīng)典自噬抑制劑,可抑制自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化,從而抑制自噬活性。為了進(jìn)一步佐證PA引起的顆粒細(xì)胞線粒體損傷與自噬活性增加有關(guān),筆者以3-MA為工具藥,觀察顆粒細(xì)胞在PA刺激下自噬的變化。結(jié)果顯示3-M可逆轉(zhuǎn)PA引起的氧化應(yīng)激現(xiàn)象,證明了 PA引起顆粒細(xì)胞線粒體損傷與自噬活性相關(guān)。

正常情況下在一個(gè)生殖周期內(nèi),自噬是卵泡發(fā)育、生長(zhǎng)和分化、閉鎖所必需的[10-11]。據(jù)報(bào)道PCOS 患者卵巢組織中自噬活性增高,且在PCOS大鼠模型也發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào)[12]。研究顯示,p62等自噬相關(guān)蛋白會(huì)在 PCOS女性卵巢的膜細(xì)胞層中積累[13],本研究結(jié)果顯示對(duì)照組也有p62和LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達(dá),說(shuō)明體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)存在基礎(chǔ)水平的自噬;加入PA處理后會(huì)明顯引起卵巢顆粒細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和p62的表達(dá)增加,且可被3-MA逆轉(zhuǎn)。p62為自噬接頭蛋白,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ是自噬體膜的結(jié)構(gòu)蛋白。有研究認(rèn)為當(dāng)自噬被激活時(shí)自噬囊泡中p62等蛋白被溶酶體酶降解,p62水平降低,而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高,但本研究顯示p62與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ變化趨同。p62變化存在偏差其原因可能是在正常細(xì)胞中,自噬不斷發(fā)生p62蛋白不斷降解以促使泛素化蛋白的清除。但在應(yīng)激條件下,特別是在本研究中PA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的環(huán)境下,可以引發(fā)自噬功能缺陷進(jìn)而導(dǎo)致p62蛋白聚集[14]。

當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)極易對(duì)線粒體造成損傷,導(dǎo)致其功能障礙[15]。此時(shí)線粒體穩(wěn)態(tài)平衡需要通過(guò)線粒體自噬實(shí)現(xiàn)。PINK1是線粒體自噬的主要調(diào)節(jié)因子,能夠迅速有效地將E3泛素連接酶Parkin募集到受損的線粒體。Parkin促進(jìn)線粒體膜上蛋白質(zhì)泛素化,從而啟動(dòng)線粒體自噬以清除受損線粒體。PINK1和Parkin蛋白的過(guò)表達(dá)表明線粒體自噬增加,與線粒體損傷有關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn)在PCOS患者的卵巢顆粒細(xì)胞中PINK1/Parkin被過(guò)度激活[17]。本研究也證實(shí)PA處理的卵巢顆粒細(xì)胞能夠增加ROS含量和PINK1、Parkin蛋白的表達(dá)。且可被自噬抑制劑3-MA逆轉(zhuǎn),這說(shuō)明PA可能過(guò)度激活PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬導(dǎo)致線粒體損傷,這可能是PA參與PCOS的發(fā)病機(jī)制。

本研究從卵巢脂質(zhì)代謝切入探討PCOS的發(fā)病機(jī)制及PA對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞自噬平衡的影響,結(jié)果表明PA可以通過(guò)引起卵巢顆粒細(xì)胞脂質(zhì)蓄積,增加ROS含量,激活PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬導(dǎo)致線粒體損傷損害生殖功能;這些發(fā)現(xiàn)將有助于從新的視角為PCOS的機(jī)制研究和治療提供理論支持。本研究還存在不足之處,即僅在體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究了 PA 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞自噬平衡的影響,自噬平衡破壞引發(fā)的 PCOS 的潛在機(jī)制尚未完全闡明。 關(guān)于 PA 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞自噬的調(diào)控及其相關(guān)作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。