劉 宇，宋福祥

（1.佳木斯大學(xué) a 康復(fù)醫(yī)學(xué)院* 護理學(xué)院 b 兒童神經(jīng)康復(fù)實驗室，黑龍江 佳木斯 154007 ；2.深圳市龍華區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000）

腦性癱瘓（cerebral palsy，CP）簡稱腦癱，是由大腦發(fā)育不成熟、先天性發(fā)育缺陷或損傷等非進行性腦損傷引起的一組持續(xù)存在的中樞性運動和姿勢發(fā)育障礙、活動受限的癥候群[1]。我國目前1 ～6歲兒童腦癱的患病率為2.46‰[2]，國外的患病率為1.4‰～3.2‰[3-5]。目前，已有很多證據(jù)表明早期干預(yù)可以有效改善腦癱患兒的預(yù)后。但當前的早期診斷主要是基于神經(jīng)系統(tǒng)檢查以及運動功能評估。為了能夠更準確、更早地診斷腦癱，越來越多的研究人員關(guān)注到生物標志物的篩查。通過生物標志物檢測進行早期診斷，并給予腦癱患兒早期干預(yù)和治療，可改善其預(yù)后。生物標志物是指具有“一種可客觀檢測和評價的特性，可作為正常生物學(xué)過程、病理過程或治療干預(yù)藥理學(xué)反應(yīng)的指示因子”。尋找和發(fā)現(xiàn)有價值的生物標志物已成為當前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。生物標志物對疾病的早期診斷及干預(yù)策略的制定至關(guān)重要。本文總結(jié)了目前腦癱生物標志物以及針對這些生物標志物發(fā)展的檢測技術(shù)，以期為腦癱的提早發(fā)現(xiàn)及早期干預(yù)提供指導(dǎo)。

1 生物標志物

1.1 遺傳基因

目前越來越多的證據(jù)表明，10% ～30% 的腦癱兒童可以確定潛在的遺傳病因[6]。腦癱低風(fēng)險嬰兒也應(yīng)該進行遺傳病理學(xué)篩查，如沒有先天性出生缺陷的足月兒[7]。通過全外顯子組測序（Whole Exome Sequencing，WES）[8]，研究者報道了三個先前確定的 腦 癱 基 因（TUBA1A、SCN8A 和KDM5C）及 六個新的候選腦癱基因（AGAP1、JHDM1D、MAST1、NAA35、RFX2 和WIPI2）可能對腦癱具有潛在的致病性。最終，在14% 的腦癱病例中發(fā)現(xiàn)了新發(fā)和遺傳性單核苷酸變異，其中一半在候選基因中，同時確定了5 個基因的變異可能會導(dǎo)致腦癱的出現(xiàn)，分別為KDM5C、SCN8A、TUBA1A、L1CAM 和PAK3。遺傳的異質(zhì)性突出了遺傳對腦癱影響的復(fù)雜性，需要進一步研究來確定這些假定致病性腦癱基因的致病作用。這些研究突出了下一代測序可提供精確的分子診斷作用，加深了對疾病病理學(xué)的理解，為完善遺傳機制和預(yù)后咨詢提供了機會。另外，當前此方法運用越來越多，操作也越來越便捷，希望未來在預(yù)測腦癱方面得到更多的重視。

