陳輝，趙春水，張春偉，劉欣

缺血性腦梗死（ischemic cerebral infarction，ICI）是常見的腦血管疾病，致死率、病死率均較高，且發(fā)病率逐漸升高［1］。目前超早期溶栓是治療ICI的最佳方式，但其受治療時間窗限制，且易并發(fā)腦出血，臨床應(yīng)用受到限制［2］。因此，探尋更為有效的ICI治療方式備受關(guān)注，而基因治療被認(rèn)為是該病有希望的治療途徑之一。ICI的治療原則在于保護(hù)缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞，減少其凋亡，以盡早恢復(fù)缺血區(qū)域供血，挽救瀕死腦組織，故基因抗凋亡成為ICI實(shí)驗(yàn)研究熱點(diǎn)之一［3］。微RNA（miRNA/miR）是由18～25個核苷酸構(gòu)成的內(nèi)源性非編碼RNA，其不編碼蛋白質(zhì)，通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后水平參與蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)mRNA降解或抑制蛋白翻譯過程。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如ICI中發(fā)揮著重要作用［4］。有學(xué)者指出，miR-24在急性腦梗死病人中低表達(dá)，且可作為該病進(jìn)展的生物標(biāo)志物，為ICI基因治療提供了思路［5］。2020年1月至2022年1月，本研究通過建立ICI大鼠模型，分析miR-24過表達(dá)對其腦保護(hù)作用及對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 45只SPF級SD雄性大鼠，6周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2018-0010，動物使用許可證號：SYXK（豫）2020-0002。自由進(jìn)食、飲水，溫度22～26 ℃，12 h/12 h明暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究符合一般動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.1.2 主要試劑和儀器 含有miR-24激動劑miR-24 agomir、miR-24抑制劑miR-24 antagomir、陰性對照（negative control，NC）序列的pcDNA 3.0質(zhì)粒（蘇州吉瑪基因股份有限公司）；SYBR Green熒光定量染料法試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；2% TTC染色液（上海信帆生物科技有限公司）；兔抗鼠神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei antigen，NeuN）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）一抗（美國Abcam公司）。

StepOne Puls實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；Synergy-HD顯微鏡（日本Toshiba公司）；Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳（美國伯樂公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及立體定向注射 45只大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為健康組（8只）、腦梗死組（9只）、腦梗死過表達(dá)組（9只）、腦梗死低表達(dá)組（9只）、腦梗死NC組（10只）。選取接近腦缺血半暗帶皮質(zhì)位置、距離腦梗死內(nèi)緣0.5～1.0 mm處注射。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將其固定于立體定向儀上，消毒腦部頂部皮膚并清除毛發(fā)，在兩耳中點(diǎn)向后3 cm切口，逐層分離皮下組織，暴露前囟、矢狀縫、右側(cè)顱骨表面，選取兩個注射點(diǎn)，注射點(diǎn)1：前囟前1.7 mm，矢狀縫右側(cè)3.8 mm，深2.8 mm。注射點(diǎn)2：前囟后3.3 mm，矢狀縫右側(cè)3.8 mm，深2.3 mm。用胰島素針吸取腺病毒，在腦梗死過表達(dá)組、腦梗死低表達(dá)組、腦梗死NC組兩個注射點(diǎn)分別注射miR-24 agomir、miR-24 antagomir和miR-24陰性對照序列，注射速度1 μL/min，總量10 μL。注射完成后撤出針頭，采用骨蠟將顱骨孔道封閉，縫合頭皮。健康組與腦梗死組同法、同位置、同量注射生理鹽水。

1.2.2 模型建立［6］立體定向注射后24 h采用改良Longa線栓法建立ICI模型。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，鈍性分離右側(cè)頸部肌群，分離、結(jié)扎右頸總動脈、頸外動脈與分支。距離頸總動脈1 cm位置采用1 mL注射液針頭將右頸總動脈上壁分離刺破，將尼龍線從頸總動脈插入內(nèi)動脈，感受到阻力停止，深度18～20 mm，線栓即到達(dá)并阻塞大腦中動脈開口處，扎緊動脈殘端，常規(guī)縫合、消毒。健康組將阻塞線插入頸內(nèi)動脈深度約5 mm，其余步驟同上。大鼠清醒后單籠飼養(yǎng)，采用Zea-longa神經(jīng)功能評價方法評價神經(jīng)功能，評分范圍為0～4分，1、2、3分提示建模成功，0、4分剔除。最終各組均納入8只。建模成功后1、3 d采用Zea-longa神經(jīng)功能評價方法評價大鼠神經(jīng)功能。

