黃佳怡，張文鍵，高蕾，劉玲瓏

福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122

肝癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，每年約有90 萬新發(fā)病例和83 萬死亡病例[1]。肝癌發(fā)病隱匿,多數(shù)患者癌癥早期未有明顯的臨床癥狀，但癌癥進展迅猛，手術或藥物等治療效果均不佳，預后生存時間較短[2]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是復雜的過程，涉及本體基因、體細胞突變、基因組不穩(wěn)定和微環(huán)境等眾多因素的共同參與[3-4]。隨著對肝癌研究的不斷深入，目前臨床上肝癌的治療主要以手術、放化療和靶向藥物綜合治療，但肝癌晚期患者預后仍然較差，因此迫切需要開展對肝癌包括發(fā)病機制及治療靶點等的不斷深入研究[5]。腫瘤微環(huán)境(TME)是指包括腫瘤細胞、免疫細胞、基質(zhì)成分等，在腫瘤生長發(fā)揮重要的作用，與腫瘤的亞型和分級密切相關[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤微環(huán)境免疫相關基因，可直接減緩腫瘤的生長。30%的早期肝癌患者可檢測到免疫相關基因的表達升高，但25%患者未檢測到明顯的變化[8]。因此，腫瘤微環(huán)境相關基因的表達與腫瘤中免疫反應或免疫細胞等成分密切相關。對肝癌微環(huán)境相關基因做進一步的研究，將有助于推進相關靶向藥物的研發(fā)和肝癌的臨床治療。本研究通過結(jié)合TCGA 數(shù)據(jù)庫中肝癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和ESTIMATE免疫/基質(zhì)評分，挖掘與肝癌臨床診斷和預后密切相關的腫瘤微環(huán)境相關基因。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和差異表達基因篩選 本實驗從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載369 例肝癌腫瘤樣本(Illumina HiSeq 2000 RNA 測序平臺)RNA表達譜數(shù)據(jù)和369 例患者相應的臨床信息，包括年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤分期、生存時間和生存狀態(tài)。采用R 語言(3.5.3 版本)ESTIMATE 包[9]分析腫瘤微環(huán)境的基質(zhì)評分和免疫評分。依據(jù)基質(zhì)評分和免疫評分的中位值，分別分為高分組和低分組。用Limma包進行分析并篩選高、低分基質(zhì)(或免疫)組之間的差異表達基因(DEGs)(篩選標準：|log2FC|≥1且校正P值<0.05)。

1.2 差異表達基因GO 和KEGG 分析 通過Cluster Profiler 包對DEGs 進行GO 和KEGG 富集分析，利用GO 分析了解DEGs 主要參與的細胞成分(BP)、分子功能(CC)生物過程(MF)生物學過程，利用KEGG 分析了解DEGs 主要參與的信號通路(P<0.05時為差異有統(tǒng)計學意義)。

1.3 PPI 網(wǎng)絡構建 利用STRING 網(wǎng)站(version 11.0; https://string-db.org/)構建基因-基因之間互作網(wǎng)絡關系網(wǎng)，并用Cytoscape 3.5.1 做網(wǎng)絡可視化顯示。采用Cytoscape 中MCODE(分子復合物檢測)插件，通過拓撲原理分析尋找節(jié)點在10 及以上的連接密集網(wǎng)絡并選定為重要模塊，并取模塊基因做后續(xù)分析。

1.4 模塊基因臨床價值的綜合分析 利用GEPIA 網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)[10]，以肝癌基因表達中位數(shù)將患者分為高、低表達兩組，比較兩組患者的生存率。分析模塊基因與患者生存時間的關系，篩選與肝癌患者預后顯著相關的基因；分析模塊基因與肝癌分期直接的相關關系。以肝癌數(shù)據(jù)集GSE94660作為驗證數(shù)據(jù)集(下載自GEO數(shù)據(jù)庫)，數(shù)據(jù)集為21例肝癌及其癌旁正常肝臟組織的RNA-seq數(shù)據(jù)。篩選出與肝癌預后相關且肝癌中高表達的核心基因。TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是對TCGA 中32 種癌癥腫瘤中不同淋巴細胞浸潤情況與基因表達量之間相關性做系統(tǒng)分析的在線分析平臺。利用TIMER數(shù)據(jù)庫分析核心基因表達水平與不同腫瘤浸潤淋巴細胞水平(包括腫瘤純度、中性粒細胞、巨噬細胞、B細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞和DC 細胞)之間的相關關系。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用R3.5.3 軟件、Graph Pad 7.0 軟件、Adobe illustrator 軟件進行統(tǒng)計分析及圖表繪制和排版。組間差異采用Student's t 檢驗，生存曲線(又稱Kaplan-Meier 曲線)分析患者生存狀況，采用Log-rank檢驗分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌基質(zhì)、免疫評分與病理特性及生存關系 從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載369 例肝癌患者的基因表達和臨床數(shù)據(jù)，其中女性121 例(32.5%)，男性248 例(67.47%)。ESTIMATE 評分顯示肝癌患者的基質(zhì)評分為-1 625.26~1 171.56 分，免疫評分為-866.23~3 146.39分。隨著肝癌分級的增加，基質(zhì)評分呈下降趨勢(圖1A，P=0.01)，免疫評分呈升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(圖1B)，且肝癌分期與基質(zhì)和免疫評分無明顯相關(圖1C、1D)。高基質(zhì)評分組和高免疫評分組具有更高的總生存率，差異具有統(tǒng)計學意義(圖1E、1F)。

