蔡筱蕾 陳澤宇 劉新飛 郭 磊 陳煜杉 孫 娟 林 暉*

（福建醫(yī)科大學附屬福州市第一醫(yī)院消化內科，福建 福州 350000）

胰腺癌是一種消化系統(tǒng)中惡性程度較高的腫瘤，5年生存率低，致死率高，缺少早期診斷及有效的干預方法是主要原因[1]。光動力治療（photodynamic therapy，PDT）是一種消融方法，主要針對局部腫瘤治療，被認為是一種極具前景的胰腺癌治療方法[2]。PDT的療效受光敏劑、光源及組織內氧濃度影響，其中光敏劑是治療的核心[3-4]。5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）是目前在PDT領域發(fā)展最快的光敏劑，體內外研究表明5-ALA可用于包括胰腺癌在內多種腫瘤的PDT治療[5-7]。血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是一種抗氧化防御酶，廣泛存在于哺乳動物體內的，在應激狀態(tài)下可被誘導上調，具有抗炎、抗細胞凋亡和保護細胞等特性。近年來，HO-1被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織異常高表達，參與腫瘤血管生成、增殖、轉移、放化療耐藥等多種生物學事件[8-9]。HO-1同時也是一種限速酶，在降解游離血紅素過程中發(fā)揮重要作用，可將血紅素分解產(chǎn)生亞鐵離子、一氧化碳以及膽綠素，并且參與卟啉類代謝的分解代謝。相關研究顯示，應用HO-1抑制劑可增強放化療對于腫瘤細胞的殺傷作用[10-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)不同胰腺癌細胞對于5-ALA的敏感性不同，PANC-1細胞對5-ALA-PDT的敏感性低，且PANC-1細胞HO-1表達量相較其他胰腺癌細胞表達量高。推測應用HO-1抑制劑可能增強5-ALAPDT對于胰腺癌的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細胞株PANC-1由本實驗室提供。胎牛血清（sigma 公司）、DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）；HO-1抑制劑ZnPPⅨ（sigma公司）、內參GAPDH抗體以及二抗（Proteintech公司）。使用常規(guī)腫瘤細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)PANC-1，取對數(shù)生長期的細胞進行相應實驗。

1.2 CCK-8法檢測胰腺癌細胞的增殖能力 為證明PDT及鋅原卟啉Ⅸ（ZnPPⅨ）對胰腺癌細胞株PANC-1增殖能力的影響，實驗分為空白對照組、PDT組（5-ALA：5 mmol/L）、PDT+ZnPPⅨ組和ZnPPⅨ組（100 μmol/L）。將5×104個腫瘤細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞達50%融合度，各組給與相應處理后再培養(yǎng)24、36、48 h。棄去上清，每孔加入10 μL CCK-8檢測液。在細胞培養(yǎng)箱內孵育30 min，使用酶標儀檢測各孔吸光度值。計算增殖率=[1-（對照孔-實驗孔）/（對照孔-空白孔）]×100%。

1.3 Western blot檢測胰腺癌細胞相關蛋白的表達 將按1.2分組干預后24 h胰腺癌細胞消化離心，提取細胞總蛋白。采用BCA法進行各組總蛋白濃度測定。取20 μL總蛋白樣品分組加入SDS-PAGE膠中，80 V電泳2 h，后300 mA轉膜100 min。脫脂奶粉+TBST搖床封閉2 h，洗膜3次，加入HO-1抗體（1∶500）以及GAPDH抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日，洗膜后加入相應二抗（1∶1 000）搖床孵育2 h。洗膜后，使用ECL超敏發(fā)光液發(fā)光顯影。

1.4 Real-time PCR檢測相關蛋白mRNA的表達變化 將1.2分組干預后24 h胰腺癌細胞，按照試劑盒操作說明提取各組細胞總RNA，并逆轉錄合成cDNA。反應條件：95 ℃預變性1 min后40個循環(huán)反應。實驗重復3 次，基因表達通過2-△△Ct法分析方法進行計算。引物：HO-1上游：CAGGCAGAGGGTGATAGAAGAGG；HO-1下游：CTGGGAGCGGGTGT。GAPDH上游：ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG；GAPDH下游：AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG。

1.5 胰腺癌裸鼠皮下成瘤 選取5周齡的BALB/c-nu裸鼠，配置胰腺癌PANC-1單細胞懸液，調整細胞數(shù)為107cells/mL。接種部位為小鼠的右前肢腋部，使用微量注射器，在距離接種點1～1.5 cm的位置進針注射細胞懸液0.1 mL。胰腺癌裸鼠皮下成瘤模型構建后第7天進行分組，分組同1.2，并給予瘤體內注射，每只30 μL，給藥劑量分別為5-ALA 5 mmol/L，ZnPPⅨ組100 μmol/L。注射后避光1 h。PDT組及PDT+ZnPPⅨ組給與PDT激光治療機的激光照射0.5 h。后觀察皮下瘤生長情況，干預后第21天測量腫瘤質量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HO-1抑制劑ZnPⅨ增強5-ALA-PDT對PANC-1細胞的抑制作用 CCK8檢測結果顯示，24、36、48 h時間點與對照組相比較，PDT處理后的PANC-1細胞增殖均受抑制（P＜0.05，見圖1）。而PDT+ZnPPⅨ組能更加顯著地抑制胰腺癌細胞PANC-1的增殖能力，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖1）；與空白對照組比較，ZnPPⅨ組細胞在增殖能力上有差異，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖1）。

