袁軼群，魏龍，方寧寧

1.生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師醫(yī)院病理科，新疆 阿克蘇 843000；2.生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科一區(qū)，新疆 阿克蘇 843000；3.生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師阿拉爾醫(yī)院，新疆 阿拉爾 843300

肺癌是我國(guó)發(fā)病和死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤，肺腺癌是肺癌主要的病理亞型之一[1]，大部分患者確診時(shí)已處于疾病的中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，而傳統(tǒng)的治療方法如放化療和姑息治療等預(yù)后差，因此，靶向治療和免疫治療成為目前關(guān)注的焦點(diǎn)。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外關(guān)于肺癌研究的熱點(diǎn)大多是通過(guò)靶向治療，以此來(lái)改善癥狀和延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，程序性死亡配體1 (programmed death ligand 1，PD-L1)在腫瘤的免疫逃逸中扮演著極為重要的角色，PD-L1可以誘導(dǎo)性地表達(dá)在活化T 細(xì)胞、B 細(xì)胞以及單核細(xì)胞上，在肺癌、乳癌、胃癌、食管癌等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，除了抑制T 細(xì)胞的增殖外，還可以明顯減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而參與腫瘤的免疫逃逸功能[4-6]。還有研究認(rèn)為，PD-L1 高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者中，其腫瘤組織中的細(xì)胞增殖核相關(guān)抗原(Ki-67)表達(dá)水平也較高[7]。目前關(guān)于Ki-67 的研究多是回顧性小樣本研究，且關(guān)于Ki-67 設(shè)定的閾值不同，其結(jié)果也不盡相同，因此對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后也沒(méi)有明確的結(jié)論[8]。

目前，有關(guān)肺腺癌患者中PD-L1 與Ki-67 表達(dá)的相關(guān)性及聯(lián)合預(yù)測(cè)患者預(yù)后的研究較少。因此，本研究旨在檢測(cè)肺腺癌患者中PD-L1與Ki-67 14%和50%的表達(dá)閾值之間的相關(guān)性，探討PD-L1 聯(lián)合不同閾值的Ki-67對(duì)肺腺癌患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月至2022 年5 月在生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除或纖維支氣管鏡活檢、經(jīng)皮肺穿刺、胸水細(xì)胞蠟塊等方法獲取，并經(jīng)病理組織學(xué)明確診斷為肺腺癌的146 例標(biāo)本。其中男性61 例，女性85 例；年齡32~86 歲，平均(63.15±6.58)歲。根據(jù)2017 年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8 版肺癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期17 例，Ⅱ期20 例，Ⅲ期42 例，Ⅳ期67 例。為排除標(biāo)本的選擇偏倚，在收集標(biāo)本時(shí)，剔除臨床上不能完全證明腫瘤的原發(fā)部位在肺部的病例。所有病例術(shù)前均無(wú)放化療。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)PD-L1 (克隆號(hào)：22C3，Dako 平臺(tái))和Ki-67 (克隆號(hào)：MIBI)的表達(dá)?？贵w均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，運(yùn)用羅氏全自動(dòng)免疫組化機(jī)器(Ventana Benchmark GX)。由經(jīng)過(guò)系統(tǒng)培訓(xùn)的兩名高年資病理科醫(yī)師對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估和復(fù)核。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) PD-L1 陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞膜上，對(duì)鏡下完全膜染色的腫瘤細(xì)胞或任何強(qiáng)度染色的腫瘤細(xì)胞占標(biāo)本中所有腫瘤細(xì)胞的百分比(TPS)<1%，作為陰性表達(dá)，TPS≥1%作為陽(yáng)性表達(dá)。Ki67 陽(yáng)性表達(dá)為核著色，呈棕黃色。高倍鏡下取5 個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)癌細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞，按照染色的強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例進(jìn)行評(píng)定，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)分別選擇了Ki-67 14%和50%的表達(dá)值作為閾值節(jié)點(diǎn)[9]；任何可檢測(cè)的Ki-67核染色(點(diǎn)狀或彌散)均為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson 相關(guān)分析PD-L1 和Ki-67 的相關(guān)性，單因素生存分析采用Log-rank χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織中PD-L1與Ki-67蛋白的表達(dá)水平 選取具有代表性的染色圖片3 張，從圖片中可以觀(guān)察到PD-L1 蛋白均在細(xì)胞膜上表達(dá)，Ki-67 蛋白均在細(xì)胞核里表達(dá)，均呈灶狀、片狀或彌漫性分布，見(jiàn)圖1、圖2和圖3。