圖1 肝癌免疫和基質(zhì)評分與病理特點及生存預后之間的關系Figure 1 Relationship between immune/stromal scores and pathological characteristics,survival prognosis in HCC

2.2 篩選與基質(zhì)、免疫評分相關的差異表達基因 高低基質(zhì)(或免疫)評分組之間的DEG 見圖2A、2B。高低基質(zhì)評分組之間的差異基因有690個為上調(diào)基因和25個下調(diào)基因。高低免疫評分組之間的差異基因有539個上調(diào)基因和25個下調(diào)基因。韋恩分析發(fā)現(xiàn)高低基質(zhì)評分和免疫評分組之間的DEGs中有329 個共同的DEGs，其中321個為上調(diào)基因，8個為下調(diào)基因(圖2 C、2D)。并對共同的DEGs做進一步的分析。

圖2 基于肝癌ESTIMATE評分基礎上DEGs熱圖和韋恩圖Figure 2 Difference gene expression(DEGs)in HCC based on ESTIMATE algorithm score

2.3 DEGs參與的生物過程及通路分析 對329個DEGs進行GO分析，發(fā)現(xiàn)其參與眾多免疫相關生物過程如免疫細胞的激活、免疫反應和調(diào)節(jié)、趨化因子結(jié)合、C-C 趨化因子結(jié)合和活化等(圖3A)。KEGG 通路富集分析顯示細胞因子-細胞因子受體的相互作用、病毒蛋白與細胞因子的相互作用以及細胞因子受體的相互作用是高度富集的三條通路(圖3B)。

圖3 DEGs功能富集分析Figure 3 Significance enrichment of common DEGs in HCC

2.4 PPI網(wǎng)絡構建及模塊分析 利用STRING構建329 個DEGs 之間的PPI 網(wǎng)絡，并利用Cytoscape 中MCODE 插件進一步構建功能模塊，篩選得三個功能模塊。依據(jù)其核心的節(jié)點分別命名為CCR7 模塊、IL10模塊和CD19 模塊。CCR7模塊(圖4A)有19個節(jié)點和171 條邊，相應的基因分別為CCR7、ADRA2A、CCL19、CCR2、CCR4、CCR5、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR6、FPR1、GNG8、GPR18、LPAR1、LPAR5、P2RY12、P2RY13、PNOC 和S1PR4。IL10 模塊(圖4B)有14 個節(jié)點和61條邊，相應的基因分別為IL10、CCL11、CCL22、CD13、CD1B、CD1C、CD40LG、CD69、CD80、IL2RA、IL6、IRF4、TLR7和TLR8。CD19模塊(圖4C)有21個節(jié)點和53 條邊，相應的基因分別為CD19、BTK、BTLA、CD22、CR2、CYSLTR1、GPR132、GPR174、GPR65、GPR68、ICOS、IL21R、IL7R、LY75、PDCD1LG2、PLD4、PTPN22、SLAMF1、TNFRSF8、TRAF3IP2 和XCR1。通過對這些模塊基因進一步功能分析發(fā)現(xiàn)，其參與的通路大部分與免疫反應和細胞因子受體相關。GO富集分析發(fā)現(xiàn)其主要生物過程為鈣離子穩(wěn)態(tài)、細胞調(diào)節(jié)、受體活性和趨化因子結(jié)合(圖5A)。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)其主要信號通路為細胞因子-細胞因子受體相互作用和趨化因子信號通路(圖5B)。

圖4 DEGs基因之間PPI網(wǎng)絡圖中CCR7模塊、IL10模塊、CD19模塊Figure 4 CCR7 module,IL10 module,and CD19 module in the PPI network between DEGs genes