1.2.3 組織取材 神經(jīng)功能評價完成后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剪開胸廓，鑷子輕固定心臟，輸液針頭插進(jìn)左心室，剪開右心房，迅速推注多聚甲醛至大鼠右心房流出無色液體。脫頸處死，剝離顱骨，將腦組織迅速取出，清除血污，4只置于冰上用于TTC染色；4只取腦組織中動脈供血區(qū)域，分成2份，1份保存于液氮中，1份固定于4%多聚甲醛中。

1.2.4 qRT-PCR檢測腦組織miR-24 mRNA表達(dá)取液氮保存腦組織，轉(zhuǎn)錄得互補(bǔ)DNA（cDNA），鑒定后試劑盒說明書要求設(shè)定反應(yīng)體系（總反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green Mix 11 μL，正、反向引物各1 μL，DNA模板1.0 μL，雙蒸水7.0 μL）及反應(yīng)條件（95 ℃35 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），重復(fù)40次，72 ℃延伸4 min。以U6為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計算。實(shí)驗(yàn)所用引物：miR-24正向：5′-TGACGCTTACGTGAACTCCACCAC-3′，反向：5′-GTACCACGCTGCACGGACGTGCAC-3′；U6正向：5′-GTGCACGCACGTGTGTCCAACCAC-3′，反向：5′-GTGCACCTACCACGCACGTGCTGC-3′。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 TTC染色法檢測腦梗死體積 取冰上保存腦組織，-20 ℃中存放30 min取出，沿冠狀面從前腦額部向后連續(xù)切成2 mm薄片，迅速置入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶液中（含2% TTC染色液），37 ℃避光孵育30 min，每5分鐘輕晃1次容器，4%多聚甲醛固定12 h，取出后PBS充分洗滌，拍照后經(jīng)Image Pro Plus 6.0分析圖像。正常腦組織為鮮紅色，梗死灶為蒼白色。測量每片梗死面積、總面積，梗死體積=層厚×梗死面積乘積，總梗死體積為各層梗死體積之和。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色檢測腦皮質(zhì)NeuN表達(dá)取4%多聚甲醛固定的腦組織，病理切片機(jī)切成厚度5 μm切片；二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中脫蠟10 min；3%H2O2溶液溫箱中孵育25 min使內(nèi)源性酶失活，PBS緩沖液沖洗；常溫孵育微波修復(fù)抗原，冷卻后5%胎牛血清封閉，加入兔抗鼠NeuN一抗（1∶400），4 ℃孵育過夜；PBS溶液搖床洗滌切片，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶800），常溫孵育60 min；PBS洗滌，滴加DAB顯色液，乙醇脫水干燥，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個不相鄰切片觀察、計數(shù)缺血半暗帶被染成棕褐色的神經(jīng)元數(shù)量，Image J2x軟件分析。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 取40 mg液氮保存腦組織，眼科剪剪碎，勻漿后移至離心管，RIPA裂解液提取蛋白，BCA試劑盒定量。取50 μg樣本與上樣緩沖液按比例混合，沸水浴5 min使蛋白變性，離心取上清，恒壓電泳后濕轉(zhuǎn)至膜上，封閉液封閉2 h，加入兔抗大鼠Bcl-2、Bax一抗（1∶400），4 ℃搖床孵育過夜，等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000），室溫孵育120 min，TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色劑顯色、曝光，以Bcl-2、Bax/內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）灰度值表示蛋白相對表達(dá)量，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。重復(fù)3次取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及分析，以表示計量資料，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)，組間多樣本資料的檢驗(yàn)方式為單因素方差分析，再以LSD-t行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評價 與腦梗死組比較，建模后1、3 d腦梗死過表達(dá)組Zea-longa神經(jīng)功能評分降低，腦梗死低表達(dá)組升高（P＜0.05）；腦梗死組、腦梗死NC組Zea-longa神經(jīng)功能評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；腦梗死組、腦梗死過表達(dá)組、腦梗死低表達(dá)組、腦梗死NC組建模后3 d Zea-longa神經(jīng)功能評分均低于建模后1 d（P＜0.05）。見表1。

