廉梅芳，時(shí)黎明，鄭文學(xué)，李娟，李桂霞，于廣福

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東省高等學(xué)校新發(fā)傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000 2.菏澤市立醫(yī)院

皰疹病毒屬DNA病毒，為有包膜病毒，包括1型單純皰疹病毒（herpes simplex virus type 1,HSV-1）、2 型單純皰疹病毒（herpes simplex virus type 2,HSV-2）和水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus, VZV）等[1]。單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）基因組大小約為152 kbp，表面編碼17 種包膜蛋白，包括12 種糖基化的包膜蛋白，其中型特異性糖蛋白gG可以區(qū)分HSV-1和HSV-2[2]。HSV-2屬皰疹病毒科α 皰疹病毒亞科，是引起生殖器皰疹的主要病原體之一[3-4]；該病毒還可感染白細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞[5-7]，導(dǎo)致腦炎和傳播性疾病，影響其他器官系統(tǒng)[8-9]。全世界有超過5 億人感染HSV-2，并且以每年2 300 萬人的速度增加[10]。目前還沒有可以有效預(yù)防HSV-2 感染的疫苗[11]，阿昔洛韋（acyclovir, ACV）作為抗HSV-2 藥物，安全有效、耐受性好[12]，然而ACV 耐藥性問題的出現(xiàn)嚴(yán)重影響其對(duì)HSV-2 的臨床抑制效果[13]，因此亟須開發(fā)其他有效的抗HSV-2藥物對(duì)其進(jìn)行預(yù)防和治療。

紫草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，從紫草中分離的乙酰紫草素（acetylshikonin, AS）純度達(dá)到98.4%[14]。AS 可通過直接殺滅病毒、抑制病毒復(fù)制、免疫調(diào)節(jié)等機(jī)制發(fā)揮抗病毒作用[15]。同時(shí)，研究表明AS 對(duì)副流感病毒[16]、人類免疫缺陷病毒[17]、柯薩奇病毒[18]等均有抑制作用。多項(xiàng)研究結(jié)果證明，AS 在臨床上具有獨(dú)特的研究價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，本研究擬明確AS 體外抗HSV-2 的作用，為抗HSV-2 感染提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 成年非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）、HSV-2 由本實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)驗(yàn)中HSV-2 于維持液（97%DMEM+2%FBS+1%青霉素-鏈霉素溶液）中培養(yǎng)，滴度為10-5.5TCID50/100 μL。

1.1.2 藥物 AS（貨號(hào)：SA8980）購于北京索萊寶科技有限公司，ACV（國藥準(zhǔn)字：H10900095）購于湖北科益藥業(yè)股份有限公司。

1.1.3 其他主要試劑和儀器 CCK-8 試劑購于北京索萊寶科技有限公司；Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液、SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒購于AG 艾科瑞生物。儀器設(shè)備主要為7500 Fast 熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司），371 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技中國有限公司），1388 A2生物安全柜（賽默飛世爾科技中國有限公司），高壓滅菌機(jī)（重慶雅馬拓科技有限公司），高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技中國有限公司），倒置顯微鏡（尼康株式會(huì)社）。

1.2 方法

1.2.1 AS 對(duì)Vero 細(xì)胞的毒性測(cè)定 用維持液將AS 和ACV 按2 倍梯度稀釋為2-1、2-2……2-9，并以連續(xù)稀釋的AS 或ACV 溶液接種在長滿單層Vero 細(xì)胞的96 孔板中作為實(shí)驗(yàn)組，不加藥物作為細(xì)胞對(duì)照組，空白對(duì)照組無細(xì)胞、無藥物。細(xì)胞培養(yǎng)板在37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。每孔加入10 μL CCK-8 試劑，1 h 后用酶標(biāo)儀在450 nm 波長測(cè)定吸光度（A），Graphpad Prism 5.0 軟件計(jì)算最大無毒濃度（maximal atoxic concentration, TC0），檢測(cè)AS 對(duì)Vero細(xì)胞的毒性作用。