圖5 模塊基因功能附近富集分析Figure 5 GO term and KEGG pathway analysis for 3 module DEGs in HCC

2.5 模塊基因在肝癌臨床診斷和預后中的價值 通過GEPIA 分析模塊基因與肝癌患者預后的關系，采用Log-rank檢驗分析54個模塊基因與患者總生存時間(OS)相關關系，并進一步利用GSE94660 數(shù)據(jù)集分析模塊基因在肝癌腫瘤組織和癌旁組織中的表達情況，結(jié)果顯示腫瘤樣本中CCR5、CCR7、GPR18、IL7R、SLAMF1、TRAF3IP3、CD69、XCR1 基因mRNA 高表達患者有較好的預后，具有顯著的相關性(圖6，P<0.05)，且CCR5、SLAMF1 和TRAF3IP3 的在肝癌中的表達明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(圖7，P<0.05)。CCR5、SLAMF1和TRAF3IP3為肝癌微環(huán)境相關且可用于臨床診斷與預后的核心基因。

圖6 篩選出的8個與肝癌臨床OS密切相關的基因Figure 6 Survival analysis of 8 key genes for hepatocellular carcinoma

圖7 GSE94660數(shù)據(jù)集驗證8個基因在肝癌和癌旁組織中的表達情況Figure 7 Expression of 8 genes in HCC and paracancerous tissues verified by GSE94660 dataset

2.6 核心基因與免疫浸潤細胞的相關性 TIMER分析發(fā)現(xiàn)，CCR5、SLAMF1 和TRAF3IP3 基因與腫瘤純度均呈負相關關系，CCR5 與肝癌中除CD4+T 細胞外的其他免疫浸潤細胞含量之間呈正相關關系，SLAMF1 與肝癌中除中性粒細胞外的其他免疫浸潤細胞含量之間呈正相關關系，TRAF3IP3 和腫瘤中除中性粒細胞外的其他免疫浸潤細胞含量之間呈正相關關系(圖8)。

圖8 CCR5、SLAMF1和TRAF3IP3基因與肝癌中免疫浸潤細胞的相關性Figure 8 Correlation between CCR5,SLAMF1,TRAF3IP3 genes and immune infiltrating cells in HCC

3 討論

肝癌發(fā)病過程涉及環(huán)境、基因變異等多因素和多信號通路等的共同調(diào)控，疾病早期不易發(fā)現(xiàn)，但病程進展快速，死亡率逐年攀升，因此早期診斷標志物和分子靶點等的研究迫在眉睫，將為后續(xù)肝癌的新藥研發(fā)及臨床運用帶來新希望。近年來在腫瘤微環(huán)境的研究中發(fā)現(xiàn)非腫瘤成分在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，腫瘤微環(huán)境中免疫/基質(zhì)成分是動態(tài)變化的，這些細微的改變往往預示著患者在抗癌治療、復發(fā)與耐藥等方面的不同反應，與腫瘤患者預后息息相關。ESTIMATE 算法基于免疫相關基因的表達情況計算出腫瘤組織的免疫評分和基質(zhì)評分，并在前列腺癌[11]、膠質(zhì)母細胞瘤[12]和結(jié)腸癌[13]的研究中發(fā)現(xiàn)患者的預后與ESTIMATE評分密切相關。

本研究中對比高、低免疫(基質(zhì))評分肝癌患者的生存期發(fā)現(xiàn)，高免疫和高基質(zhì)評分組的肝癌患者總生存率明顯高于低評分組的患者，且與患者腫瘤的等級或分期無關。通過比較高、低免疫(基質(zhì))評分肝癌樣本的基因表達譜，篩選出329 個與肝癌基質(zhì)和免疫相關的差異表達基因(DEGs)。進一步GO 功能富集分析顯示，DEGs 在免疫細胞反應和基質(zhì)相互作用的生物過程上富集，主要富集的生物過程是T 細胞活化、淋巴細胞的調(diào)節(jié)活化和淋巴細胞分化。KEGG 信號通路主要在免疫和炎癥反應相關的通路上富集，其中前3位通路分別是細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、病毒蛋白-細胞因子和細胞因子受體的相互作用。GO和KEGG富集分析結(jié)果均提示DEGs主要參與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞和免疫反應等過程。