表1 各組腦梗死大鼠神經(jīng)功能評分比較/（分，）

表1 各組腦梗死大鼠神經(jīng)功能評分比較/（分，）

注：①與腦梗死組比較，P＜0.05。②與腦梗死過表達(dá)組比較，P＜0.05。③與腦梗死低表達(dá)組比較，P＜0.05。④與同組建模后1 d比較，P＜0.05。

建模后3 d 1.72±0.19④0.82±0.09①④2.36±0.21①②④1.65±0.17①②③④108.97＜0.001組別腦梗死組腦梗死過表達(dá)組腦梗死低表達(dá)組腦梗死NC組F值P值鼠數(shù)8 8 8 8建模后1 d 2.06±0.25 0.98±0.11①2.71±0.24①②1.94±0.21①②③92.43＜0.001

2.2 腦組織miR-24表達(dá) 健康組、腦梗死組、腦梗死過表達(dá)組、腦梗死低表達(dá)組、腦梗死NC組腦組織miR-24 mRNA相對表達(dá)量分別為0.56±0.12、0.21±0.03、1.38±0.26、0.06±0.01、0.22±0.04（F=133.94，P＜0.001）；與健康組比較，腦梗死組腦組織miR-24 mRNA表達(dá)降低（LSD-t=8.00，P＜0.001）；與腦梗死組比較，腦梗死過表達(dá)組腦組織miR-24 mRNA表達(dá)升高（LSD-t=12.64，P＜0.001），腦梗死低表達(dá)組miR-24 mRNA表達(dá)降低（LSD-t=13.42，P＜0.001）；腦梗死組、腦梗死NC組miR-24 mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（LSD-t=0.57，P=0.581）。

2.3 腦梗死體積 腦梗死組、腦梗死過表達(dá)組、腦梗死低表達(dá)組、腦梗死NC組腦梗死體積分別為（40.31±5.30）mm3、（21.25±4.93）mm3、（50.56±6.14）mm3、（41.04±4.62）mm3（F=43.32，P＜0.001）；與腦梗死組比較，腦梗死過表達(dá)組腦梗死體積縮?。↙SD-t=5.89，P＜0.001），腦梗死低表達(dá)組腦梗死體積增大（LSD-t=2.83，P=0.022）；腦梗死組、腦梗死NC組腦梗死統(tǒng)計比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（LSD-t=0.23，P=0.822）。

2.4 腦梗死皮質(zhì)區(qū)存活神經(jīng)元密度 健康組、腦梗死組、腦梗死過表達(dá)組、腦梗死低表達(dá)組、腦梗死NC組腦梗死皮質(zhì)區(qū)NeuN陽性表達(dá)神經(jīng)元數(shù)目分別為（501.00±63.71）個/視野、（292.20±35.60）個/視野、（385.20±45.13）個/視野、（154.40±17.91）個/視野、（285.80±32.59）個/視野（F=75.82，P＜0.001）；與健康組比較，腦梗死組減少（LSD-t=5.61，P=0.001）；與腦梗死組比較，腦梗死過表達(dá)組增加（LSD-t=3.62，P=0.007），腦梗死低表達(dá)組減少（LSD-t=7.73，P＜0.001）；腦梗死組、腦梗死NC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（LSD-t=0.30，P=0.774）。

2.5 腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 與健康組比較，腦梗死組腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與腦梗死組比較，腦梗死過表達(dá)組腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)降低，腦梗死低表達(dá)組Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；腦梗死組、腦梗死NC組腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1，表2。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較/

表2 各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較/

注：Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白。①與健康組比較，P＜0.05。②與腦梗死組比較，P＜0.05。③與腦梗死過表達(dá)組比較，P＜0.05。④與腦梗死低表達(dá)組比較，P＜0.05。

