王綿綿 王振華 余二梅

（1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，福建 泉州 362000；2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，福建 泉州 362000）

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)顯示，作用于生命早期（組織可塑性生長(zhǎng)發(fā)育特異時(shí)間窗）的環(huán)境因素，明顯影響成年期慢性疾病發(fā)生的危險(xiǎn)。醫(yī)學(xué)界首先提出成年期疾病的“早”或“胎兒”起源假說(shuō)。該假說(shuō)認(rèn)為，環(huán)境因素（特別是營(yíng)養(yǎng)）作用于生命早期，可程序性控制成年期心血管與代謝性疾病的發(fā)生和早產(chǎn)兒死亡的風(fēng)險(xiǎn)。最近的研究表明，孕婦吸煙、產(chǎn)前尼古丁暴露可導(dǎo)致子代長(zhǎng)期持續(xù)性新陳代謝系統(tǒng)與心血管系統(tǒng)異常。尼古丁作為膽堿能受體激動(dòng)劑可以在心血管和內(nèi)分泌體內(nèi)平衡中扮演重要的角色。妊娠期間尼古丁暴露會(huì)導(dǎo)致許多胎兒?jiǎn)栴}，包括宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩和早產(chǎn)[1]。煙草中的尼古丁可透過(guò)胎盤(pán)，并優(yōu)先集中在胎兒，導(dǎo)致其在胎兒循環(huán)和羊水中的含量比孕婦更高[2]。循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（circulating endothelial progenitor cell，EPC）在EC細(xì)胞再生中起重要作用。EPCs全身輸注或內(nèi)在動(dòng)員可增強(qiáng)局部?jī)?nèi)皮剝脫后的修復(fù)，從而使血管再內(nèi)皮化。本研究旨在明確PNE對(duì)子代大鼠血管EPCs的影響，探討這些效應(yīng)是否存在潛在的性別依賴性差異，并進(jìn)一步明確這些效應(yīng)是否可持續(xù)作用至日后成年期。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠（清潔級(jí)，6周齡，體質(zhì)量150～200 g）20只，健康雄性SD大鼠（清潔級(jí)，6周齡，體質(zhì)量200～250 g）10只，總共30只（由上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 尼古丁購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PBS緩沖液購(gòu)自賽默飛世而生物化學(xué)制品有限公司，Rabbit Anti-CD133/PE antibody、Rabbit Anti-CD34/FITC antibody、Rabbit IgG（H+L）/PE conjugated、Rabbit IgG/FITC conjugated均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 模型的建立 將SD大鼠飼養(yǎng)于自然光照，空調(diào)控制溫度（20±2）℃，由吊扇及排氣扇通風(fēng)的飼養(yǎng)室中，自由攝取大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料（購(gòu)自福州吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）和清潔自來(lái)水。參考先前的報(bào)道建立大鼠產(chǎn)前尼古丁暴露（perinatal nicotine exposure，PNE）模型。將28周齡SD大鼠，按1∶1雌雄隨機(jī)合籠，用托盤(pán)法監(jiān)測(cè)陰栓，平均每12 h檢查1次，以發(fā)現(xiàn)陰栓記為妊娠第1天。將孕SD大鼠隨機(jī)分成兩組，PNE組10只，正常組10只。孕SD大鼠經(jīng)氯胺酮和賽拉嗪麻醉，于背部作一切口，將滲透微泵（2ML4型）植入切口后縫合。其中PNE組植入的1/2滲透微泵攜帶102 mg/mL尼古丁，另一半則為生理鹽水作為正常組，每日按6 mg/（kg·d）劑量率給予。每只孕鼠1個(gè)籠子。所有孕鼠自然分娩，仔鼠與母鼠籠養(yǎng)4周后，根據(jù)觀察肛門(mén)跟生殖器的距離以及乳頭突的有無(wú)，將雌雄子代分籠喂養(yǎng)。分別于子代1、3、4、6、12月齡時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)量數(shù)據(jù)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPCs數(shù)量