腫瘤微環(huán)境中，多種免疫細胞與腫瘤細胞互相作用，調(diào)節(jié)腫瘤生長和對腫瘤治療如對靶向藥物的反應性[14]。Sia等[8]研究中發(fā)現(xiàn)約25%的肝癌組織表達炎癥反應標志物如PD-1 和PD-L1 分子并檢測到IFN-γ信號通路的激活，這些腫瘤組織中的自身免疫反應過程與臨床中免疫治療過程相似，減緩或抑制腫瘤生長，患者的預后較好。這些研究結(jié)果均表明，微環(huán)境與腫瘤生長密切相關，對其相關基因的深入研究具有重要的意義。本研究對329 個腫瘤微環(huán)境相關DEGs 的PPI網(wǎng)絡進一步分析，構建3個重要模塊，并對54個模塊基因進行功能富集分析，結(jié)果顯示這些基因主要在趨化因子受體和細胞因子受體結(jié)合和活性相關的通路上富集。同時利用GSE94660數(shù)據(jù)集和TCGA患者生存數(shù)據(jù)分析54 個模塊基因表達與患者生存以及在肝癌和癌旁中的表達情況，最終篩選出CCR5、SLAMF1 和TRAF3IP3 三個關鍵基因，這三個關鍵基因不僅與患者預后密切相關，且在癌中的表達量明顯高于癌旁組織。

G蛋白偶聯(lián)受體5(CCR5)是趨化因子受體，主要在淋巴細胞上表達，激活肝細胞纖維化促進纖維化進展[15-16]。抑制CCR5的表達，可明顯改善非酒精性肝炎和肝纖維化患者肝纖維程度[17]。本研究中發(fā)現(xiàn)CCR5的表達與肝癌的免疫和基質(zhì)評分密切相關，進一步研究發(fā)現(xiàn)CCR5 的表達與腫瘤中巨噬細胞、CD8+細胞、DC細胞密切相關。信號淋巴細胞激活分子家族成員(SLAMF1)編碼CD150 的糖蛋白細胞表明受體，CD150表達于不同類型的免疫細胞上如活化的T淋巴細胞、B 淋巴細胞、樹突細胞和單核細胞等，且參與體液免疫的調(diào)節(jié)[18-19]。SLAMF1 參與T 細胞和抗炎呈遞細胞(APC)直接的細胞粘附和信號傳導，如T細胞與B細胞的共刺激作用[20]。研究也發(fā)現(xiàn)，SLAMF1 也參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，參與惡性血液系統(tǒng)疾病如慢性淋巴細胞白血病和原發(fā)性縱膈B細胞淋巴瘤的發(fā)展，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤中也檢測到SLMAF1 編碼的CD150 高表達。我們的研究發(fā)現(xiàn)，SLAMF1 在肝癌中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，這與腫瘤浸潤淋巴細胞如巨噬細胞、B 細胞、T 細胞、DC 細胞的浸潤水平呈正相關，且SLAMF1 高表達組患者預后良好。TRAF3 相互作用蛋白3(TRAF3IP3)又名T3JAM，早期研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤壞死因子相關因子3(TRAF3)特異性結(jié)合激活腎細胞中JNK 通路。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其表達于多種免疫細胞，如NK細胞、B淋巴細胞和T淋巴細胞，并參與調(diào)節(jié)免疫細胞的分化和成熟[21-22]。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TRAF3IP3 的表達與腫瘤血管形成有顯著的相關性[23]。在黑色素瘤中TRAF3IP3 基因過表達具有致瘤性[24]。這與本研究一致，在肝癌中TRAF3IP3 在肝癌中高表達，且TRAF3IP3 與腫瘤中相關浸潤淋巴細胞如T 細胞、B 細胞、DC 細胞具有明顯的相關性。研究中發(fā)現(xiàn)CCR5、SLAMF1、TRAF3IP3 基因在肝癌中高表達，且與肝癌微環(huán)境中浸潤淋巴細胞、患者預后具有顯著的相關關系，推測這些基因可能參與肝癌微環(huán)境中免疫系統(tǒng)如免疫細胞等的激活和調(diào)節(jié)，但其在肝癌腫瘤微環(huán)境的具體作用機制尚未明確，進一步的研究將對肝癌的診斷及治療具有一定的意義。

綜上所述，本研究結(jié)合ESTIMATE 評分和生物信息學分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出腫瘤微環(huán)境相關的基因CCR5、SLAMF1、TRAF3IP3 與肝癌預后和診斷顯著相關，有望作為潛在的肝癌免疫治療的新靶標，為肝癌患者治療帶來新的可能。本研究主要通過TCGA 數(shù)據(jù)來分析關鍵基因與腫瘤預后和免疫浸潤等的關系，后續(xù)將在腫瘤樣本中開展進一步的實驗研究。