Bax 0.10±0.01 0.52±0.06①0.36±0.04①②0.69±0.07①②③0.50±0.07①②③④64.34＜0.001組別健康組腦梗死組腦梗死過表達(dá)組腦梗死低表達(dá)組腦梗死NC組F值P值鼠數(shù)4 4 4 4 4 Bcl-2 0.74±0.08 0.13±0.02①0.54±0.07①②0.05±0.01①②③0.14±0.03①②③④144.17＜0.001

3 討論

ICI是由腦供血障礙引起的一種以嚴(yán)重意識障礙、感覺和運(yùn)動功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性疾病。研究表明，年齡、高血壓、高脂血癥、長期失眠、不良生活習(xí)慣、遺傳等均是ICI發(fā)生的危險因素［7-8］。越來越多的報道指出，miRNAs與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)功能關(guān)系密切，在大腦特異性表達(dá)功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，為ICI的基因治療提供了新的可能［9-11］。本課題組選擇與血脂代謝、高血壓、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管炎癥反應(yīng)均有明顯關(guān)聯(lián)的miR-24作為本研究的重點(diǎn)。

ICI發(fā)生后，在正常腦組織與缺血中心不可逆壞死區(qū)域之間，存在處于低灌注狀態(tài)、可觀察到典型細(xì)胞凋亡特征的缺血半暗帶。細(xì)胞過度凋亡是DNA損傷后細(xì)胞程序化死亡的晚期病理現(xiàn)象，隨著缺血半暗帶的縮小，神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性死亡及其所致的不可逆性損傷病灶持續(xù)擴(kuò)大，推測主要是通過細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的，且可能對最終腦梗死體積具有決定性作用。本研究結(jié)果顯示，miR-24過表達(dá)可降低Zea-longa神經(jīng)功能評分，縮小腦梗死體積，增加梗死皮質(zhì)區(qū)NeuN陽性表達(dá)神經(jīng)元數(shù)目，miR-24低表達(dá)則作用相反，提示miR-24對ICI大鼠具有腦保護(hù)及抗神經(jīng)元凋亡作用。miR-24廣泛表達(dá)于全身血管組織及心、肺、腦、肝等器官中，參與調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡，炎癥性疾病及腫瘤發(fā)生等過程。Sun等［12］研究顯示，缺氧將抑制SHR-SY5Y細(xì)胞中miR-24表達(dá)，采用miR-24模擬物干預(yù)后在缺氧條件下可抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖。此外，Jiang等［13］研究發(fā)現(xiàn)，miR-24可降低腦梗死大鼠血清血脂水平及腦梗死面積百分比，抑制腦組織細(xì)胞凋亡。結(jié)合本研究推測，miR-24在神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，且是缺血性腦病的潛在治療靶標(biāo)。

既往報道顯示，腦梗死后神經(jīng)元凋亡的主要途徑是線粒體損傷介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)［14-15］。Bcl-2、Bax分別是Bcl-2基因家族最重要的凋亡抑制、凋亡誘導(dǎo)基因。Bcl-2與Bax可形成異源二聚體，減少或阻斷釋放線粒體細(xì)胞色素C，從而抑制下游的凋亡級聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時，Bax二聚體解離為穩(wěn)定性更強(qiáng)的Bcl-2/Bax復(fù)合物，從而延長細(xì)胞生存周期。當(dāng)Bax高表達(dá)時，Bax二聚體數(shù)量明顯增加，刺激細(xì)胞凋亡。Liu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死外周血中Bax高于健康受試者，而Bcl-2低于健康受試者，經(jīng)溶栓治療后Bax降低，而Bcl-2升高，且與梗死面積密切相關(guān)，提示兩者參與該病發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，miR-24過表達(dá)可提高腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)量，減少Bax蛋白表達(dá)，miR-24低表達(dá)則相反，提示miR-24過表達(dá)對ICI的治療作用可能與調(diào)節(jié)腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，miR-24過表達(dá)可改善ICI大鼠神經(jīng)功能，縮小腦梗死體積，減少神經(jīng)元凋亡，可能通過調(diào)節(jié)腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。然而，miR-24生理功能是否受細(xì)胞中其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的調(diào)控，以及其對ICI的治療作用是否受劑量影響等，仍有待進(jìn)一步研究。