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的取血 分別于子代大鼠1、3、6、12月齡時(shí)給每只大鼠稱重，按0.3 mL/100 mg的劑量給予10%水合氯醛麻醉，將大鼠尾部拉起，待大鼠安靜時(shí)，快速?gòu)母骨蛔⑸?，必要時(shí)追加麻醉。待大鼠麻醉滿意后，將大鼠平放于手術(shù)器皿上，頭朝下，用備皮刀刮去大鼠右側(cè)頸部毛發(fā)，將1 mL注射管用生理鹽水稀釋的肝素鈉潤(rùn)洗，觸摸到大鼠頸部血管搏動(dòng)，在搏動(dòng)最明顯的三角處快速進(jìn)針，回抽形成負(fù)壓，緩慢退針，見(jiàn)回血后，保持位置，抽血至1 mL，拔掉針頭（因1 mL注射器針頭太細(xì)，直接打出來(lái)可能會(huì)破壞細(xì)胞），打開(kāi)血常規(guī)管的橡皮塞，將血液注入后快速蓋上橡皮塞，再往血常規(guī)管內(nèi)打入空氣，防止橡皮塞脫出；若未成功抽出血，于進(jìn)針處剪開(kāi)皮膚，探查頸靜脈，抽血。將血常規(guī)管放入裝有冰袋的泡沫盒內(nèi)，送至醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱內(nèi)，待檢。

1.4.2 測(cè)定EPCs數(shù)量 ①取樣：將血液樣本從4 ℃冰箱中取出，將血常規(guī)管放入離心機(jī)1 000 r/min，離心30 s，將管壁上的血液離到管底，再在震蕩機(jī)上震蕩10 s，取流式細(xì)胞管標(biāo)記空白、IgG、CD34、CD133、1～n PF。分別從1～n號(hào)管中取400 μL血樣于1～n號(hào)流式管中。②溶血：按1∶5比例加入紅細(xì)胞裂解液，分別于1～n號(hào)管中加入2 000 μL紅細(xì)胞裂解液，震蕩機(jī)上震蕩后避光反應(yīng)20 min，觀察溶血情況（以血液清澈透亮為優(yōu)），再放入CH80-2S臺(tái)式低速離心機(jī)中離心2 000 r/min，5 min，去上清液，再分別加入1 000 μL紅細(xì)胞裂解液，再震蕩機(jī)上震蕩后避光反應(yīng)10 min。③離心：將流式管配平后放入離心機(jī)離心（2 000 r/min，5 min），去上清（一次傾倒，至少保證100 μL剩余）。洗滌：分別于1～n號(hào)管中加入2 000 μL中性PBS液，震蕩（將沉在管底的細(xì)胞震勻）后放入離心機(jī)離心5 min，去上清；再分別加入2 000 μL中性PBS液，離心5 min，去上清；震蕩后再分別加入1 000 μL中性PBS液，離心5 min，去上清（反復(fù)洗2～3次）。④染色：為了保證細(xì)胞濃度，去上清液后不再加入PBS液，而是將去完上清的剩余樣本放入震蕩機(jī)上震勻。將4個(gè)抗體旋緊后放在小離心機(jī)上離心3 s，在IgG管中加入3 μL IgG-PE和3 μL IgG-FITC，在CD34管中加入3 μL CD34-FITC，在CD133管中加入3 μL CD133-PE，分別在1～n PF管中加入3 μL CD133-PE和3 μL CD34-FITC。分別從1～n號(hào)管中取100 μL血樣于1～n PE號(hào)流式管中。分別再1、2、3、4號(hào)管中加入100 μL中性PBS液，再?gòu)闹谐槿?00 μL樣品于空白管，IgG管，CD34管，CD133管。震蕩10 s，避光孵育30 min。上機(jī)：取出后加入200 μL生理鹽水，搖勻，放入離心機(jī)離心（2 000 r/min，5 min），去上清，再加入200 μL生理鹽水，搖勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（）表示。正態(tài)分布資料兩組間均值比較，采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料兩組間均值的比較采用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗(yàn)。采用一般線性模型的Univariate過(guò)程，進(jìn)行完全隨機(jī)分組析因設(shè)計(jì)的多因素方差分析，分析各因素的主效應(yīng)及交互作用。血管環(huán)內(nèi)皮功能的檢測(cè)則采用GraphPad Prism 5軟件中的Two-way ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)1月齡子代大鼠外周血EPCs數(shù)量 雌性子代外周血EPCs，PNE組較正常組顯著降低（P＜0.05），雄性子代，PNE組與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1A；PNE組，雌性子代較雄性子代顯著降低（P＜0.05），正常組，雌性子代與雄性子代差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1B。