1.2.2 AS 抗HSV-2 活性作用測(cè)定 以2 倍梯度稀釋的AS 和ACV 分別與HSV-2 等體積混合，HSV-2病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）為0.1。在37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h 后，接種于Vero細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)2 d。每孔加入10 μL CCK-8 試劑，1 h 后于450 nm 波長測(cè)其吸光度（A），GraphPad Prism 5.0 軟件計(jì)算半數(shù)有效濃度（50%effective concentration,EC50）。

1.2.3 AS 對(duì)HSV-2 病毒復(fù)制的影響 根據(jù)HSV-2復(fù)制周期的不同[10,18]，分別在病毒感染前期、病毒生物合成期、病毒吸附期、病毒進(jìn)入期以及病毒釋放期加入AS 藥物，HSV-2 病毒MOI 為0.1，AS 藥物濃度為3.785 μmol/L，通過顯微鏡觀察病毒感染24 h后Vero 細(xì)胞的形態(tài)變化。病毒感染前期，Vero 細(xì)胞中加入AS 培養(yǎng)5 h，隨后接種HSV-2 培養(yǎng)1 h，棄培養(yǎng)上清并用PBS 清洗，用維持液培養(yǎng)12、24、36 h后收集細(xì)胞。病毒生物合成階段，Vero細(xì)胞中接種HSV-2 培養(yǎng)1 h，隨后加入AS 培養(yǎng)6 h，棄培養(yǎng)上清并用PBS 清洗，用維持液培養(yǎng)12、24、36 h 后收集細(xì)胞。病毒吸附階段，Vero細(xì)胞中接種HSV-2，4 ℃培養(yǎng)1 h 后收集細(xì)胞。病毒進(jìn)入階段，Vero 細(xì)胞中接種HSV-2，4 ℃培養(yǎng)1 h、37 ℃培養(yǎng)2 h 后收集細(xì)胞。病毒釋放階段，Vero細(xì)胞中接種HSV-2培養(yǎng)1 h，棄培養(yǎng)上清并用PBS 清洗，用維持液培養(yǎng)6 h，加入AS 培養(yǎng)12、24、

36 h 后收集培養(yǎng)上清。同時(shí)設(shè)置維持液對(duì)照組和AS 直接滅活病毒組，AS 直接滅活病毒組是將AS 與HSV-2 混合后培養(yǎng)1 h，接種于Vero細(xì)胞12、24、36 h 后收集細(xì)胞，培養(yǎng)TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA 測(cè)定病毒載量；培養(yǎng)上清進(jìn)行半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50% tissue culture infective dose,TCID50）測(cè)定。

將提取的細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增cDNA 來檢測(cè)HSV-2gG2 基因（型特異性抗原，常用于HSV 診斷分型）和β-actin內(nèi)參基因（常作為組織細(xì)胞基因表達(dá)內(nèi)參）的Ct 值，其中HSV-2gG2 基因引物序列參照文獻(xiàn)[19]；β-actin內(nèi)參基因引物序列參照文獻(xiàn)[20]。采用2-△△Ct計(jì)算HSV-2 病毒mRNA 相對(duì)表達(dá)量，評(píng)估AS在HSV-2復(fù)制周期不同階段的抗病毒效果。

1.2.4 AS 對(duì)HSV-2 噬斑形成抑制實(shí)驗(yàn) 以AS 和ACV 最大無毒濃度稀釋液分別與HSV-2（MOI=0.100、0.010、0.001）等體積混合，在37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中作用2 h；取病毒混合液接種Vero 細(xì)胞并孵育1 h，棄去上清，PBS 清洗，滴加1.2%甲基纖維素覆蓋細(xì)胞單層，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h；用1%結(jié)晶紫溶液染色，計(jì)算斑塊，評(píng)估AS抗病毒作用。

1.2.5 AS 對(duì)HSV-2 病毒粒子超微結(jié)構(gòu)的影響 用HSV-2（MOI=0.1）接種Vero 細(xì)胞，當(dāng)病變程度達(dá)到90%，將細(xì)胞反復(fù)凍融，離心去除細(xì)胞沉淀，0.45μm濾膜過濾上清除菌；82 700×g，4 ℃離心2 h，棄上清，沉淀于PBS 溶解過夜；將病毒樣液用2.5%戊二醛固定送樣。TC0和EC50的AS分別與HSV-2（MOI=0.1）等體積混合，在37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中作用1 h，取病毒混合液制片，將切片放入TEM 透射電鏡中觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，采用重復(fù)設(shè)計(jì)的方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對(duì)多組之間比較采用單因素方差分析（組間多重比較采用LSD法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 AS 對(duì)Vero 細(xì)胞的毒性及抗HSV-2 活性測(cè)定AS的TC0為3.785μmol/L，陽性對(duì)照藥物ACV的TC0為1 110.100μmol/L，此時(shí)細(xì)胞存活率＞90%。AS 在1.678～3.785μmol/L抑制HSV-2的復(fù)制，AS的EC50為0.334μmol/L，ACV的EC50為0.678μmol/L（圖1）。