圖1 PD-L1在肺腺癌表達(dá)(SP×200)Figure 1 Expression of PD-L1 in lung adenocarcinoma(SP×200)

圖2 肺腺癌Ki-67高表達(dá)(SP×200)Figure 2 High expression of Ki-67 in lung adenocarcinoma(SP×200)

圖3 肺腺癌Ki-67低表達(dá)(SP×200)Figure 3 Low expression of Ki-67 in lung adenocarcinoma(SP×200)

2.2 不同臨床特征肺腺癌患者PD-L1和Ki-67蛋白陽(yáng)性率比較 PD-L1 和Ki-67 蛋白在肺腺癌組織中均呈陽(yáng)性表達(dá)。PD-L1 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為38.36%(56/146)，與患者的性別、族別、是否吸煙、組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化、組織來(lái)源等均無(wú)關(guān)(P>0.05)。Ki-67 表達(dá)≥14%的陽(yáng)性率為80.82%(118/146)，與是否吸煙、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。Ki-67 表達(dá)≥50%的陽(yáng)性率為30.82%(45/146)，與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 PD-L1、Ki-67蛋白的表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]Table 1 Relationship between PD-L1,Ki-67 protein expression and clinicopathological features of lung adenocarcinoma[n(%)]

2.3 肺腺癌中PD-L1 與Ki-67 蛋白表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，Ki-67≥14%與PD-L1 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.205，P<0.05)，Ki-67≥50%與PD-L1 表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.023，P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 肺腺癌中PD-L1與Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性Table 2 Correlation of expression of PD-L1 and Ki-67 proteins in lung adenocarcinoma

2.4 PD-L1、Ki-67 蛋白表達(dá)對(duì)肺腺癌患者預(yù)后的影響 146例肺腺癌患者中，失訪(fǎng)13例，死亡73例。PD-L1 陽(yáng)性患者的中位生存期為18.5 個(gè)月，PD-L1 陰性患者為21.9 個(gè)月，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.455，P<0.05)。Ki-67 表達(dá)≥14%的患者中位生存期與Ki-67 表達(dá)<14%的患者比較(20.7 個(gè)月vs 20.3 個(gè)月)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.007，P>0.05)，而Ki-67 表達(dá)≥50%的患者中位生存期與Ki-67 表達(dá)<50%的患者相比較(18.6 個(gè)月vs 21.4 個(gè)月)，其前者的生存率明顯低于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.265，P<0.05)，見(jiàn)圖4、圖5和圖6。

圖4 PD-L1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Figure 4 Relationship between PD-L1 and prognosis

圖5 Ki-67 14%表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Figure 5 Relationship between Ki-67 14%expression and prognosis

圖6 Ki-67 50%表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Figure 6 Relationship between Ki-67 50%expression and prognosis

3 討論

PD-L1 屬于一種跨膜糖蛋白，在異常狀態(tài)下與其受體PD-1 相結(jié)合，可以抑制免疫T 淋巴細(xì)胞的活化與增殖，其結(jié)果使T 淋巴細(xì)胞失去活性，最終出現(xiàn)腫瘤的免疫逃逸現(xiàn)象，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6，10]。Ki-67 屬于一種非組蛋白性核抗原，在G0期以外的整個(gè)細(xì)胞增殖周期中都可以產(chǎn)生表達(dá)，特別對(duì)蛋白酶敏感性極高，其蛋白水平的輕微變化就會(huì)導(dǎo)致信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，已知在大多數(shù)進(jìn)展期的惡性腫瘤中，Ki-67均呈高表達(dá)，其與腫瘤的增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生存期等密切相關(guān)[11-12]。