圖1 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)1月齡子代大鼠外周血EPCs數(shù)量

2.2 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3月齡子代大鼠外周血EPCs數(shù)量 雌性子代，PNE組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），雄性子代，PNE組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2A；PNE組，雌性子代與雄性子代差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），正常組，雌性子代與雄性子代差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2B。

圖2 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3月齡子代大鼠外周血EPCs數(shù)量

2.3 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)6月齡子代大鼠外周血EPCs數(shù)量 雌性子代，PNE組較正常組顯著升高（P＜0.05），雄性子代，PNE組較正常組顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3A；PNE組，雌性子代較雄性子代顯著升高（P＞0.05），正常組，雌性子代與雄性子代差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3B。

圖3 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)6月齡子代大鼠外周血EPCs數(shù)量

2.4 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)12月齡子代大鼠外周血EPCs數(shù)量 雌性子代，PNE組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），雄性子代，PNE組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖4A；PNE組，雌性子代與雄性子代差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），正常組，雌性子代與雄性子代差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4B。

圖4 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)12月齡子代大鼠外周血EPCs數(shù)量

2.5 PNE、性別、年齡對(duì)EPCs數(shù)量變化的影響 PNE、性別、年齡對(duì)EPCs數(shù)量的變化有影響，且三者之間存在交互作用。見(jiàn)表1～3。

表1 性別對(duì)EPCs水平的影響

表2 PNE對(duì)EPCs水平的影響

3 討論

PNE可誘導(dǎo)子代內(nèi)皮功能病理生理改變，而內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)在NO的生物利用度減少和EC的進(jìn)行性丟失。對(duì)于EC的丟失，在生理?xiàng)l件下，可通過(guò)增加EC的更新對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)。另一方面，EPCs對(duì)EC的再生以及內(nèi)皮的損傷修復(fù)起重要作用。EPC水平已被提議作為血管內(nèi)皮功能障礙的重要的生物標(biāo)志物。然而，EPCs水平與血管內(nèi)皮功能障礙之間的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議[11]。EPCs是體內(nèi)的一種干細(xì)胞，其能分化為內(nèi)皮細(xì)胞，后者是新生血管的重要組成部分。本研究采用流式細(xì)胞儀對(duì)CD34、CD133雙染熒光標(biāo)記分離EPCs并對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果表明，PNE影響雌性子代EPCs的數(shù)量變化，而雄性子代無(wú)明顯變化，提示PNE可誘導(dǎo)EPCs水平的改變，該效應(yīng)存在性別差異，且持續(xù)作用至成年期。有動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素的患者其外周EPCs的數(shù)量顯著減少[3-4]。PNE可導(dǎo)致子代長(zhǎng)期持續(xù)性新陳代謝系統(tǒng)與心血管系統(tǒng)異常，誘導(dǎo)子代內(nèi)皮功能病理生理改變，且大量研究證實(shí)，EPCs對(duì)EC的再生以及內(nèi)皮的損傷修復(fù)起重要作用。EPC水平已被提議作為血管內(nèi)皮功能障礙的重要生物標(biāo)志物。EPCs可通過(guò)增殖分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的方式，使受損的血管再內(nèi)皮化，故EPCs具有防止動(dòng)脈粥樣硬化的作用[5-6]。由于EPCs具有強(qiáng)大的增殖能力，其數(shù)量能在一定程度上反映內(nèi)皮細(xì)胞的功能及其對(duì)血管修復(fù)的程度，從而在一定程度上利于血管存在危險(xiǎn)因素風(fēng)險(xiǎn)的分析以及對(duì)血管功能的評(píng)價(jià)。