圖1 AS和ACV在Vero細(xì)胞中的毒性及抗病毒活性測(cè)定Figure 1 Determination of toxicity and antiviral activity of AS and ACV in Vero cells

2.2 AS對(duì)HSV-2病毒復(fù)制的影響 實(shí)驗(yàn)組病毒感染前期（圖2A）、生物合成期（圖2C）添加病毒和藥物后，細(xì)胞均變圓、收縮和分離，表明存在細(xì)胞毒性。在病毒感染前期12、24和36 h，實(shí)驗(yàn)組與病毒感染對(duì)照組病毒載量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（6.04±1.24vs.6.09±1.46，5.98±1.27vs.6.17±1.44，5.91±1.23vs.6.17±1.41；t=0.164、9.648、1.016，P均＞0.05）（圖3A）。在生物合成期12、24 和36 h，實(shí)驗(yàn)組與病毒感染對(duì)照組病毒載量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（6.78±1.05vs.6.78±1.10，6.68±1.03vs.6.78±1.07，6.69±1.09vs.6.78±1.12；t=1.942、1.516、5.752，P均＞0.05）（圖3B）。相比其病毒感染對(duì)照組（圖2L），AS 直接滅活病毒組（圖2K）鏡檢觀察活細(xì)胞數(shù)相對(duì)較高，細(xì)胞單層在形態(tài)學(xué)上與細(xì)胞對(duì)照組更具可比性。在12、24、36 h，AS直接滅活病毒組的病毒載量低于病毒感染對(duì)照組（0.24±0.09vs.1.35±0.07；4.46±0.06vs.6.75±0.04；2.70±0.04vs.5.27±0.10），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.920、33.360、24.020，P均＜0.05）（圖3C）。在病毒吸附進(jìn)入階段，病毒載量與其相應(yīng)的病毒感染對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3D）。在病毒釋放階段，藥物AS加入12 和36 h 后，實(shí)驗(yàn)組的病毒TCID50低于病毒感染對(duì)照組（13.43±10.04vs.127.00±0.32；3.47±0.55vs.5.80±0.12），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.359、4.161，P均＜0.05）（圖3E）。

圖2 AS抗病毒活性的測(cè)定（×100）Figure 2 Determination of the antiviral activity of AS against HSV-2(×100)

圖3 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和TCID50測(cè)定的AS抗病毒活性Figure 3 Measurement of the antiviral activity of AS against HSV-2 by RT-qPCR

2.3 AS 抑制HSV-2 噬斑形成 噬斑形成抑制實(shí)驗(yàn)中，HSV-2（MOI=0.100、0.010、0.001）感染Vero 細(xì)胞72 h后，1%結(jié)晶紫溶液染色后細(xì)胞中的空斑數(shù)量顯著減少。不同劑量HSV-2與AS和ACV的混合液分別接種Vero細(xì)胞后空斑數(shù)量明顯減少。見圖4。

圖4 AS對(duì)噬斑形成的抑制作用Figure 4 The inhibitory effect of AS against plaque formation

2.4 AS 影響HSV-2 病毒粒子超微結(jié)構(gòu) 鏡檢結(jié)果顯示，正常HSV-2 呈球形（圖5A、圖5F），最外層為典型的脂質(zhì)雙層囊膜，上有刺突。有包膜的病毒直徑為150～200 nm。當(dāng)用低濃度（1.678 μmol/L）AS 處理病毒時(shí)，原本呈球形的病毒粒子表面形狀發(fā)生改變（圖5B、圖5C），缺損處明顯可見（圖5G、圖5H）；當(dāng)AS濃度增加時(shí)，即用高濃度（3.785μmol/L）處理病毒，病毒粒徑變小，約為70～80 nm，遠(yuǎn)小于正常HSV-2病毒粒徑（圖5D、圖5E、圖5I、圖5J）。