1.2 DNA 甲基化

DNA 甲基化是一類發(fā)生在胞嘧啶5 號位碳原子上，可以通過改變基因和蛋白質(zhì)的表達水平來穩(wěn)定遺傳的表觀修飾。表觀遺傳學(xué)在改變基因表達以應(yīng)對細胞壓力或疾病方面具有關(guān)鍵作用[9]。Mohandas 等[10]研究指出，同卵雙胞胎之間腦癱患病率的差異可能與DNA 甲基化改變有關(guān)，通過研究共鑒定出190 個差異甲基化基因，其中腦癱組37 個基因高甲基化，其余153 個基因低甲基化。另一項研究檢測了同卵雙胞胎新生兒期血液中的DNA 甲基化，發(fā)現(xiàn)與腦癱有關(guān)的多個基因胞嘧啶的CpG 位點有甲基化變化。差異甲基化的關(guān)鍵CpG 位點是HNRNPL、RASSF5、CD3D 和KALRN。Bahado-Singh 等[11]為評估腦癱兒童血液樣本中的DNA 甲基化，以及研究潛在的表觀遺傳生物標志物以預(yù)測腦癱，進行了全基因組DNA 甲基化分析，使用人工智能平臺分析了23 名腦癱病例和21 名正常兒童的新生兒期血液DNA 甲基化情況，發(fā)現(xiàn)258個基因中有230 個顯著差異的甲基CpG 位點，對新生兒腦癱的預(yù)測具有95% 的敏感性和94.4% 的特異性。說明使用人工智能平臺技術(shù)分析血液表觀遺傳變化似乎可以準確預(yù)測腦癱，缺點是樣本量不足?，F(xiàn)階段，有關(guān)DNA 甲基化的研究仍有局限性，如難以獲得早期血液樣本、樣本來源者的年齡較大、樣本量較小，以及一些研究的重點是痙攣型腦癱等。未來的研究目標之一是開發(fā)系統(tǒng)的方法和數(shù)學(xué)模型，在出生時篩選受試者。此外，需要對更廣泛的腦癱分型以及來自其他神經(jīng)運動和發(fā)育狀況受試者的樣本進行分析。

1.3 miRNAs

microRNAs（miRNAs）是 一 種 微 小 的 內(nèi) 源 性非編碼調(diào)控RNA，其功能是基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能表達中發(fā)揮重要作用。Chapman 等[12]研究miRNAs 作為腦癱的潛在生物標志物，證實了通過檢測血漿miRNAs 譜預(yù)測腦癱兒童的可能性和潛力。Li 等[13]對腦癱兒童進行血漿miRNAs 檢測，通過qRT-PCR 確定miR-124 的表達，并用熒光素酶試驗和Western 印跡法來確認miR-124 對靶基因的調(diào)控，結(jié)果表明，成熟miR-124 的表達水平在體外被C-T 變異下調(diào)了，并且C-T 變異導(dǎo)致的miR-124 減少使得靶基因ITGB1、LAMC1 和BECN1 的抑制效率降低，而這些基因可能在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。同時，miR-124 表達的減少也與氧化應(yīng)激下細胞凋亡誘導(dǎo)因子的核轉(zhuǎn)位增加有關(guān)，從而誘發(fā)更多的細胞凋亡。最終結(jié)果表明，pri-miR-124-1 的一個功能多態(tài)性可能通過干擾miR-124 的產(chǎn)生而導(dǎo)致兒童腦癱的遺傳易感性，進而干擾miR-124 靶基因的表達和功能。相關(guān)研究證明了miRNA 編碼區(qū)的核苷酸變異與兒童腦癱易感性之間的關(guān)系，顯示出miRNAs 作為生物標志物在預(yù)測腦癱方面的潛力。在過去的幾年中，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)于miRNAs 在大腦中的作用發(fā)表了大量的研究，作為基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，miRNAs 在大腦發(fā)育過程中無疑扮演著至關(guān)重要的角色，然而界定它們對發(fā)育和受傷大腦影響的研究仍處于初級階段。鑒于特定的miRNAs 在發(fā)育過程中可以表現(xiàn)出不同的功能作用，并且可以發(fā)揮協(xié)同作用，因此很難確定它們的精確功能和作用，這是在考慮將特定的miRNAs 作為生物標志物預(yù)測腦癱時需要注意的問題。