PD-L1 在非小細(xì)胞肺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為20%~70%[13]，而且其表達(dá)率的高低與陽(yáng)性設(shè)置值，甚至組織的來(lái)源和用于檢測(cè)的抗體等均有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)PD-L1陽(yáng)性率為38.36% (56/146)，與其陽(yáng)性表達(dá)率基本一致。同時(shí)，既往指南和文獻(xiàn)中對(duì)Ki-67 表達(dá)閾值的高低分組標(biāo)準(zhǔn)并不完全統(tǒng)一，也無(wú)法通過(guò)具體的閾值來(lái)進(jìn)行分組和鑒定，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)范銀星等[9]的研究結(jié)果為參考，分別以14%和50%為界對(duì)Ki-67 的表達(dá)進(jìn)行了分組，分組后的結(jié)果表明Ki-67 表達(dá)≥14%的為80.82% (118/146)，Ki-67 表達(dá)≥50%的為30.82% (45/146)，與其結(jié)果趨于一致。

王珊等[14]的研究結(jié)果表明，PD-L1 的表達(dá)與患者的性別、是否吸煙、組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和分化等均無(wú)關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果相一致，即PD-L1的表達(dá)與肺腺癌患者的臨床病理特征無(wú)相關(guān)性。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，無(wú)論是Ki-67 表達(dá)≥14%還是Ki-67 表達(dá)≥50%的患者，其表達(dá)結(jié)果與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和分期均有關(guān)，這與Wei等[15]的研究結(jié)果相吻合，說(shuō)明Ki-67與患者的預(yù)后可能存在一定的聯(lián)系。

Takada等[7]發(fā)現(xiàn)，鱗癌中Ki-67在PD-L1陰性組的表達(dá)顯著低于PD-L1 陽(yáng)性組，且PET CT 掃描的最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值也是與PD-L1 陽(yáng)性率呈正性相關(guān)的。因此，本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)Ki-67 14%閾值和Ki-67 50%閾值與PD-Ll 做了相關(guān)性比較，結(jié)果表明，Ki-67 14%閾值與PD-Ll 存在明顯正性相關(guān)(r=0.205，P<0.05)，但與Ki-67 50%閾值無(wú)正性相關(guān)(r=0.023，P>0.05)。這可能與本實(shí)驗(yàn)隨訪(fǎng)時(shí)間過(guò)短、研究病例較少有關(guān)，后期需加大標(biāo)本量及延長(zhǎng)隨訪(fǎng)時(shí)間，有助于制定一個(gè)對(duì)治療和預(yù)后有價(jià)值的Ki-67閾值。當(dāng)然，也有不同的觀(guān)點(diǎn)，Shimoji 等[13]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺腺癌中PD-L1 的表達(dá)與高細(xì)胞增殖活性相關(guān)，鱗癌中并未發(fā)現(xiàn)Ki-67 與PD-Ll的相關(guān)性。

除此之外，Ki-67和PD-L1的表達(dá)是否與患者的預(yù)后相關(guān)呢？Reck 等[16]的研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)作用。范銀星等[9]也認(rèn)為，非小細(xì)胞肺癌患者的組織中Ki-67 和PD-L1 均為患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因子，且認(rèn)為Ki-67 14%與PD-Ll 為兩者聯(lián)合應(yīng)用的閾值點(diǎn)，兩者的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后不良具有“疊加效應(yīng)”。而且既往指南和文獻(xiàn)中也沒(méi)有明確制定Ki-67表達(dá)的閾值來(lái)判斷患者的治療和預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，PD-L1 陽(yáng)性患者的中位生存時(shí)間為18.5 個(gè)月，低于PD-L1 陰性患者的21.9 個(gè)月，說(shuō)明PD-L1 的表達(dá)與患者的預(yù)后有關(guān)。Ki-67 表達(dá)≥14%的患者中位生存期與Ki-67表達(dá)<14%的患者相比較，其生存期相當(dāng)，但Ki-67表達(dá)≥50%的患者中位生存期明顯短于Ki-67 表達(dá)<50%的患者，說(shuō)明Ki-67 表達(dá)得越高，且高于50%時(shí)，其預(yù)后也更差。因此，Ki-67 50%閾值點(diǎn)聯(lián)合PD-L1 的表達(dá)可能對(duì)肺腺癌患者生存率和生存期的評(píng)估具有一定的臨床指導(dǎo)意義。