到目前為止，國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)對(duì)PNE與EPCs的關(guān)系的研究資料，本研究發(fā)現(xiàn)EPCs的數(shù)量變化受很多因素的影響，通過(guò)單因素的方差分析可知，PNE、性別以及年齡均對(duì)其變化均有影響，且兩兩之間、三者之間均存在交互關(guān)系，提示PNE、性別以及年齡共同作用EPCs的數(shù)量變化。本研究對(duì)PNE的1、3、6、12月齡的子代大鼠進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在其他條件相同的情況下，年齡對(duì)EPCs數(shù)量的變化起作用。除了年齡的影響，還發(fā)現(xiàn)性別對(duì)EPCs數(shù)量也存在影響。近期的研究表明，EPCs在雌激素的作用下能對(duì)損傷血管進(jìn)行修復(fù)[7-8]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇不僅對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有調(diào)控作用，還可誘導(dǎo)外周血循環(huán)EPCs的數(shù)量增加，從而抑制受損血管的內(nèi)膜增厚[9]。通過(guò)以上研究可推測(cè)雌激素作用的血管修復(fù)可能是通過(guò)EPCs介導(dǎo)的。最近的研究發(fā)現(xiàn)，高血壓模型大鼠與正常對(duì)照組相比，骨髓EPCs的功能有所下降，另一方面用雌激素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相比，其EPCs的功能明顯增強(qiáng)[10-11]。用雌激素干預(yù)體外培養(yǎng)EPCs，分不同時(shí)間段，分不同溶度加入雌激素，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)EPCs的數(shù)量和功能呈時(shí)間依賴性差異以及溶度依賴性差異特征[12-13]。目前，雌激素對(duì)EPCs的生物學(xué)功能、動(dòng)員及改善的具體機(jī)制尚不清楚。而雌激素與EPCs的數(shù)量改變有關(guān)，但二者不符合線性關(guān)系[14-15]。

與雄性子代血管內(nèi)皮功能損傷相比，雌性子代的內(nèi)皮功能未損傷反而升高，考慮其原因可能是雌激素的保護(hù)作用。但雌激素是通過(guò)什么機(jī)制對(duì)血管內(nèi)皮功能進(jìn)行保護(hù)的尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在PNE的作用下，雌性子代的EPCs數(shù)量有升高，而雄性子代的EPCs的數(shù)量未見(jiàn)變化，結(jié)合之前的研究報(bào)道雌激素對(duì)EPCs有激動(dòng)作用，認(rèn)為雌激素可能通過(guò)刺激EPCs的動(dòng)員、增殖、促進(jìn)血管修復(fù)，從而使雌性子代的內(nèi)皮功能代償性升高，而雄性子代可能因?yàn)槿狈Υ萍に貙?duì)EPCs的激動(dòng)，EPCs數(shù)量沒(méi)有發(fā)生變化，從而使血管內(nèi)皮功能發(fā)生損傷。到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)PNE與EPCs的關(guān)系的研究資料非常少，雖然研究發(fā)現(xiàn)PNE、性別、年齡對(duì)EPCs數(shù)量的變化有影響，且這三者之間存在交互作用，但對(duì)其相互作用的機(jī)制尚不明確，需在以后的研究工作中一步深入探討。由于孕婦煙草暴露是最廣泛的產(chǎn)前損傷刺激之一[16-17]。因此，明確孕婦吸煙對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的影響，有助于進(jìn)一步揭示這種發(fā)生在子宮內(nèi)的程序性控制，導(dǎo)致子代出生后動(dòng)脈粥樣硬化疾病的病理現(xiàn)象，并有助于深入理解該現(xiàn)象潛在的病理生理機(jī)制，從而對(duì)優(yōu)生優(yōu)育及心血管疾病的防治具有重要的實(shí)際意義和理論價(jià)值。