1.4 營養(yǎng)信號通路NTRK2（trkB）和FGFR1 的轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄分析能幫助我們了解細胞或生物體基因組的功能，同時揭示細胞或組織的分子成分，用于了解兒童發(fā)育和疾病。轉(zhuǎn)錄組由基因組產(chǎn)生的一整套RNA轉(zhuǎn)錄本組成，這使我們能夠?qū)⑵渑c功能蛋白質(zhì)的表達聯(lián)系起來。轉(zhuǎn)錄組學(xué)現(xiàn)已被用于研究廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，調(diào)查疾病的病因生理學(xué)和潛在的生物標志物，包括阿爾茨海默氏病、孤獨癥譜系障礙和腦癱[14]等。目前，關(guān)于轉(zhuǎn)錄組與腦癱的研究還較少。Van 等[14]對182 名腦癱兒童的大規(guī)模分析發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)信號通路的轉(zhuǎn)錄失調(diào)是腦癱的主要擾動之一，特別強調(diào)NTRK2（trkB）和FGFR1 的下調(diào)。他們將這些與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、成纖維細胞生長因子信號通路以及炎癥標志物的上調(diào)聯(lián)系起來，認為這是導(dǎo)致腦癱中神經(jīng)元保護能力下降的原因。同時有另一種解釋是，營養(yǎng)信號通路的下調(diào)可能是由子宮內(nèi)或產(chǎn)后早期的慢性壓力造成的。識別這種分子異常的環(huán)境和遺傳觸發(fā)因素，將是理解腦癱和其他神經(jīng)發(fā)育障礙的病因以及預(yù)測那些風(fēng)險更大疾病的重要一步。但這項研究存在一定的局限性，其使用的細胞系來自外周血，不能像在大腦中觀察到的那樣概括所有的變化，但仍能為腦癱潛在的神經(jīng)化學(xué)研究提供寶貴的見解。通過對腦癱的轉(zhuǎn)錄變化進行了大規(guī)模的分析研究，證明了臨床不同腦癱中存在趨同分子異常，為未來基因組和功能分析中進一步研究基因的優(yōu)先排序提供了基礎(chǔ)。

1.5 白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-8（IL-8）

當感染引發(fā)下游代謝途徑時，會釋放各種炎癥生物標志物，如細胞因子、白細胞介素（IL）和其他分子。炎癥過程的生物標志物與有害的神經(jīng)學(xué)結(jié)果有關(guān)，如孤獨癥譜系障礙和神經(jīng)發(fā)育障礙[15]。研究表明，炎癥生物標志物與腦癱的發(fā)生風(fēng)險直接相關(guān)。在小鼠模型中，當胎兒暴露在細菌內(nèi)毒素中導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)時，其對缺氧損傷的易感性增加[16]。據(jù)報道，母親的宮內(nèi)炎癥與嬰兒的腦癱風(fēng)險增加有關(guān)[17]。Gomez 等[18]測量了早產(chǎn)或胎膜早破新生兒胎兒時期羊水和血漿中IL-6 的濃度，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)嚴重新生兒疾病的新生兒（包括腦癱前兆室周白斑）其胎兒時期血漿IL-6 的濃度高于未出現(xiàn)嚴重新生兒疾病的新生兒。有學(xué)者研究證實，IL-6、IL-8 水平升高和組織學(xué)胃底炎的證據(jù)與3歲時發(fā)生腦癱的概率增加呈獨立相關(guān)。這項研究表明，由于羊膜腔內(nèi)感染而出現(xiàn)的胎兒全身炎癥與腦癱有很強的相關(guān)性。據(jù)報道，患有新生兒腦病的嬰兒腦脊液和血漿細胞因子水平升高[19]，包括那些后來出現(xiàn)神經(jīng)預(yù)后不良的嬰兒。進一步的研究顯示，在圍產(chǎn)期窒息或新生兒腦病的嬰兒中發(fā)現(xiàn)臍帶血IL-6 水平升高[20]。與此相反，早產(chǎn)兒臍帶血IL-8、IL-1β 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平與腦癱患兒的預(yù)后沒有明顯的關(guān)聯(lián)[21]。此外，腦癱風(fēng)險或長期神經(jīng)發(fā)育結(jié)果不良與臍帶血中中樞神經(jīng)特異性蛋白（S100β）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶的濃度沒有顯著相關(guān)性[22]。最近的一項系統(tǒng)綜述提出了腦癱兒童的神經(jīng)發(fā)育結(jié)果與全血、血漿、血清、腦脊液或尿液中的炎癥生物標志物之間的關(guān)聯(lián)證據(jù)[23]。大多數(shù)研究報告了最初幾年的神經(jīng)系統(tǒng)損傷與外周炎癥之間的關(guān)系。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常與較高的細胞因子循環(huán)水平有關(guān)，包括IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α[24]，增加了腦癱的發(fā)生風(fēng)險。極端早產(chǎn)兒產(chǎn)后2 周內(nèi)TNF-α、TNF-α 受體-1、IL-8 和細胞間黏附分子-1 的反復(fù)升高也與腦癱發(fā)生風(fēng)險的增加有關(guān)[25]。此外，內(nèi)源性紅細胞生成素也與極端早產(chǎn)兒腦癱的發(fā)生有關(guān)[26]。在兒童出生時通過檢測血液、尿液或腦脊液中的炎癥生物標志物，可能有助于早期診斷和干預(yù)腦癱。目前，生物標志物檢測被認為是準確及早期診斷腦癱的關(guān)鍵，但仍缺乏能夠一致識別腦癱兒童的生物標志物，故現(xiàn)階段對于生物標志物的尋找還在進行中。