圖5 透射電鏡下AS對(duì)HSV-2病毒的影響（×100 000）Figure 5 Effect of acetylshikonin on HSV-2 virions under electron microscope(×100 000)

3 討 論

近幾年來，中草藥在疾病預(yù)防及治療中的作用越來越被重視，特別是在抗擊新型冠狀病毒感染疫情期間，人參及其復(fù)方制劑等中草藥發(fā)揮了重要作用[21]，中草藥抗病毒效果及其機(jī)制研究的重要性日益凸顯。既往研究表明，AS 可以阻斷宿主細(xì)胞表面人體免疫缺陷病毒1 型進(jìn)入輔助受體的表達(dá)，從而抑制病毒感染，主要作用于病毒吸附過程發(fā)揮抗病毒作用[17]；AS 還可直接滅活柯薩奇病毒A16 型，并且可以阻斷病毒在體外的吸附/穿入過程，進(jìn)而有效地抗柯薩奇病毒A16 型感染[18]。紫草素酯衍生物能夠抗H1N1流感的侵襲[22]；此外，還能抑制橫紋肌肉瘤細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子（IL-1b、IL-6、IL-8 和TNF-a）的表達(dá)，表現(xiàn)出對(duì)腸道病毒的抗病毒活性[23]。多項(xiàng)研究證實(shí)，紫草素及其衍生物具有廣譜的抗病毒活性，可以通過多種抗病毒途徑或機(jī)制實(shí)現(xiàn)，本研究同樣表明，AS 對(duì)HSV-2 具有一定的抗病毒效應(yīng)。

HSV-2 是人類皰疹病毒家族中α 亞族的一種嗜神經(jīng)性雙鏈DNA 病毒，由包膜、被蓋、衣殼和雙鏈DNA 分子組成[24]。病毒通過吸附、穿入、脫殼、生物合成、組裝與釋放這五個(gè)主要階段完成病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制。本研究用HSV-2 感染Vero 細(xì)胞，用安全濃度范圍內(nèi)的AS 處理被感染的細(xì)胞，結(jié)果表明，AS 能有效抑制HSV-2 對(duì)Vero 細(xì)胞的感染。此外，病毒感染細(xì)胞主要表現(xiàn)為致細(xì)胞病變和噬斑形成，AS 可保護(hù)細(xì)胞免受病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷并且可以顯著降低病毒感染引起的空斑數(shù)量，對(duì)MOI 為0.001～0.100 的HSV-2，AS 均具有抑制作用。AS 對(duì)HSV-2 不同復(fù)制階段的抑制作用，主要表現(xiàn)在AS直接滅活病毒顆粒時(shí)可降低細(xì)胞里的病毒載量，在病毒釋放階段對(duì)子代病毒有一定抑制作用，體現(xiàn)出良好的體外抗HSV-2活性。透射電鏡結(jié)果證實(shí)，AS 對(duì)病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)具有破壞作用，并且隨著藥物濃度的增加，對(duì)病毒的損傷逐漸明顯，說明AS對(duì)HSV-2的抗病毒作用可能是通過改變病毒顆粒的包膜結(jié)構(gòu)，降低病毒的感染能力。由此推測(cè)，AS 破壞病毒包膜可能是抑制HSV-2 的作用機(jī)制之一。

綜上，一定濃度范圍內(nèi)的AS 可以在體外直接抑制病毒，然而本次研究表明AS 仍有其局限性，其細(xì)胞毒性較強(qiáng)，且雖然表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外直接抗病毒作用，但對(duì)病毒感染沒有預(yù)防作用。AS 在體外對(duì)病毒的直接抑制作用可為開發(fā)治療2 型單純皰疹病毒感染新藥物提供新思路，但更深入的抗病毒作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明全部作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明廉梅芳負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)整理、論文撰寫；鄭文學(xué)參與實(shí)驗(yàn)實(shí)施與數(shù)據(jù)分析；李娟、時(shí)黎明、李桂霞參與實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；于廣福負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文修改