圖1 HO-1 抑制劑ZnPPⅨ對胰腺癌細胞PDT敏感性的影響

2.2 各組胰腺癌細胞HO-1蛋白及mRNA表達情況 利用Western blot和Real-time PCR技術分別檢測各組胰腺癌細胞中HO-1蛋白及其mRNA的表達情況。結果顯示，與空白對照組相比較，PDT組胰腺癌細胞PANC-1中HO-1的表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖2）。而ZnPPⅨ組HO-1蛋白及mRNA的表達明顯抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖2）。PDT+ZnPPⅨ聯(lián)合治療組中HO-1的表達量相較PDT組以及空白對照組均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖2）。

圖2 PDT及ZnPPⅨ對胰腺癌細胞HO-1表達的影響

2.3 胰腺癌裸鼠皮下種植瘤模型及給予相應干預的結果 PDT可抑制裸鼠皮下種植瘤的生長，聯(lián)合ZnPPⅨ可增強抑制作用。構建胰腺癌裸鼠皮下種植瘤模型，并給與相應干預結果顯示，空白對照組、PDT組、PDT+ZnPPⅨ組以及ZnPPⅨ組的平均瘤重分別為592.83 mg、585.14 mg、260.71 mg以及404.32 mg。PDT相較于空白對照組可抑制胰腺癌種植瘤的生長，而PDT+ZnPPⅨ組相較PDT組抑制增長更顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖3）。

圖3 ZnPPⅨ對裸鼠胰腺癌皮下種植瘤PDT敏感性的影響

3 討論

HO-1是HO家族的一員，在血紅素分解代謝過程中起關鍵限速酶作用，在胃癌、胰腺癌等多腫瘤組織中表達升高，且在眾多腫瘤的增殖、血管形成、侵襲以及轉移過程中均有一定作用。因此，相關研究認為許多惡性腫瘤的進展與HO-1有關[12-13]。較早的國外研究已發(fā)現(xiàn)，抑制HO-1或直接干擾HO-1的代謝產(chǎn)物（如亞鐵離子以及膽綠素）可以增加胰腺癌對于化療的敏感性[14]。表明HO-1在胰腺癌的增殖、轉移以及治療耐藥方面均有一定作用。本研究通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，HO-1蛋白對胰腺癌細胞PANC-1的增殖具有一定的促進作用。而HO-1的抑制劑ZnPPⅨ的使用可明顯抑制胰腺癌細胞PANC-1的增殖。光動力治療屬于新型的胰腺癌治療方法。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，不同的胰腺癌對PDT的敏感性不同。而HO-1可能影響到胰腺癌細胞對PDT的敏感性。

在本實驗中，從細胞學體外實驗和裸鼠體內實驗兩個層面對以下問題進行探討。其一，探討HO-1及其抑制劑ZnPPⅨ對胰腺癌細胞株PANC-1在5-ALA介導的光動力治療后效果的影響；其二，明確5-ALA介導的光動力治療是否對HO-1的表達產(chǎn)生影響，結果發(fā)現(xiàn)HO-1抑制劑ZnPⅨ可以增強由5-ALA介導的光動力治療對胰腺癌細胞PANC-1的殺傷作用，并且體外實驗證實5-ALA介導的光動力治療可以促進HO-1在胰腺癌細胞PANC-1的表達。而使用ZnPPⅨ可明顯逆轉上述促進作用，表明ZnPPⅨ可能通過增加胰腺癌細胞PANC-1對于5-ALA的敏感性，從而增強胰腺癌光動力治療的最終效果。在體內實驗方面，本次研究成功構建了裸鼠皮下胰腺癌種植瘤模型。并且對不同分組的裸鼠分別應用相應干預措施，結果顯示PDT+ZnPPⅨ聯(lián)合治療可以顯著抑制胰腺癌皮下種植瘤的生長能力，進一步驗證了體外研究的相關結論。

由5-ALA介導的胰腺癌光動力治療過程中的相關機制尚未完全明確。對于最終胰腺癌光動力治療效果產(chǎn)生影響的因素眾多。其中光敏劑就十分重要，其種類、劑量、給藥途徑以及給藥方式等都能對于最終效果產(chǎn)生影響。因此，應用5-ALA這單一的光敏劑模擬胰腺癌光動力治療過程是有一定的局限性。本研究主要目的是探討ZnPPⅨ這一HO-1抑制劑對光動力治療是否有增敏作用，故應用單一光敏劑5-ALA進行實驗。在后期的研究過程中，需進一步改進胰腺癌體內模型，爭取模擬出理想的體內胰腺癌模型。同時，進一步在細胞學研究中明確HO-1影響胰腺癌細胞對于5-ALA的敏感性的具體機制。