1.6 代謝組學(xué)生物標志物

代謝組學(xué)的研究重點是生物系統(tǒng)中的代謝途徑，重點是代謝物[27]。由于腦癱發(fā)病機制的復(fù)雜性，目前文獻中關(guān)于腦癱代謝標志物的研究資料較少。通常研究對象為圍產(chǎn)期窒息和缺氧缺血性腦?。╤ypoxicischemic encephalopathy，HIE）新生兒，以確定反應(yīng)預(yù)后的生物標志物。一維核磁共振波譜成像顯示，與對照組相比，圍產(chǎn)期窒息和HIE 嬰兒臍血中與能量相關(guān)的代謝物發(fā)生了顯著變化[28]。嚴重HIE 病例的代謝物中琥珀酸和甘油增加，酮類、丙酮和3- 羥基丁酸減少。酮類的減少和琥珀酸的增加可能意味著新生兒能量的不斷消耗和向無氧代謝的轉(zhuǎn)變。高危新生兒臍帶血的代謝組分析顯示，與對照組新生兒相比，高危新生兒臍帶血中膽堿、脯氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、葡萄糖的水平較低，苯丙氨酸和瓜氨酸的水平較高[29]。同樣，在低出生體重的新生兒中，通過檢測臍帶血中苯丙氨酸和色氨酸等必需氨基酸的水平能夠準確區(qū)分胎兒生長受限和正常生長的胎兒[30]。HIE 的病理生理機制是多因素且十分復(fù)雜的，代謝組學(xué)是對代謝物的系統(tǒng)評價，提供了其相互作用的證據(jù)。由于缺氧會抑制有氧能量代謝，而有氧能量代謝是全身代謝的核心，因此代謝組學(xué)為發(fā)現(xiàn)HIE 的生物標志物和疾病的發(fā)病機制提供了強大的系統(tǒng)生物學(xué)方法。近些年的幾項研究已經(jīng)使用代謝組學(xué)來評估動物模型的圍產(chǎn)期窒息，但缺乏將代謝圖譜與圍產(chǎn)期窒息和HIE 的分子病理學(xué)知識結(jié)合起來的人體研究。當前，對代謝組學(xué)生物標志物的研究有助于進一步深入了解腦癱的復(fù)雜病理生理學(xué)，同時確定腦癱的預(yù)測性生物標志物。

2 小結(jié)

腦癱是我國兒童肢體殘疾的主要致病因素之一。大量研究已經(jīng)表明通過早期干預(yù)及治療能夠改善腦癱兒童及腦癱高風(fēng)險狀態(tài)兒童的預(yù)后，因此腦癱的早期診斷和干預(yù)至關(guān)重要。生物標志物檢測是臨床診斷早期腦癱的方法之一，但目前國內(nèi)有關(guān)生物標志物的研究較少，尤其是腦癱領(lǐng)域用于早期預(yù)測/ 診斷的生物標志物仍有待研究和明確。在國外，關(guān)于腦癱生物標志物的研究逐漸成為熱點，陸續(xù)有相關(guān)生物標志物發(fā)現(xiàn)的報道。但現(xiàn)在由于研究尚在試驗進展階段，同時缺乏大樣本量的試驗數(shù)據(jù)，以及臨床手段的局限等，目前可用于臨床實踐的生物標志物很少。隨著對腦癱和相關(guān)生物標志物的進一步認識，相信未來會出現(xiàn)更多、更大樣本量的試驗，使腦癱生物標志物真正應(yīng)用于臨床。本文總結(jié)了目前已有的關(guān)于腦癱生物標志物的知識和文獻，希望未來在研究人員的持續(xù)努力下，我們能對這種復(fù)雜的疾病有更多的了解，給予腦癱兒童及腦癱高風(fēng)險狀態(tài)兒童早期診斷和干預(yù)，充分利用生物標志物的作用，使患兒獲得更好的預(yù)后，為患兒、患兒家庭乃至社會帶去更多的福音。